Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ, Real-time analyse af base excision reparation aktivitet i cellelysater Udnyttelse Læsionssynligheden-specifikke Molecular Beacons

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

Beskriver vi en fremgangsmåde til kvantitativ real-time måling af DNA-glycosylase og AP-endonuclease aktiviteter cellekerner lysater. Assayet giver hastigheder af DNA-reparation aktivitet kan underkastes kinetisk analyse og kan tilpasses til kvantificering af DNA-reparation aktivitet i væv og tumorer lysater eller oprensede proteiner.

Abstract

Beskriver vi en fremgangsmåde til kvantitativ real-time måling af DNA-glycosylase og AP-endonuclease aktiviteter cellekerner lysater under anvendelse base excision reparation (BER) Molecular Beacons. Substratet (fyr) består af en deoxyoligonukleotid indeholdende en enkelt base læsion med en 6-carboxyfluorescein (6-FAM)-delen konjugeret til 5'-enden og en Dabcyl del konjugeret til 3'-enden af ​​oligonukleotidet. BER molekylære mærke er 43 baser i længde og sekvens udformet til at fremme dannelsen af en stem-loop-struktur med 13 nukleotider i sløjfen og 15 basepar i stammen 1,2. Når den er foldet i denne konfiguration 6-FAM-delen standses ved Dabcyl i en ikke-fluorescerende måde via Forster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Læsionen er anbragt således, at efter grundlæggende læsion fjernelse og strengspaltning resterende fem baser oligonukleotid indeholdende 6-FAM del frigives fra stilken. Frigive ennd frigørelse fra quencher (dabcyl) resulterer i en forøgelse af fluorescens, som er proportional med niveauet af DNA-reparation. Ved at samle flere læser af fluorescens værdier tidstro vurdering af BER aktivitet er mulig. Anvendelse af standard kvantitativ realtids-PCR instrumenter tillader den samtidige analyse af flere prøver. Udformningen af ​​disse BER Molecular Beacons med en enkelt base læsion, er egnet til kinetiske analyser, BER kvantificering og inhibitor validering og kan tilpasses til kvantificering af DNA-reparation aktivitet i væv og tumorer cellelysater eller oprensede proteiner. Analysen af ​​BER aktivitet i tumor lysater eller væv suger ved hjælp af disse molekylære beacons kan gælde for funktionelle biomarkør målinger. Yderligere analyse af BER-aktivitet med oprensede proteiner under anvendelse af denne kvantitative assay tilvejebringer en hurtig, high-throughput fremgangsmåde til opdagelse og validering af BER-inhibitorer.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Molekylær Beacon Design

1,1 Design og bestilling din molekylær beacon

Udformningen af ​​din molekylær fyrtårn skal overveje følgende:

  1. Vi har gode resultater med 43-mer DNA-oligonukleotider. GC-indholdet bør være> 32%. Udelukke G base ved 5'-enden.
  2. Anmodningen 6-FAM (6-carboxyfluorescein) konjugering af 5'-enden og Dabcyl som 3'modifikation.
  3. Positionen af ​​læsion bør være på basen # 6 fra 5'-enden.
  4. Længden af ​​skaftet eller hårnålen duplex bør være mindst 15 bp.
  5. Den anbefalede loop-længde er 13 baser.
  6. Den overordnede struktur af fyret er som vist i figur 1.
  7. Når sekvensen og læsionen-type bestemmes, kan oligonukleotidet rekvireres fra de fleste Oligonukleotid firmaer. Vi bestiller vores oligonukleotider fra IDT, og anmode om, at oligonukleotider er HPLC renset og provided som et pulver eller i en tørret form.

1,2 Annealing din molekylær beacon

  1. Opløs lyofiliserede DNA-oligonukleotider med Oligo fortyndingsbuffer (10 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) til opnåelse af en koncentreret Molecular Beacon Stamopløsning af 40 uM.
  2. Fremstille en 200 nM Molecular Beacon brugsopløsning fra 40 uM Molecular Beacon stamopløsning anvendelse af BER reaktionspuffer (se nedenfor). Tilsæt 200 nM Molecular Beacon arbejder løsning på en steril sort 1,5 ml rør.
  3. Inkuber røret indeholdende 200 nM Molecular Beacon arbejdsopløsning i et stort bægerglas med kogende vand i 3 minutter.
  4. Efter 3 minutter fjernes bægeret fra varmekilden og inkuber Molecular Beacons i vand natten over for at fremme annealing. Anvende varmeisolerende materiale både over og under bægeret til at bremse køleprocessen.
  5. Alikvote Beacons i sterile, sorte 1,5 ml rør, 100 gl for hvert rør.
  6. Opbevares ved -30 ° C.

