Summary
אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התא. Assay מניב שיעורי פעילות תיקון דנ"א מקובל ניתוח הקינטית ניתנת להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates הגידול או עם חלבונים מטוהרים.
Abstract
אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התאים באמצעות כריתה בסיס תיקון (BER) אלומות מולקולריות. המצע (משואה) מורכב deoxyoligonucleotide המכיל הנגע בסיס יחיד עם 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) מחצית מצומדות כדי 5'end ואת מחצית Dabcyl מצומדות עד הסוף '3 של oligonucleotide. משואת מולקולרית BER בן 43 בסיסים באורך רצף נועד לקדם את הקמתה של מבנה גזע לולאה עם 13 נוקלאוטידים לולאה ו -15 זוגות בסיסים ב 1,2 גזע. כאשר מקופל בתצורה זו מחצית 6-FAM הוא הרווה ידי Dabcyl באופן לא ניאון באמצעות העברת אנרגיה פורסטר תהודה (סריג) 3,4. הנגע ממוקם כך בסיס הבאה הנגע הסרת scission גדיל oligonucleotide הנותרים 5 בסיס המכיל מחצית 6-FAM משתחרר מן הגבעול. לשחררND ניתוק מן (Dabcyl) תוצאות quencher לעלייה של הקרינה, כי הוא מידתי לרמת תיקון ה-DNA. על ידי איסוף מספר רב של קורא של ערכי הקרינה, בזמן אמת, הערכת הפעילות BER אפשרי. השימוש תקן כמותי בזמן אמת PCR מכשירים בו זמנית מאפשר ניתוח של דוגמאות רבות. העיצוב של אלה משואות BER מולקולרית, עם הנגע בסיס אחד, הוא מקובל ניתוחים הקינטית, כימות בער אימות מעכב והוא להתאמה עבור כימות של פעילות ה-DNA תיקון רקמות lysates תאים סרטניים או עם חלבונים מטוהרים. ניתוח של פעילות BER ב lysates הגידול או רקמות באמצעות aspirates אלה משואות מולקולרית עשויות לחול על מדידות סמן תפקודית. יתר על כן, ניתוח של פעילות BER עם חלבונים מטוהרים באמצעות זה assay כמותי מספק מהירה, תפוקה גבוהה השיטה על גילוי ואימות של מעכבי בר.
Protocol
1. ביקון מולקולרית עיצוב
1.1 תכנון והזמנת המשואה מולקולרית שלך
העיצוב של המשואה מולקולרית שלך חייב לשקול את הדברים הבאים:
- יש לנו תוצאות טובות עם 43-Mer oligonucleotides DNA. תוכן GC צריך להיות> 32%. תכלול בסיס G בסוף "5.
- בקשה 6-FAM (6-Carboxyfluorescein) הצמידה על "סוף Dabcyl כמו 3 '5 שינוי.
- המיקום של הנגע צריך להיות על בסיס # 6 מסוף '5.
- אורכו של הגבעול או דופלקס סיכת ראש צריך להיות מינימום של 15 נ"ב.
- אורך הלולאה המומלץ הוא 13 בסיסים.
- המבנה הכללי של המשואה הוא כפי שמוצג באיור 1.
- לאחר רצף פגיעה מסוג יוחלט, oligonucleotide ניתן להזמין מחברות oligonucleotide ביותר. אנחנו מזמינים oligonucleotides שלנו IDT ולבקש oligonucleotides הם HPLC מטוהרים providאד כאבקה או בתבנית יבשים.
1.2 חישול המשואה מולקולרית שלך
- ממיסים oligonucleotides דנ"א lyophilized במאגר דילול Oligo (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) לתת צילומים מרוכז מולקולרית ביקון פתרון של 40 מיקרומטר.
- הכן פתרון 200nm ביקון מולקולרית עובד מ 40 מיקרומטר מולקולרית פתרון המניות ביקון באמצעות חיץ התגובה BER (ראה להלן). מוסיפים את 200 Beacon מולקולרית nM פתרון פועלים צינור מ"ל סטרילי 1.5 שחור.
- דגירה צינור המכיל 200 Beacon מולקולרית nM הפתרון עובד כוס גדולה של מים רותחים למשך 3 דקות.
- לאחר 3 דקות, להסיר את הגביע ממקור חום דגירה את משואות מולקולרית במים למשך הלילה כדי לקדם חישול. השתמש חום חומרי בידוד הן מעל ומתחת הגביע כדי להאט את תהליך הקירור.
- Aliquot משואות לתוך סטריליות, 1.5 צינורות שחורים מ"ל, 100 μL על צינור אחד.
- חנות ב -30 ° C.
1.3 איכות הערכת המשואה מולקולרית שלך
- לבצע ניתוח עקומת להמיס כדי לאשר את משואות BER מולקולרית לא לזרוח עד סוער, כדי לקבוע את טמפרטורת ההתכה אופטימלית וכדי לוודא כי המשואה זה יהיה לזרוח כאשר מחומם.
- עבור המשואה כל הרחבה של הפתרון המוצע נפח 200 ננומטר ביקון מולקולרית עובד והתגובה חיץ בר, כמצוין בטבלה 1, עד 6 בארות של צלחת Fast 96-אופטי (גם יישומי Biosystems, חתול # 4346906).
- להשתמש במכשיר בזמן אמת PCR כגון מערכת (Applied Biosystems) StepOnePlus או דומה כדי לפקח על FAM, צבע עירור במהלך ניתוח עקומת להמיס.
- התוכנית המכשיר בזמן אמת שלך PCR (מערכת StepOnePlus) כדי לפקח על עירור FAM צבע כפונקציה של הטמפרטורה הגדלת במרווחים קטנים לצורך ניתוח עקומת להמיס. מערכת StepOnePlus מתוכנת למדוד FAM לזרוחNCE ואת הרמפה בין 25 ° C עד 95 ° C ב 0.5 מעלות צלזיוס במרווחים. עקומת להמיס טיפוסית מוצג באיור 2.
- הקרינה רקע מועט, אם בכלל צריך להיות גלוי בטמפרטורות מתחת 50 ° C. בדוק גידול אחיד חדה הקרינה, מעיד על משואות איכות טהורה גבוהה. ערכים בלעג הקולני סביב 60 ° C עד 80 ° C נוחים וצריכים להיות שווים על כל דילולים.
- לקבוע T מקס, הטמפרטורה מקסימלי הקרינה [שלו מדור (מקס)] ערכים, מניתוח זה. המידתיות של ערכי הקרינה ב T מ 'או T מקס לכניסת המשואה (הריכוז) צריך להיות ליניארי. ערך הקרינה ב-T מקס, פלורידה (מקסימום), יעלה על הערכים רקע על 37 מעלות צלזיוס לפחות פי 5.
2. Lysate גרעינית הכנה
2.1 כריתת מאגר תיקון התגובה חיץ 5 הכנה
- הוסף את כל המרכיבים המפורטיםבטבלה 2 ולהביא את נפח המאגר ל 900 מ"ל עם DDH 2 א '
- התאם את ה-pH 7.8 ל 8.0 באמצעות אשלגן הידרוקסידי N (Sigma, חתול # 17-8).
- להביא את נפח המאגר מ"ל 1000 באמצעות DDH 2 א '
- סנן חיץ 0.22 מיקרומטר באמצעות מסנן, Nalgene 1 ליטר המסנן (החתול # 167-0020).
- הוסף Dithiothreitol (DTT) מיד לפני השימוש מאגר התגובה BER.
2.2 Cell תרבות בידוד תא
- מומלץ לתאים והתרבות עד confluent 90-100%. לבודד תאים 4-6 מנות (150 מ"מ) כדי להשיג lysate גרעינית מספקת סט מלא של ניתוח (כ 5 x 10 -7 תאים בסך הכל).
- מומלץ להכין 3 תרבויות עצמאיות עבור 3 כדורי תאים עצמאיים להשיג הביולוגי משכפל עבור כל ניתוח.
- Lysates גרעיניים מוכנים בקלות באמצעות בידוד NucBuster ההליך (EMD Bioscience חתול Calbiochem # 71183-3) although כל פרוטוקול בידוד גרעיני יהיה מתאים (ראה להלן, סעיף 2.3.).
2.3 lysate גרעיני הכנה
- לפני שמתחילים, פרוטאז lyophilized אינהיביטור קוקטייל (Calbiochem, חתול # 539131, קבע 1) הוא 1 שוב הושעו במים סטריליים 100 μl להכין מלאי 100x. להשתמש מיד או להקפיא ב aliquots ב -20 ° C לאחסון ארוך טווח. חישוב 1 μl מלאי 100x עבור כל 10 7 תאים חילוץ, לפי הצורך.
- צעדים במהלך כל הליך החילוץ יש לבצע על הקרח או על 4 מעלות צלזיוס על מנת להבטיח יציבות החלבון.
- 15 מ"ל תווית פלקון צינורות ומניחים על הקרח.
- הסר מדיה הגדילה מתאי ולשטוף פעמיים עם 7.5 מ"ל של קר PBS.
- הוסף 5 מ"ל של קר PBS לצלחת כל התאים שריטות מהצלחת באמצעות מרים התא. העברת התאים צינור מקורר 15 מ"ל פלקון.
- צנטריפוגה במהירות נמוכה (500X גרם, 4 ° C) במשך 5 דקות. הסר את supernatantו לאמוד את היקף התא מלא בהשוואה. (עד 250 μl נפח תא ארז יכול להיות מעובד בצינור 1.5 אחת מ"ל)
- צנטריפוגה דקה 1 אחר ב 500X גרם ולהסיר PBS הנותרים עם טפטפת. Resuspend תא גלולה ב מגיב הפקת NucBuster 1 לפי גודל נפח תא ארוז: 150 NucBuster μl הפקת מגיב 1 לכל 50 μl נפח תא צפוף. (לחלופין, התא גלולה יכול להיות מהיר קפוא על קרח יבש או חנקן נוזלי ומאוחסנים ב -80 ° C עד מוכן להמשיך).