1,3 Kvalitetsvurdering af din molekylær Beacon

  1. Udføre en smelte kurve analyse for at bekræfte, at BER Molecular Beacons ikke fluorescerer først opvarmet for at bestemme den optimale smeltepunkt og at bekræfte, at hver beacon vil fluorescere, når de opvarmes.
  2. For hver beacon tilsættes den angivne mængde af 200 nM Molecular Beacon brugsopløsning og BER reaktionsbuffer, som angivet i tabel 1 til 6 brønde af en Fast optisk plade med 96 brønde (Applied Biosystems, Cat # 4.346.906).
  3. Anvender en real-time PCR instrument såsom StepOnePlus (Applied Biosystems) system eller lignende til overvågning af FAM-farvestof excitation i smelten kurveanalyse.
  4. Programmere real-time PCR-instrument (StepOnePlus system) til at overvåge FAM farvestof excitation som en funktion af stigende temperatur i små portioner til smelten kurveanalyse. Den StepOnePlus Systemet er programmeret til at måle FAM fluorescererIOU og rampe fra 25 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller. En typisk smelte kurve er vist i figur 2.
  5. Ringe eller ingen baggrundsfluorescens skal være synlige ved temperaturer under 50 ° C. Check for en ensartet og kraftig stigning i fluorescens, vejledende af rene og høj kvalitet beacons. Tm-værdier omkring 60 ° C til 80 ° C er tilfredsstillende, og de bør være ens for alle fortyndinger.
  6. Bestemme T max, den temperatur ved maksimal fluorescens [Fl (max)] værdier fra denne analyse. Proportionaliteten af de fluorescens værdier ved T m eller T max til beacon input (koncentrationen) bør være lineær. Fluorescensen værdi T max, Fl (max), bør overstige baggrundsværdier ved 37 ° C på mindst 5 gange.

2. Nuklear Lysate Forberedelse

2,1 Base excision reparation reaktionspuffer 5 præparat

  1. Tilsæt alle de nævnte komponenterTabel 2 og bringe volumenet af puffer til 900 ml med ddh 2 O.
  2. Juster pH til 7,8 under anvendelse af kaliumhydroxid 8,0 N (Sigma, katalog # 17-8).
  3. Bringe volumenet af bufferen til 1000 ml under anvendelse af Ddh 2 O.
  4. Filtreres puffer med 0,22 um filter, Nalgene en L-filter (cat # 167-0020).
  5. Tilsættes Dithiothreitol (DTT) umiddelbart før anvendelse af BER reaktionsbuffer.

2,2 Cellekultur og celleisolering

  1. Foreslås det at dyrke cellerne, indtil 90-100% konfluente. Isolere celler fra 4-6 skåle (150 mm) for at opnå tilstrækkelig nuklear lysat i et komplet sæt analyser (ca. 5 x 10 7 celler i alt).
  2. Det tilrådes at forberede 3 uafhængige kulturer for 3 uafhængige cellepelleter at få biologiske replikater for hver analyse.
  3. Nukleare lysater fremstilles let under anvendelse af NucBuster isoleringsproceduren (EMD Bioscience Calbiochem kat # 71.183-3) ALTHough nukleare isolation protokol ville være hensigtsmæssigt (se nedenfor, afsnit 2,3.).

2,3 Nuklear lysat forberedelse

  1. Forud for start, er en lyofiliseret Protease Inhibitor Cocktail (Calbiochem, Cat # 539.131 1. sæt) først resuspenderet i 100 ul sterilt vand til fremstilling af en 100X stamopløsning. Anvendes umiddelbart eller fryses i alikvoter ved -20 ° C til langtidsopbevaring. Beregne 1 ul af 100X stamopløsninq for hver 10 7 ekstraherede celler efter behov.
  2. Alle trin under ekstraktionsproceduren skal udføres på is eller ved 4 ° C for at sikre proteinstabilitet.
  3. Label 15 ml Falcon rør og anbring på is.
  4. Fjerne vækstmedier fra celler og vaskes to gange med 7,5 ml kold PBS.
  5. Tilsæt 5 ml kold PBS til hver skål, og skrabe cellerne fra pladen ved hjælp af en celle løfter. Overføre cellerne til den afkølede 15 ml Falcon-rør.
  6. Der centrifugeres ved lav hastighed (500x g, 4 ° C) i 5 minutter. Fjern supernatantenog vurdere den hæmatokrit ved sammenligning. (Op til 250 ul hæmatokrit kan behandles i en enkelt 1,5 ml rør)
  7. Centrifuge i yderligere 1 minut ved 500x g og fjern den resterende PBS med en pipette. Resuspenderes cellebundfaldet i NucBuster ekstraktionsreagens en efter størrelsen af ​​den pakkede cellevolumen: 150 ul NucBuster ekstraktionsreagens 1 ud af 50 pi hæmatokrit. (Alternativt kan cellepelleten være hurtig frosset på tøris eller flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C indtil klar til at fortsætte).
  8. Efter resuspension, overfører lysat til en præ-afkølet 1,5 ml rør.
  9. Vortex 15 sekunder ved høj hastighed, inkuberes på is i 5 minutter, og vortexbehandel igen 15 sekunder ved høj hastighed.
  10. Centrifugeres ved 13.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
  11. Supernatanten indeholder cytoplasmatiske fraktion. Fjern og opbevares ved -80 ° C eller kasseres.
  12. Genopslæmmes pelleten i en blanding af 1 ml af resuspenderede 100x Protease Inhibitor Cocktail, 1 & mu, l 100 mM DTT og 75 pi NucBuster ekstraktionsreagens 2 per 50 ul hæmatokrit.
  13. Vortex 15 sekunder ved høj hastighed, inkuberes på is i 5 minutter, og igen vortex 15 sekunder ved høj hastighed.
  14. Centrifugeres ved 13.000 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Supernatanten indeholder kerneproteiner. Saml supernatant og gå videre til næste trin.

2,4 dialyse protein kvantificering og udportionering

  1. Alle trin i dialyse procedure bør udføres med nedkølede løsninger, materialer og udstyr for at sikre ekstrakt kvalitet.
  2. Forberede dialysebuffer (1 L kræves per prøve) som beskrevet i tabel 3. Vigtigt: Buffer være kold (4 ° C). Vi foreslår at forberede mindst dagen før. Filtreret dialysebuffer kan opbevares ved 4 ° C på ubestemt tid, hvis DTT ikke er blevet tilsat.
  3. Pre-chill bægerglas (2 af 1 L bægerglas pr prøve), dialyse buffer, dialyse kamre, mikro-centrifugerør, sprøjter og kanyler.
  4. Lige før brug - der tilsættes 1 ml 1 M DTT pr liter dialysepuffer.
  5. Dialysere lysat fremstillet i trin 2.3 i 0,5 L forafkølet dialysebuffer i 90 minutter ved 4 ° C med forsigtig omrøring med en PIERCE Slide-A-Lyzer dialyse kassette (0,5-3 ml dialyse kassetter med 7000 MW afskæring).
  6. Overførsel dialyse kassette til et andet bægerglas indeholdende 0,5 L forafkølet dialysebuffer og dialysere lysat i 90 minutter ved 4 ° C med forsigtig omrøring.
  7. Opsaml dialyserede kerneprotein opløsning fra dialyse kassette under anvendelse af en sprøjte (Fisher, cat # 309.659). Bruge en anden pakning end tidligere anvendte at injicere proteinet i dialyse kassette. Bemærk, at ekstrakten har krystalliseret på grund af høje proteinkoncentrationer. Forsøger at inkludere uklare udseende krystaller ved fjernelse den dialyserede kerneprotein opløsning.
  8. Alikvot prøven til mikro-centrifugeglas, 20 pi hver. Hurtig fastfrysningen af ​​tøris og lagringe ved -80 ° C indtil anvendelse.
  9. Bestemmelse af koncentrationen af ​​den dialyserede protein under anvendelse af standardprotokoller. Eksempler på det forventede nukleare lysat koncentrationer er vist i tabel 4.
  10. Endelig bør lysater evalueres for kvalitetskontrol. Vurdering af lysaterne vil variere med eksperimentet. Som tidligere beskrevet har vi rutinemæssigt analyseres lysater til ekspression af flere BER proteiner via immunoblot 1,2.
  11. Dialysen trin anvendes til at fremstille en ensartet reaktionsopløsningen over cellelinier for at lette sammenligning. Udelade dialyse trin kan påvirke enzymatiske rater og kinetisk analyse, eftersom de saltopløsninger og reaktionsbetingelser er ikke længere identiske i de forskellige cellelinier og præparater på grund af de forskellige nødvendige fortyndinger. Vi har imidlertid observeret, at anvendelse af lysater af mere end 5 ug / ul og tilsætning af tilstrækkelig reaktionsbuffer giver mulighed udeladelse af dialyse trin (data ikke vist). For inhibitor undersøgelser thved ikke kræver sammenligning mellem forskellige cellelysater kan dialyse ikke påkrævet. Vi anbefaler dog, dialyse som angivet.

3. Molekylær Beacon Assay

3.1 Krav til udstyr

  1. En kvantitativ real-time PCR instrument, såsom StepOnePlus QRT-PCR eller lignende, eller en 96-brønds plade fluorometer i stand til at detektere og måle FAM fluorescens i realtid. Bemærk: Denne procedure gælder for alle maskiner i stand til at læse fluorescens værdier beacons og registrerer dem i real-tid. Maskinen skal dog tillade brugeren at få adgang til de rå fluorescens-værdier for dataanalyse.
  2. Centrifuger i overensstemmelse med optisk QRT-PCR-rør eller plader, der anvendes.
  3. Microsoft Excel til at analysere de indsamlede data.