- לאחר ההשעיה מחדש, להעביר lysate לצינור 1.5 מראש צונן מ"ל.
- המערבולת 15 שניות במהירות גבוהה, דגירה על קרח למשך 5 דקות, במערבולת שוב 15 שניות במהירות גבוהה.
- סרכזת ב XG 13,000 במשך 5 דקות על 4 ° C.
- Supernatant מכיל חלק cytoplasmic. הסר ולאחסן ב -80 ° C או לבטל.
- מחדש להשעות גלולה בתערובת של μl 1 מחדש על תנאי קוקטייל פרוטאז 100x מעכב, 1 & MU, L של DTT 100 מ"מ ו 75 NucBuster μl הפקת מגיב 2 לכל נפח התא μl 50 מלא מפה לפה.
- המערבולת 15 שניות במהירות גבוהה, דגירה על קרח למשך 5 דקות, במערבולת שוב 15 שניות במהירות גבוהה.
- סרכזת ב XG 13,000 במשך 5 דקות על 4 ° C. Supernatant מכיל חלבונים גרעיניים. איסוף supernatant ולהמשיך לשלב הבא.
2.4 דיאליזה, כימות חלבון aliquoting
- צעדים במהלך כל הליך דיאליזה יש לבצע עם מראש מצוננים פתרונות, חומרים וציוד על מנת להבטיח איכות התמצית.
- הכינו מאגר דיאליזה (1 L הנדרש לדגימה) כמפורט בטבלה 3. חשוב: מאגר צריך להיות קר (4 מעלות צלזיוס). מומלץ להכין לפחות יום קודם לכן. מאגר דיאליזה מסוננים ניתן לאחסן 4 ° C ללא הגבלת זמן אם DTT לא נמחקה.
- לפני צינה (2 כוסות של 1 כוסות וסעד לפי המדגם), מאגר דיאליזה, חדרי דיאליזה, מיקרו צנטריפוגותצינורות, מזרקים ומחטים.
- ממש לפני השימוש - להוסיף 1 מ"ל 1 M DTT לליטר מאגר דיאליזה.
- Dialyze lysate מוכן בשלב 2.3 ב 0.5 חיץ מראש צונן L דיאליזה במשך 90 דקות 4 ° C עם ערבוב עדין באמצעות Slide-A-Lyzer פירס קלטת דיאליזה (0.5-3 מ"ל דיאליזה קלטות עם הפסקת MW 7000).
- העברת קלטת דיאליזה כדי מבחנה 2 המכיל 0.5 מראש צונן L חיץ דיאליזה dialyze lysate למשך 90 דקות 4 ° C עם ערבוב עדין.
- איסוף פתרון dialyzed חלבון גרעינית קלטת דיאליזה באמצעות מזרק (פישר, החתול # 309659). השתמש אטם שונה השתמשו בעבר כדי להזריק את החלבון לתוך קלטת דיאליזה. שים לב, תמצית אולי מגובשת בשל ריכוזי חלבון גבוהה. נסו לכלול גבישים מחפש מעוננים בעת הסרת פתרון dialyzed חלבון גרעיני.
- Aliquot מדגם מיקרו צנטריפוגות, מבחנות μl 20 כל אחד. הקפאה מהירה על הקרח stor יבשדואר ב -80 ° C עד השימוש.
- קבע את הריכוז של חלבון dialyzed באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. דוגמאות צפויים ריכוזים lysate גרעיני מוצגים בלוח 4.
- לבסוף, lysates יש להעריך על בקרת איכות. הערכת lysates את תשתנה בהתאם הניסוי. כפי שתואר קודם לכן, אנו שגרתי לנתח lysates לביטוי של חלבונים באמצעות BER מספר 1,2 immunoblot.
- צעד דיאליזה משמש ליצירת פתרון תגובה אחידה על פני שורות תאים על מנת להקל בהשוואה. השמטת צעד דיאליזה עשוי להשפיע על שיעורי אנזימטיות וניתוח קינטית מאז הפתרונות מלח ותנאי התגובה זהה כבר לא שורות תאים ותכשירים שונים בשל דילולים שונים הנדרשים. עם זאת, אנו רואים כי באמצעות lysates מיקרוגרם של יותר מ 5 / μl והוספת חיץ תגובה מספקת מאפשר מחדל של צעד דיאליזה (מידע לא מוצג). עבור ה מעכב מחקריםב אינם דורשים השוואה בין lysates תאים שונים, דיאליזה לא ייתכן שתידרש. עם זאת, מומלץ דיאליזה כמצוין.
3. ביקון מולקולרית Assay
3.1 ציוד דרישות
- כמותי בזמן אמת למכשיר ה-PCR, כגון StepOnePlus qRT-PCR או דומה, או 96-fluorometer גם צלחת מסוגל לזהות ולמדוד FAM הקרינה בזמן אמת. הערה: הליך זה חל על כל מחשב מסוגל לקרוא את ערכי הקרינה של משואות ולהקליט אותם בזמן אמת. מכונת צריך, עם זאת, לאפשר למשתמש לגשת ערכי הקרינה גלם לניתוח נתונים.