3.2 Puffere og reagenser

  1. Optiske QRT-PCR rør eller plader med tilhørende betræk.
  2. BER reaktionsbuffer (seBove og tabel 2).
  3. Dialyserede kerneprotein udtrækker som fremstillet i trin 2.3 og 2.4 og fortyndet til 2 ug / ul protein med BER reaktionspuffer indeholdende DTT.
  4. Molecular Beacons fortyndet til 200 uM med BER reaktionspuffer for at skabe den Molecular Beacons arbejdsopløsning (se ovenfor).

3,3 Assay opsætning (tabel 5)

  1. Den QRT-PCR maskine normalt ikke anvendes som et fluorimeter så run metode skal ændres.
    1. Programmet et første trin og indstille reaktionstemperaturen til 37 ° C med en cyklustid (tidspunkter for målinger) af 20 sekunder med et minimum på 180 cyklusser (eller mere, afhængigt af reparationen assayet konstruktion). Sørg for at indsamle data i løbet af de cykler. Derfor vil maskinen indsamle data for hver 20 sekunder ved en i alt 1 time.
    2. Opret en anden fase, at ramperne temperaturen til Tmax af den pågældende fyr, temperaturen med maksimal fluorescens, som afskrækkerudvindes i trin 1,3 (Kvalitetsvurdering af din molekylær Beacon). Denne cyklus tid skal igen være 20 sek med i alt 15 cykler. Dette vil indsamle data hvert 20. sekund i 5 minutter ved den maksimale fluorescens mulige af fyret. De fluorescens målt under cyklusser ved Tmax anvendes til at normalisere fluorescensværdierne i hver brønd (trin 4.2a). Hvis du bruger flere forskellige beacons sørg for at inkludere skridt, der udbyder lignende gentagne værdier for Tmax af dem beacons så godt.
    3. Indstille reaktionsvolumen på 25 ul.
  2. Opsætte pladen designet på QRT-PCR maskine ved hjælp af Applied Biosystems software. Vi er kun interesseret i de rå fluorescens værdier, så vælg "Standard Curve" - ​​eksperiment type.
  3. Udfyld pladen layout. Et eksempel er vist i tabel 5. Føjer ikke noget til brøndene valgt som standard kurve.

3,4 Run analyse

  1. Important: Brug pre-kølede materiale og løsninger. Hold hovedet koldt, indtil løb og afsløring.
  2. Tilsættes passende mængde af DTT til BER reaktionsbufferen skal anvendes.
  3. Fortyndet protein opløsning til en koncentration på 2 ug / ul under anvendelse BER reaktionsbuffer (med DTT).
  4. Til indledende eksperimenter foreslår vi at anvende 10 ug dialyseret nuklear lysat brønd (5 uL / ​​brønd) og 1 pmol substrat, det molekylære mærke på en 40 nM slutkoncentration (5 uL / ​​brønd). Vi har konsistent kvalitet og reproducerbare resultater med 10 ug af cellelysat, selv om det er muligt, at forskellige cellelysater eller beacon substrater kan diktere højere eller lavere proteinkoncentrationer.
    1. Assaykomponenterne i hver brønd er 15 uL BER reaktionsbuffer, 5 pi beacon og 5 pi nuklear lysat. Kør hver beacon / lysat kombination i tre eksemplarer.
    2. Flere negative kontroller er nødvendige for hver beacon, herunder prøver uden fyrtårn som 25 μ L af BER reaktion buffer alene, og 20 pi BER reaktionsbuffer med 5 pi lysat og 20 uL af BER reaktionspuffer med 5 pi af fyret uden lysat.
    3. Adskillige kontrolprøver er påkrævet for hver nukleare lysat. Disse omfatter en negativ kontrol [15 uL BER reaktionsbuffer, 5 uL kontrol beacon (ingen læsion) og 5 ul prøve lysat]. Vi foreslår også at omfatte eksperimentelle positive kontroller såsom inddragelse af THF indeholder fyrtårne, der efterligner abasiske sted med oligo og er let indridset [15 uL BER reaktionsbuffer, 5 uL THF beacon og 5 uL prøve lysat]. Naturligvis vil den nøjagtige positive kontrol afhænge af den generelle eksperimentelle design.
  5. Som et eksempel følger tabel 5 nedenfor for pladen layout.
  6. Afpipettér ind optiske rør eller plader, mens på is eller kølet stand til at minimere reaktion initiering før signal detektion.
  7. Afpipettér BER Reaktionsbufferen først ind i alle brønde.
  8. Den n Pipetter beacons ifølge pladelayout i korrekte brønde og altid Pipetter lysater sidste i brønde for at minimere reaktion initiering før signaldetektering.
  9. Tætningsrørene eller plade grundigt, blandes og spinde en centrifuge for at samle løsninger til bunden af ​​rørene eller plade
  10. Indsætte plade i QRT-PCR maskine og begynder assay.
  11. Efter afslutningen, eksportere rådata, helst i Excel-format. For StepOnePlus systemet kun flerkomponent-data er nødvendige. Denne indeholder alle fluorescensværdierne ved multiple læser sorteret efter farvestof og godt.

4. Molekylær Beacon Assay Analyse

Vi brugte Microsoft Excel software til at udføre disse analyser og beregninger. Vi anbefaler oprettelse af skabeloner og makroer, der vil give nem og hurtig analyse og grafiske displays baseret på data fra standard 96-hullers formater.

4,1 Fjernelse af Baggrund

">
  • Brug de rå fluorescens-værdierne fra flerkomponent-data, skal du først organisere dataene ved godt / prøve. For StepOnePlus system kan dette opnås ved eksport af data "på tværs af kolonner", hvilket resulterer i en Excel-fil med de rækker, der viser de enkelte flere læser på de forskellige cyklusser for de forskellige brønde i kolonner.
  • For hver enkelt molekylære mærke, subtrahere baggrunds fluorescensværdierne påvist i de negative kontroller (20 uL af BER reaktionsbuffer og 5 pi beacon) fra fluorescensværdierne ved hver cyklus i alle brønde med denne molekylære mærke. Dette fjerner de baggrundsfluorescens ændringer ikke er forbundet med lysatet fra fremtidig analyse.
  • 4,2 Fl (Tmax) normalisering

    At behandle variabiliteten i pipettering og fluorescensdetektion i forskellige brønde, vi normalisere data til den maksimale fluorescens værdier (som korrelerer med beacon input).

    1. Beregne de gennemsnitlige fluorescens værdier cyklusser ved T max for den enkelte godt: Fl (T max) (trin 3.3aii).
    2. Beregn nøgletal Fl (cyklus x) / Fl (T max) og gange med 100. Under den sandsynlige antagelse, at Fl (T max) svarer til den størst mulige fluorescensværdi når den er fuldt indskårne, repræsenterer disse normaliserede data% fri FAM (=% BER indsnittet beacon).
    3. Kombiner de tredobbelte prøver ved at midle de data (% fri FAM) af de 3 brønde for hver cyklus (indtil cyklus 180) og beregning fejl på hver.
    4. Beregn gange ved at gange 20 sekunder til hver cyklus.
    5. Da den godt-til-brønd varians i fluorescenspåvisning kan være betydelig, anbefaler vi at tilføje et fluorescerende farvestof som ROX til den molekylære beacon bestand, der fungerer som standard for at re-justere fluorescens-værdier af de enkelte brønde. I dette tilfælde ville ROX farvestof kan anvendes som en intern standard (passiv reference) i hver enkelt brønd. ROXexcitations-og emissionsspektraene (excitation - 588 nm, emission 608 nm) er forskellig fra 6-FAM farvestof anvendt i assayet (excitation - 495 nm, emission - 520 nm). Den ROX farvestof vil muliggøre en normalisering trin svarer til konventionelle RT-PCR-procedurer, der tillader normalisering af brønd-til-brønds forskelle der kan forekomme på grund af artefakter. Disse kan stamme fra pipettering fejl eller kan stamme fra brønd-til-brønd variation i fluorescenspåvisning effektivitet.

    4,3 Plot

    1. Plot normaliserede fluorescens data (% fri FAM) mod tiden (i sek) i et punktdiagram med tilsvarende fejl.
    2. Vi anbefaler at analysere reparation kinetik i mindst tre forskellige nukleare lysatet præparater, der repræsenterer biologiske gentagelser. For at vurdere variansen bør inter-eksperimentelle fejl beregnet ud fra gennemsnittet af hver enkelt eksperiment blive vist.
    3. En repræsentativ undersøgelse af to tumor cellelysater: LN428 et gliomcellelinie med påviselige niveauer af methyl purin-DNA-glycosylase (MPG) og LN428/MPG den samme cellelinje fremstillet til forhøjet ekspression af MPG, begge cellelinier har tilsvarende niveauer af AP-endonuklease 1 (APE1) 1,2. Hver blev probet for APE1 aktivitet og MPG aktivitet under anvendelse af BER THF Molecular Beacon (fig. 3) og BER Hx Molecular Beacon (figur 4), hvor THF = tetrahydrofuran (et substrat for APE1) og Hx = hypoxanthin (et substrat for MPG) . Bemærk: I figur 3 (THF substrat), viser resultaterne fra LN428/MPG lysaterne en lavere maksimale absolutte fluorescens sammenlignet med LN428 lysater. Dette er resultatet af en lavere fyrtårn inputværdi som bestemt ved hjælp af Tmax-værdier (se 3.3a). Når denne lavere værdi blev anvendt til at normalisere resultaterne, resulterer det i en stor ændring i plottet. Nydeligt illustrerer vigtigheden af ​​at normalisere data. Plotte de absolutte fluorescensværdierne alene antyder REPAir på mellem LN428 og LN428/MPG celler er forskellige. Men, når data normaliseres at overveje well-to-godt variabilitet, er APE1-medierede reparation renteforskellen vist sig at være minimal.