- סרכזת תואם qRT-PCR צינורות אופטיים או צלחות בשימוש.
- Microsoft Excel לניתוח נתונים שנאספו.
3.2 Buffers ריאגנטים
- אופטיים qRT-PCR צינורות או צלחות עם מכסה תואם.
- BER חיץ התגובה (ראהבוב ואת טבלה 2).
- חלבון גרעיני Dialyzed תמציות מוכנות כמו שלבים 2.3 ו -2.4 ו מדולל ל 2 מיקרוגרם / חלבון μL עם חיץ התגובה BER המכילה DTT.
- משואות מולקולרית מדולל ל -200 מיקרומטר עם חיץ התגובה BER ליצור פתרון משואות מולקולרית העבודה (ראה לעיל).
3.3 Assay הגדרת (לוח 5)
- מכונת qRT-PCR אינו משמש בדרך כלל כמו fluorimeter כך את שיטת הריצה יש לשנות.
- התוכנית בשלב הראשון להגדיר את הטמפרטורה תגובה 37 ° C עם זמן מחזור (נקודות זמן על מדידות) של 20 שניות עם מינימום של 180 מחזורי (או יותר, בהתאם לעיצוב assay תיקון). הקפד לגבות נתונים במהלך המחזורים. לכן, המכשיר יהיה לאסוף נתונים כל 20 שניות עבור סכום כולל של 1 שעה.
- צור השלב השני כי רמפות את הטמפרטורה ל Tmax של המשואה בפרט, את הטמפרטורה עם הקרינה מקסימלית, כפי להרתיעממוקש בשלב 1.3 (הערכת איכות המשואה מולקולרית שלך). זמן המחזור אמור שוב להיות 20 שניות עם סך של 15 מחזורים. זה יהיה לאסוף נתונים כל 20 שניות למשך 5 דקות הקרינה המקסימלי האפשרי של המשואה. ערכי הקרינה שנמדדו במהלך מחזורים Tmax משמש לנרמל את ערכי הקרינה גם בתוך כל שלב (4.2a). אם באמצעות משואות שונים לוודא לכלול צעדים המספקים ערכים דומים החוזרים על עצמם עבור Tmax של משואות אלה גם כן.
- להגדיר את עוצמת התגובה μL 25.
- הגדרת העיצוב הצלחת על מכונת qRT-PCR באמצעות תוכנת Biosystems של יישומי. אנו מעוניינים רק את ערכי הקרינה גלם, כך בחר "Curve התקן" - סוג הניסוי.
- להשלים את פריסת צלחת. למשל מוצג בלוח 5. אל תוסיף שום דבר הבארות נבחרות כמו עקומת סטנדרטי.
3.4 הפעלה assay
- שדortant: שימוש בחומרי מראש צונן פתרונות. לשמור על קור רוח עד לטווח זיהוי.
- הוספת כמות מתאימה של DTT למאגר BER תגובה לשמש.
- לדלל פתרון חלבון בריכוז של 2 מיקרוגרם / μL באמצעות תגובה BER חיץ (עם DTT).
- עבור הניסויים הראשוניים אנו ממליצים להשתמש 10 מיקרוגרם של lysate גרעינית dialyzed לכל טוב (5 μL / טוב) ו 1 pmole המצע, משואת מולקולרית בריכוז הסופי 40 ננומטר (5 μL / טוב). השגנו באופן עקבי באיכות גבוהה ותוצאות לשחזור עם 10 מיקרוגרם של lysate התא, אם כי ייתכן lysates תאים שונים או מצעים המשואה יכול להכתיב ריכוז חלבון גבוה יותר או נמוך יותר.
- הרכיבים assay בכל טוב הם 15 BER μL התגובה חיץ, 5 המשואה μL ו 5 lysate גרעינית μL. הפעל כל שילוב מגדלור / lysate בשלושה עותקים.
- בקרות שליליות כמה נדרשים עבור כל משואת, כולל דוגמאות ללא המשואה כגון 25 &MU, L מאגר התגובה BER בלבד, 20 BER μl התגובה חיץ עם lysate μl 5 ו 20 μL מאגר התגובה BER עם μL 5 של המשואה ללא lysate.
- דגימות בקרת מספר נדרשים עבור lysate כל גרעינית. אלה כוללים ביקורת שלילית [15 BER μL התגובה חיץ, 5 המשואה השליטה μL (ללא פגיעה) ו 5 lysate מדגם μL]. כמו כן, אנו ממליצים לכלול בקרות חיוביות ניסיוניים כגון הכללת THF הכולל אלומות המחקים באתר abasic המכיל oligos והם חתכו בקלות [15 BER μL התגובה חיץ, 5 μL המשואה THF ו 5 μL lysate המדגם]. כמובן, שליטה חיובית המדויק יהיה תלוי בעיצוב ניסיוני הכולל.
- כך, למשל, לעקוב אחר לוח 5 להלן פריסת צלחת.
- Pipet לתוך צינורות או צלחות אופטיים תוך על הקרח או לעמוד מקורר כדי למזער את התחלת התגובה לפני גילוי האות.