    5. Repræsentative resultater

    Beskriver vi en fremgangsmåde til kvantitativ real-time måling af DNA-glycosylase og AP-endonuclease aktiviteter cellekerner lysater under anvendelse base excision reparation (BER) Molecular Beacons (figur 1). Når udglødet, foreslår vi at udføre en smelte kurve analyse (tabel 1) som en kvalitetsvurdering af din molekylær beacon (figur 2). Nukleare lysater kan derefter fremstilles ved anvendelse af bufferkomponenter, der er anført i tabel 2. Dialysere lysat i 0,5 L forafkølet dialysebuffer i 90 minutter ved 4 ° C med forsigtig omrøring med en PIERCE Slide-A-Lyzer Dialyse kassetten imod dialysebufferen anført i tabel 3. Opsamldialyserede kerneprotein opløsning af dialyse kassette under anvendelse af en sprøjte. Bruge en anden pakning end tidligere anvendte at injicere proteinet i dialyse kassette. Bestemmelse af koncentrationen af ​​den dialyserede protein under anvendelse af standardprotokoller. Eksempler på det forventede nukleare lysat koncentrationer er vist i tabel 4. Køre reaktionen som angivet ovenfor (trin 3.4) ved anvendelse af pladen layout som vist i tabel 5. En repræsentativ undersøgelse af to tumor cellelysater: LN428, en glioma cellelinie med påviselige niveauer af methyl purin-DNA-glycosylase (MPG) og LN428/MPG den samme cellelinje fremstillet til forhøjet ekspression af MPG, begge cellelinier har tilsvarende niveauer af AP endonuklease 1 (APE1) 1,2. Hver blev probet for APE1 aktivitet og MPG aktivitet under anvendelse af BER THF Molecular Beacon (fig. 3) og BER Hx Molecular Beacon (figur 4), hvor THF = tetrahydrofuran (et substrat for APE1) og Hx = hypoxanthin(Et substrat for MPG). Endelig giver en BER dU / A Molecular Beacon, som rapporterer om uracil glycosylase aktivitet, viser vi, at udgangssignalet eller signalstyrken er maksimal ved 10 ug protein og falder til et upåviseligt niveau på 0,62 ug protein (figur 5).

    Figur 1
    Figur 1. Overordnede struktur af BER Molecular Beacon. Vist er sekvensen og den generelle udformning af BER Molecular Beacons anvendt heri som en enkelt-strenget molekyle, efter udglødning og igen efter smeltning. Den fed, kursiv del af sekvensen er spindlen (15 baser) og det understregede del af sekvensen er løkken (13 baser). FAM = 5'-fluorescerende farvestof 6-carboxyfluorescein [på 5'-enden; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, ekstinktionskoefficient (260 nm): 20.960; ekstinktionskoefficient (ved absorbans max): 75.000] og Dabcyl = den 3 'quenching agent Ising cyl [om 3'enden; Abmax = 453 nm; Quenching Range = 425-520 nm] X = læsionen (varierer afhængigt af forskning spørgsmål) og Y = bunden modsat læsionen (varierer afhængigt af forskningen spørgsmål). .

    Figur 2
    Figur 2. Smelte kurve. En repræsentativ smeltekurve er vist for BER Molecular Beacon kontrol (A) og BER Molecular Beacons indeholdende tetrahydrofuran (THF)-delen (B) eller hypoxanthin (Hx)-delen (C). Oligonucleotid koncentrationer varierede fra 0 nM (mørk blå), 8 nM (rød), 16 nm (grøn), 32 nM (lilla), 64 nm blå til 128 nM (orange). Som beskrevet i trin 1.3, blev de annealede oligonukleotider blev opvarmet fra 25 ° C til 95 ° C i 0,5 ° C intervaller, og StepOnePlus systemet er programmeret til at måle FAM fluorescens i hver 0,5 ° C interval.

    indhold "> Figur 3
    Figur 3. Repræsentative data ved hjælp af BER THF Molecular Beacon. AP-endonuklease-aktivitet specifik for hydrolyse af det abasiske sted analog tetrahydrofuran (THF) blev målt i nukleare lysater fra kontrol-cellelinie (LN428) og MPG over-ekspression cellelinie (LN428/MPG) . Hvert lysat blev analyseret ved hjælp af enten gruppefritagelsesforordningen Molecular Beacon Control (LN428, grøn, LN428/MPG, lilla) eller gruppefritagelsesforordningen THF Molecular Beacon (LN428, blå LN428/MPG, rød). Resultaterne er rapporteret som (A) middelfluorescensen respons enheder og (B) de samme data normaliseret til beacon input som beskrevet i afsnit 4 ovenfor (THF = tetrahydrofuran).