- BER Pipet התגובה הראשונה לתוך בארות בכל המאגר.
- משואות נ pipet על פי הפריסה את הצלחת לתוך בארות נכונים תמיד pipet lysates האחרון לתוך בארות כדי למזער את התחלת התגובה לפני גילוי האות.
- צינורות חותם או צלחת היטב, לערבב עם ספין צנטריפוגות לאסוף פתרונות לחלק התחתון של הצינורות או צלחת
- הכנס צלחת למכונת qRT-PCR ולהתחיל assay.
- לאחר סיום, לייצא נתונים גולמיים, רצוי בפורמט Excel. למערכת StepOnePlus רק רב המרכיבים את הנתונים הדרושים. זה מכיל את כל הערכים על הקרינה נפוצה קורא הממוינים לפי צבע לצבוע היטב.
4. ביקון מולקולרית Assay ניתוח
השתמשנו בתוכנה Microsoft Excel כדי לבצע ניתוחים אלה וחישובים. אנו ממליצים על הקמת תבניות ופקודות מאקרו שיאפשרו ניתוח קל ומהיר מציג גרף מבוסס על נתונים שמקורם פורמטים סטנדרטיים 96-כן.
4.1 הסרת רקע
">4.2 Fl (Tmax) נורמליזציה
כדי לטפל משונות pipetting זיהוי הקרינה בבארות שונים, אנו לנרמל את הנתונים לערכים הקרינה מקסימלית (ואשר תואמים קלט מגדלור).
- לחשב את ערכי הקרינה הממוצעת של מחזורי ב T מקס עבור הפרט גם: פלורידה (T מקס) (צעד 3.3aii).
- לחשב את יחס פלורידה (מחזור x) / פלורידה (T מקס) ומכפילים ב -100. בהנחה סביר פלורידה (T מקס) המתאים לערך המקסימלי הקרינה אפשרי כאשר חתכו באופן מלא, אלה נתונים נורמליים מייצגים% חינם FAM (= BER% המשואה חרוט).
- שלב את דגימות בשלושה עותקים על ידי ממוצעים של הנתונים (% חינם FAM) של 3 בארות עבור כל מחזור (עד מחזור 180) ולחשב שגיאות על כל אחד.
- חישוב הזמנים על ידי הכפלת 20 שניות על כל מחזור.
- מאז השונות גם אל היטב גילוי הקרינה יכול להיות משמעותי, אנו ממליצים להוסיף צבע פלואורסצנטי כגון רוקס למלאי המשואה מולקולרי המשמש רגילה מחדש להתאים את ערכי הקרינה של בארות בודדות. במקרה זה, צבע רוקס ישמש כסטנדרט פנימי (הפניה פסיבית) של כל אחת גם כן. רוקסעירור ופליטה ספקטרה (עירור - 588 ננומטר, 608 ננומטר פליטה) שונה מזה של צבע 6-FAM המועסקים assay (עירור - 495 ננומטר, פליטת - 520 ננומטר). צבע רוקס יאפשר צעד לנורמליזציה דומה להליכים המקובלים RT-PCR המאפשרת נורמליזציה של אמיד גם הבדלים העלולות להתעורר עקב ממצאים. אלה עשויים לנבוע pipetting שגיאות או עשוי לנבוע מן וריאציה גם אל היטב יעילות גילוי הקרינה.
4.3 מגרש
- לנורמליזציה העלילה נתוני הקרינה (% חינם FAM) נגד הזמן (שניות) בחלקה פיזור עם שגיאות המקביל.
- אנו ממליצים על ניתוח לתיקון קינטיקה של לפחות שלושה תכשירים שונים lysate גרעיני המייצגים משכפל ביולוגי. כדי להעריך שונות, בין הניסוי שגיאות שנמדדות את הממוצעים של כל ניסוי הפרט אמורה להיות מוצגת.
- ניתוח מייצג של שני lysates תאים סרטניים: LN428, gliomaתא בקנה אחד עם רמות לגילוי של מתיל purine DNA glycosylase (MPG) ו LN428/MPG, הקו אותו התא מהונדסים עבור ביטוי גבוה של MPG, שתי שורות תאים יש רמות מקבילות של AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. כל נבדקו לפעילות APE1 ופעילות MPG באמצעות THF BER מולקולרית ביקון (איור 3) ו Hx BER מולקולרית ביקון (איור 4), שם THF = tetrahydrofuran (המצע של APE1) ו Hx = hypoxanthine (המצע של ה-MPG) . הערה: באיור 3 (המצע THF), התוצאות של lysates LN428/MPG להראות הקרינה נמוכה מוחלטת לכל היותר, לעומת את LN428 lysates. זוהי תוצאה של ערך נמוך יותר משואה קלט כפי שנקבע באמצעות ערכים Tmax (ראה 3.3a). כאשר ערך זה נמוך שימש לנרמל את התוצאות, התוצאה היא שינוי גדול בעלילה. זה מדגים יפה את החשיבות של נרמול הנתונים. מתכננים את ערכי הקרינה מוחלטים לבד הייתי מציע repaשיעורי אינפרא אדום בין LN428 ותאי LN428/MPG שונים. עם זאת, כאשר הנתונים מנורמל לשקול את השתנות גם אל טוב, APE1 בתיווך שיעור ההבדל תיקון מוצג להיות מינימלית.
5. נציג תוצאות
אנו מתארים את שיטת מדידה כמותית בזמן אמת, של ה-DNA glycosylase ופעילויות איי פי endonuclease ב lysates גרעיני התאים באמצעות כריתה בסיס תיקון (BER) אלומות מולקולריות (איור 1). מרותק פעם, מומלץ לבצע ניתוח עקומת להמיס (טבלה 1) כאשר הערכת איכות המשואה מולקולרית שלך (איור 2). Lysates גרעיני אז יכול להיות מוכן, תוך שימוש ברכיבים חיץ המפורטים בטבלה 2. Dialyze lysate ב 0.5 חיץ מראש צונן L דיאליזה במשך 90 דקות 4 ° C עם ערבוב עדין באמצעות קלטת Slide-A-Lyzer פירס דיאליזה נגד המאגר דיאליזה המפורטים בטבלה 3. אוספיםפתרון dialyzed חלבון גרעינית קלטת דיאליזה באמצעות מזרק. השתמש אטם שונה השתמשו בעבר כדי להזריק את החלבון לתוך קלטת דיאליזה. קבע את הריכוז של חלבון dialyzed באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים. דוגמאות צפויים ריכוזים lysate גרעיני מוצגים בלוח 4. הפעל את התגובה כפי שצוין לעיל (שלב 3.4), באמצעות פריסת צלחת כפי שמוצג בטבלה 5. ניתוח מייצג של שני lysates תאים סרטניים: LN428, תא glioma בקנה אחד עם רמות לגילוי של מתיל purine DNA glycosylase (MPG) ו LN428/MPG, הקו אותו התא מהונדסים עבור ביטוי גבוה של MPG, שתי שורות תאים יש רמות מקבילות של AP endonuclease 1 (APE1) 1,2. כל נבדקו לפעילות APE1 ופעילות MPG באמצעות THF BER מולקולרית ביקון (איור 3) ו Hx BER מולקולרית ביקון (איור 4), שם THF = tetrahydrofuran (המצע של APE1) ו Hx = hypoxanthine(המצע של MPG). לבסוף, באמצעות דו BER / ביקון המולקולריים דיווחים על פעילות glycosylase אורציל, אנו מראים כי התפוקה האות או עוצמת האות מקסימאלית על 10μg של חלבונים פוחתת לרמה בלתי מורגשת על 0.62 מיקרוגרם של חלבון (איור 5).
באיור 1. המבנה הכללי של ביקון BER מולקולרית. שתופיע היא רצף העיצוב הכולל של משואות BER מולקולרית נעשה שימוש במסמך זה כמו מולקולה חד גדילי, לאחר חישול ושוב לאחר ההיתוך. מודגשים, נטוי חלק מרצף הוא גזע (15 בסיסים) לבין החלק המסומן בקו תחתון של הרצף הוא לולאה (13 בסיסים). FAM = צבע פלואורסצנטי '5 6 Carboxyfluorescein [על 5'end; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, מקדם הכחדה (260 ננומטר): 20,960; מקדם הכחדה (על ספיגת Max), 75000] ו Dabcyl = סוכן מרווה 3 "טובלים cyl [על 3'end; Abmax = 453 nm, מרווה טווח 425-520 ננומטר =] X = הנגע (משתנה בהתאם לשאלת המחקר) ו-Y = בסיס מול הנגע (משתנה בהתאם לשאלת המחקר). .
איור 2. ממיסים Curve. עקומת התכה נציג מוצג לבקרת BER מולקולרית ביקון (א '), ואת משואות BER מולקולרית המכילים מחצית (THF) tetrahydrofuran (ב) או מחצית (Hx) Hypoxanthine (C). ריכוזים oligonucleotide נע בין 0 nM (כחול כהה), 8 ננומטר (אדום), 16 ננומטר (ירוק), 32 ננומטר (סגול), 64 ננומטר עד 128 ננומטר כחול (כתום). כפי שמתואר בשלב 1.3, oligonucleotides את annealed היו מחוממים מ 25 ° C עד 95 ° C ב 0.5 מעלות צלזיוס ו מרווחי המערכת StepOnePlus מתוכנת למדוד FAM הקרינה על כל מרווח 0.5 ° C.
איור 3. הנתונים מייצגים באמצעות ביקון THF BER מולקולרית. פעילות AP endonuclease ספציפי הידרוליזה של אנלוגי באתר abasic tetrahydrofuran (THF) נמדד lysates גרעיני מקו הבקרה הסלולרי (LN428) ו-MPG יתר ביטוי קו תאים (LN428/MPG) . Lysate כל נותח באמצעות או בקרה ביקון מולקולרית BER (LN428, ירוק, LN428/MPG, סגול) או THF BER מולקולרית ביקון (LN428, כחול, LN428/MPG, אדום). התוצאות כפי שדווחו (א ') את יחידות מתכוון תגובה הקרינה ו (ב) אותם נתונים מנורמל לכניסה המשואה כמתואר בסעיף 4 לעיל (THF = tetrahydrofuran).