    Figur 4
    Figur 4. Repræsentative data ved hjælp af gruppefritagelsesforordningen Hx Molecular Beacon DNA glycosylase aktivitet specifik for fjernelse af MPG substrat hypoxanthine (Hx) blev målt i nukleare lysater fra kontrol-cellelinie (LN428) og MPG over-ekspression cellelinie (LN428/MPG). Hvert lysat blev analyseret ved hjælp af enten gruppefritagelsesforordningen Molecular Beacon Control (LN428, grøn, LN428/MPG, lilla) eller gruppefritagelsesforordningen Hx Molecular Beacon (LN428, blå LN428/MPG, rød). Resultaterne er rapporteret som (A) middelfluorescensen respons enheder og (B) de samme data normaliseret som beskrevet i afsnit 4 ovenfor (Hx = hypoxanthin).

    Figur 5
    Figur 5. Repræsentative data ved hjælp af BER dU / A Molecular Beacon på forskellige protein-niveauer. DNA-glycosylase (UNG)-aktivitet specifik for fjernelse af uracil (dU / A) blev målt i nukleare lysater fra T98G-celler. Den T98G Lysatet blev analyseret under anvendelse af enten BER Molecular Beacon kontrol eller BER dU / A Molecular Beacon på protein niveauer på 10, 5, 2,5, 1,25 eller 0,62 ug, som angivet i fIGUR. Resultaterne er normaliserede data som beskrevet i afsnit 4 ovenfor.

    Koncentrationen af ​​Beacon (nM) 0 8 16 32 64 128
    Molekylær Beacon arbejder opløsning (200 nM) added (ul) 0 1 2 4 8 16
    BER reaktionsbuffer (w / o DTT) (uL) 25 24 23 21 17 9

    Tabel 1. Layout af en smelte kurve eksperiment.

    1 L i alt Volumen af Stock Solution behov Con. stamopløsning Endelig Con.
    HEPES-KOH 25 ml 1M pH 7,8 25 mM </ Td>
    KCl 75 ml 2 M 150 mM
    EDTA 1 ml 0,5 M, pH 8,0 0,5 mM
    Glycerol 10 ml N / A 1%
    DTT (add før brug) 0,5 ml 1 M 0,5 mM
    H2O 888,5 ml N / A N / A

    Tabel 2 nedenfor. BER reaktionsbuffer.

    1 L i alt Volumen af Stock Solution behov Con. stamopløsning Endelig Con.
    HEPES-KOH 50 ml 1M pH-værdi 7,5 50 mM
    KCl 50 ml 2 M 100 mM
    EDTA 1 ml 0,5 M, pH 8,0 0,5 mM
    Glycerol 200 ml N / A 20%
    DTT (add før brug) 1 ml 1 M 1 mM
    H2O 698 ml N / A N / A

    Tabel 3. Dialysebuffer.

    Cellelinie Proteinkoncentration (mg / uL)
    LN428 5,34
    LN428/MPG 4,79

    Tabel 4. Protein Bestemmelse resultater.

    Negativ kontrol 25 gl BER Buffer (Baggrund Control) 20 ul BER Buffer
    5 pi Con Beacon
    NO lysat
    (Test i tre eksemplarer) <br /> 15μL BER Buffer
    5 pi Con Beacon
    5 pi LN428 Lysate
    (Test i tre eksemplarer)
    15μL BER Buffer
    5 pi Con Beacon
    5 pi LN428/MPG Lysate
    Negativ kontrol 25 gl BER Buffer (Baggrund Control) 20 ul BER Buffer
    5 pi THF Beacon
    NO lysat
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5 pi THF Beacon
    5 pi LN428 Lysate
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5 pi THF Beacon
    5 pi LN428/MPG Lysate
    Negativ kontrol
    20 pi BER Buffer
    5 pi lysat
    (Baggrund Control) 20 ul BER Buffer
    5 pi Hx Beacon
    NO lysat
    (Test i tre eksemplarer)
    15μL BER Buffer
    5 pi Hx Beacon
    5 pi LN428 Lysate
    (Test i tre eksemplarer) 15μL BER Buffer
    5 pi Hx Beacon
    5 pi LN428/MPG Lykompensere
    Negativ kontrol
    20 pi BER Buffer
    5 pi lysat

    Tabel 5. Molekylær Beacon Assay opsætning.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Der er over 600 citater anvender udtrykket "molekylære mærke" til detektion og kvantificering af adskillige molekyler og enzymatiske aktiviteter, herunder helicase-aktivitet 6, DNA-polymerase-aktivitet 7,8, DNA-ligase-aktivitet 9, telomeraseaktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 og DNA / RNA hybrider 12, blandt mange andre. Ud over anvendelse af Molecular Beacons til måling af DNA-reparation, der er opført ovenfor, har vi og andre viste anvendeligheden af disse prober til analyse af BER-aktivitet 1,2,13-15.