באיור 4. הנתונים מייצגים באמצעות Hx BER מולקולרית glycosylase ביקון פעילות ה-DNA ספציפי להסרת המצע MPG Hypoxanthine (Hx) נמדד lysates גרעיני מקו הבקרה הסלולרי (LN428) ו-MPG יתר ביטוי קו תאים (LN428/MPG). Lysate כל נותח באמצעות או בקרה ביקון מולקולרית BER (LN428, ירוק, LN428/MPG, סגול) או Hx BER מולקולרית ביקון (LN428, כחול, LN428/MPG, אדום). התוצאות כפי שדווחו (א ') את יחידות מתכוון תגובה הקרינה ו (ב) אותם נתונים מנורמל, כמתואר בסעיף 4 לעיל (Hx = hypoxanthine).
איור 5. הנתונים מייצגים באמצעות דו BER / ביקון מולקולרית ברמות חלבון ה-DNA שונים. Glycosylase (אונג) פעילות ספציפית להסרת אורציל (du /) נמדד lysates גרעיני מתאי T98G. Lysate T98G נותח באמצעות או בקרה ביקון מולקולרית BER או דו BER / ביקון מולקולרית, ברמות חלבון של 10, 5, 2.5, 1.25 או 0.62 מיקרוגרם, כפי שצוין Figure. התוצאות הם נתונים מנורמל, כמתואר בסעיף 4 לעיל.
| ריכוז של ביקון (ננומטר) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| ביקון פתרון מולקולרית העבודה (200nm) מוסף (μL) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER מאגר התגובה (W / O DTT) (μL) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
טבלה 1. מתווה הניסוי העקומה להמיס.
| 1 L סה"כ | היקף הפתרון במלאי הדרוש | קון. הפתרון של צילומים | קון האחרון. |
| HEPES-KOH | 25 מ"ל | 1M pH7.8 | 25 מ"מ </ Td> |
| KCl | 75 מ"ל | 2 מ ' | 150 מ"מ |
| EDTA | 1 מ"ל | 0.5m pH8.0 | 0.5 מ"מ |
| גליצרול | 10 מ"ל | N / A | 1% |
| DTT (להוסיף לפני השימוש) | 0.5 מ"ל | 1 M | 0.5 מ"מ |
| H 2 O | 888.5 מ"ל | N / A | N / A |
טבלה 2. BER חיץ התגובה.
| 1 L סה"כ | היקף הפתרון במלאי הדרוש | קון. הפתרון של צילומים | קון האחרון. |
| HEPES-KOH | 50 מ"ל | 1M pH7.5 | 50 מ"מ |
| KCl | 50 מ"ל | 2 מ ' | 100 מ"מ |
| EDTA | 1 מ"ל | 0.5m pH8.0 | 0.5 מ"מ |
| גליצרול | 200 מ"ל | N / A | 20% |
| DTT (להוסיף לפני השימוש) | 1 מ"ל | 1 M | 1 mM |
| H 2 O | 698 מ"ל | N / A | N / A |
לוח 3. דיאליזה המאגר.
| התא קו | ריכוז החלבון (מיקרוגרם / μL) |
| LN428 | 5.34 |
| LN428/MPG | 4.79 |
לוח 4. קביעת חלבון תוצאות.
| בקרה שלילית 25μL BER מאגר | (Control רקע) 20μL BER מאגר 5μL קון ביקון NO lysate | (מבחן בשלושה עותקים) <br /> 15μL BER מאגר 5μL קון ביקון 5μL LN428 lysate | (מבחן בשלושה עותקים) 15μL BER מאגר 5μL קון ביקון 5μL LN428/MPG lysate |
| בקרה שלילית 25μL BER מאגר | (Control רקע) 20μL BER מאגר 5μL THF ביקון NO lysate | (מבחן בשלושה עותקים) 15μL BER מאגר 5μL THF ביקון 5μL LN428 lysate | (מבחן בשלושה עותקים) 15μL BER מאגר 5μL THF ביקון 5μL LN428/MPG lysate |
| בקרה שלילית 20μL BER מאגר 5μL lysate | (Control רקע) 20μL BER מאגר 5μL Hx ביקון NO lysate | (מבחן בשלושה עותקים) 15μL BER מאגר 5μL Hx ביקון 5μL LN428 lysate | (מבחן בשלושה עותקים) 15μL BER מאגר 5μL Hx ביקון LN428/MPG 5μL קונגלהשביע |
| בקרה שלילית 20μL BER מאגר 5μL lysate |
לוח 5. ביקון Assay מולקולרית הגדרת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ישנם למעלה מ -600 אזכורים באמצעות "משואת מולקולרי" טווח לגילוי וכימות מולקולות רבות ופעילויות אנזימטיות, כולל פעילות helicase 6, DNA פולימרז פעילות 7,8, ה-DNA פעילות ligase 9, פעילות telomerase 10, פעילות ה-DNA ו-DNA photolyase 11 / RNA כלאיים 12, בין רבים אחרים. בנוסף לשימוש של אלומות מולקולריות למדידת פעילות של תיקון ה-DNA המפורטים לעיל, אנו ואחרים הראו את התועלת של בדיקות אלו לניתוח פעילות BER 1,2,13-15.
בזמן אמת פעילות BER assay שנתאר להלן, משלבת בסיס שונה יחיד ומאפשר הערכה כמותית של שיעורי BER עבור נגעים או שינויים שונים בבסיס השני הנגע. יישומים יכולים לנוע בין מחקרים מכניסטית מולקולריים מסכי מעכב. הפגנו סגוליות BER על ידי השוואת ליסהTES מ MPG להביע תאים שאינם מבטאים תאים וחוסר פעילות משואות שליטה. Assay רגיש ביותר, המאפשר זיהוי של פגמים בביטוי של MPG BER חלבונים 2 או XRCC1 1 ו מספיק כדי לזהות שינויים מזעריים, תיקון ה-DNA פרמטרים הקינטית את היעילות של מעכבי תיקון דנ"א [כתב היד בהכנה]. מספר קורא לאורך זמן תמיכה פעילה לתיקון חישוב שיעור הקינטית משמעות שינויים אלו שיעורי הקינטית. Assay המשואה מולקולרית BER ולכן מתאים תפוקה גבוהה מחקרים למסך עבור תיקון דנ"א מעכבי האנזים (מסכי מעכב) או מחקרים על תפקידו של רכיבים גרעיניים בודדים. ניתוח lysates גרעיני מאפשר הערכה של תיקון DNA בהקשר המלא של קומפלקס BER ומכאן גם המתארת שינויים עקיפים או השפעות על מכונות BER (למשל, לאחר תרגום שינויים או מוטציות).
הפרוטוקול, כפי שתואר, צריך להניב תוצאות לשעתקו מאוד כמותית. עם זאת, ישנם כמה פרטים שיש לקחת בחשבון על מנת להבטיח ניתוח נכון: (1) ערכים רקע של בקרות שליליות עלול להיות גבוה מדי: זה יכול להיות בגלל אחסון רע או ייצור של oligonucleotide. ערכים גבוהים של רקע lysates ללא אלומות הקרינה עולה אוטומטית בלבול (כלומר על ידי זיהום או ביטוי של חלבונים ניאון אקסוגניים). אם הביטוי של חלבון פלואורסצנטי היא בלתי נמנעת, ספקטרום עירור / פליטה עבור צבע הכתב חלבון פלואורסצנטי לא חופפים, (2) פלורידה (Tmax) הוא נמוך: ריכוז ה-DNA שונה נתון. יש לבדוק את ריכוז ה-DNA על ידי spectrophotometry (OD 260nm) למשל, באמצעות Nanodrop. ריכוז ה-DNA גבוה עם נמוך קומה (Tmax) מצביע על טעינה מספיקה FAM על משואות. טיהור HPLC מונע זיהום עם ה-DNA ללא שינוי (ראה לעיל), (3) הפעילות תיקון גרועה: אם (Tmax) ערכים שטוחיםהמחזורים האחרונים מצביעים על קלט המשואה מספיק גילוי הקרינה, זה עשוי להצביע על כך הכנת תמצית גרעיני נכשל. איכות תמצית גרעיני הוא קריטי. בטמפרטורות נמוכות יש להבטיח לאורך כל ההליך, כולל אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C ו (4) פעילות העיקולים ליזום תיקון עם ערכים גבוהים: אפילו חשיפה קצרה מאוד של הדגימות לטמפרטורת החדר לפני ניתוח יוזם התיקון. לשמור על קור רוח כל הזמן.
זה assay BER רגישות גבוהה וכמותית גם לגבי ניתוח של חלבונים מטוהרים, מה שמאפשר מחקרים על סגוליות המצע על ידי שינוי מולקולרי משואות בהתאם. לבסוף, assay ישים לניתוח של הגידול lysates רקמות, מתן הזדמנות למדוד את נקודות הקצה תפקודית תיקון ה-DNA כמו סמנים של תגובה או היעילות הטיפולית, כפי שכבר הציע להערכת גידולים על potentiation PARP1 מעכב של temozolomide סוכן אלקילציה 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RWs הוא יועץ מדעי ל Trevigen, Inc שאר הכותבים להצהיר כי אין ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של קרן פיטסבורג המכון הלאומי לבריאות בארה"ב (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] כדי לצריבה חוזרת. תמיכה עבור מתקן UPCI lentiviral נמסר לצריבה חוזרת על ידי גרנט מרכז התמיכה הסרטן של המכון הלאומי לבריאות [p30 CA047904]. התמיכה ניתנה גם על ידי משרד אוניברסיטת פיטסבורג לפרמקולוגיה & לביולוגיה כימית DS. התמיכה ניתנה גם על ידי ESTRO כדי קורות חיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