    Den tidstro BER-aktivitet assay beskrives heri inkorporerer en enkelt modificeret base og muliggør kvantitativ vurdering af BER for forskellige læsioner eller ændringer i bunden modsatte læsionen. Programmer kan variere fra molekylære mekanistiske studier og inhibitor skærme. Vi demonstreret BER specificitet ved at sammenligne lysATES fra MPG udtrykke celler med ikke-udtrykkende celler og manglende aktivitet i kontrollen beacons. Assayet er særdeles følsom, hvilket tillader påvisning af defekter i ekspressionen af BER proteiner MPG 2 eller XRCC1 1 og er tilstrækkelig til at detektere små ændringer i DNA-reparation kinetiske parametre og effekten af DNA-reparation inhibitorer [manuskript under udarbejdelse]. Flere læser hele den aktive reparationstid støtte beregnede kinetiske rater og betydning i eventuelle ændringer i disse kinetiske satser. BER molekylære mærke assay er derfor egnet til high-throughput undersøgelser til screening for DNA-reparation enzyminhibitorer (inhibitor skærme) eller til undersøgelser vedrørende rollen af ​​individuelle nukleare komponenter. Analysen af ​​nukleare lysater tillader vurdering af DNA-reparation i den fulde kontekst af gruppefritagelsesforordningen komplekse dermed også skildrer indirekte ændringer eller påvirkninger på BER maskiner (f.eks post-oversættelse modifikationer eller mutationer).

    Denprotokol, som beskrevet, bør give meget reproducerbare og kvantitative resultater. Der er imidlertid flere detaljer at overveje for at sikre korrekt analyse: (1) Baggrund værdier af negative kontroller kan være for høj: Dette kan skyldes dårlig opbevaring eller fremstilling af oligonukleotidet. Høje baggrundsværdierne i lysaterne uden beacons indikerer confounding auto fluorescens (dvs. ved forurening eller cellulær ekspression af eksogene fluorescerende proteiner). Hvis ekspression af en fluorescerende protein er uundgåelig, kan excitation / emission spektre for reporter farvestof og fluorescerende protein ikke overlapper (2) Fl (Tmax) er lav: DNA-koncentration er anderledes end angivet. Se DNA-koncentration ved spektrofotometri (OD 260 nm), for eksempel ved hjælp af Nanodrop. Høj DNA-koncentration med lav Fl (Tmax) angiver en utilstrækkelig FAM belastning på beacons. HPLC oprensning forhindrer kontaminering med ikke-modificerede DNA (se ovenfor), (3) reparation aktivitet er dårligt: ​​Hvis Fl (Tmax) værdier påde sidste cyklusser viser tilstrækkelig beacon input og fluorescens detektion, kan dette tyder på, at den nukleare ekstrakt præparatet mislykkedes. Nuklear ekstrakt kvalitet er afgørende. Lave temperaturer bør sikres gennem hele proceduren, herunder langtidsopbevaring ved -80 ° C og (4) Reparation aktivitet kurver indlede med høje værdier: Selv meget kort eksponering af prøverne til stuetemperatur inden analyse indleder reparation. At køle på alle tidspunkter.

    Dette meget følsom og kvantitativ BER assay er også anvendelig til analyse af oprensede proteiner, der muliggør undersøgelser af substrat specificitet ved at ændre den molekylære beacons tilsvarende. Endelig assayet er anvendelig til analyse af tumor og væv lysater, der giver en mulighed for at måle funktionelle DNA-reparation endepunkter som biomarkører af reaktion eller terapeutisk virkning, som vi har foreslået for at vurdere tumorer til PARP1 inhibitor potentiering af alkyleringsmidlet temozolomid 2.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    RWS er ​​en videnskabelig konsulent til Trevigen, Inc. Resten af ​​forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.

    Acknowledgments

    Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Pittsburgh Foundation og National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629; ES019498] til RWS. Støtte til UPCI lentiviral faciliteten blev stillet til rådighed RWS fra Cancer Center Support Grant fra National Institutes of Health [P30 CA047904]. Der blev også leveret af University of Pittsburgh Institut for Farmakologi & Chemical Biology til DS. Der blev også leveret af ESTRO til CV.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
    2. Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
    3. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
    4. Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
    5. Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
    6. Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
    7. Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
    8. Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
    9. Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
    10. Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
    11. Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
    12. Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
    13. Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
    14. Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). (2009).
    15. Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
    Kvantitativ, Real-time analyse af base excision reparation aktivitet i cellelysater Udnyttelse Læsionssynligheden-specifikke Molecular Beacons
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter