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Biology

मात्रात्मक, सेल lysates घाव विशेष आण्विक Beacons उपयोग में वास्तविक समय बेस छांटना मरम्मत गतिविधि का विश्लेषण

doi: 10.3791/4168 Published: August 6, 2012

Summary

हम मात्रात्मक, से डीएनए glycosylase और सेल परमाणु lysates में एपी endonuclease गतिविधियों के वास्तविक समय की माप के लिए एक विधि का वर्णन. परख गतिज विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी डीएनए की मरम्मत गतिविधि की दर की पैदावार और डीएनए ऊतक और ट्यूमर lysates में या शुद्ध प्रोटीन के साथ मरम्मत गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए अनुकूल है.

Abstract

हम मात्रात्मक, से डीएनए glycosylase और सेल परमाणु lysates में एपी endonuclease गतिविधियों की माप के आधार काटना की मरम्मत (BER) आणविक बीकन्स का उपयोग वास्तविक समय के लिए एक विधि का वर्णन. सब्सट्रेट (बीकन) एक युक्त deoxyoligonucleotide (6 परिवार) संयुग्मित 5'end और एक Dabcyl oligonucleotide के 3 सिरे संयुग्मित आधा आधा भाग 6 Carboxyfluorescein के साथ एक एकल आधार घाव शामिल है. प्रासंगिकता आणविक बीकन लंबाई में 43 ठिकानों है और अनुक्रम स्टेम पाश पाश और स्टेम 1,2 में 15 आधार जोड़े में 13 nucleotides के साथ एक संरचना के गठन को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है. इस विन्यास में मुड़ा हुआ आधा भाग 6 - परिवार Dabcyl द्वारा Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) 3,4 के माध्यम से एक गैर फ्लोरोसेंट तरीके में बुझती है. घाव जैसे कि निम्नलिखित आधार घाव को हटाने और शेष 5 आधार छह - परिवार आधा भाग युक्त oligonucleotide स्टेम से किनारा तराश जारी की है तैनात है. एक रिलीजप्रतिदीप्ति की वृद्धि हुई है कि डीएनए की मरम्मत के स्तर के लिए आनुपातिक है में पेय (Dabcyl) परिणाम से एन डी टुकड़ी. कई एकत्रित द्वारा प्रतिदीप्ति मूल्यों के पढ़ता है, वास्तविक समय हिट गतिविधि का आकलन संभव है. मानक मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर उपकरणों के उपयोग के कई नमूनों के साथ - साथ विश्लेषण की अनुमति देता है. इन हिट आणविक बीकन के डिजाइन, एक एकल आधार घाव के साथ, गतिज विश्लेषण, संख्या मात्रा का ठहराव और अवरोध करनेवाला सत्यापन करने के लिए उत्तरदायी है और ऊतक और ट्यूमर सेल lysates में डीएनए की मरम्मत गतिविधि की मात्रा का ठहराव के लिए या शुट्ठ प्रोटीन के साथ अनुकूलनीय है. ट्यूमर lysates या रेस्पायरेट्रस ऊतक का उपयोग करके beacons इन आणविक में हिट गतिविधि के विश्लेषण कार्यात्मक biomarker के मापन के लिए लागू हो सकता है. इसके अलावा, इस मात्रात्मक परख का उपयोग शुट्ठ प्रोटीन के साथ हिट गतिविधि का विश्लेषण, खोज और हिट inhibitors के सत्यापन के लिए एक तेजी से विधि उच्च throughput प्रदान करता है.

Protocol

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1. आणविक बीकन डिजाइन

1.1 डिजाइन और अपने आणविक बीकन आदेश

अपने आणविक बीकन के डिजाइन पर विचार करना चाहिए:

  1. हम 43 मेर डीएनए oligonucleotides के साथ अच्छा परिणाम है. जीसी सामग्री> 32% होना चाहिए. 5 'अंत में जी आधार को बाहर निकालें.
  2. अनुरोध छह परिवार (6 Carboxyfluorescein) 5 'अंत और एक 3 के रूप में' संशोधन Dabcyl पर विकार.
  3. घाव की स्थिति # 5 'अंत से 6 के आधार पर होना चाहिए.
  4. स्टेम या बाल के लिये कांटा द्वैध की लंबाई 15 बीपी की एक न्यूनतम होना चाहिए.
  5. पाश लंबाई की सिफारिश की 13 आधार है.
  6. बीकन की समग्र संरचना के रूप में चित्र 1 में दिखाया गया है.
  7. एक बार अनुक्रम और घाव प्रकार का फैसला किया है, oligonucleotide सबसे Oligonucleotide कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है. हम IDT से हमारे oligonucleotides के आदेश और अनुरोध है कि oligonucleotides के से HPLC शुद्ध और प्रदान करता हैंएक पाउडर के रूप में या एक सूखे प्रारूप में एड.

1.2 आपके आणविक बीकन एलीलिंग के

  1. Oligo कमजोर पड़ने बफर में lyophilized डीएनए oligonucleotides के भंग (10 Tris - एचसीएल, पीएच 8.0 मिमी, 0.1 मिमी EDTA) एक केंद्रित 40 माइक्रोन की आण्विक बीकन स्टॉक समाधान देने के लिए.
  2. एक 200nm 40 माइक्रोन आण्विक बीकन स्टॉक हिट प्रतिक्रिया बफर (नीचे देखें) का उपयोग कर समाधान से आण्विक बीकन समाधान काम कर तैयार है. 200 एनएम आण्विक बीकन काम कर रहे एक बाँझ काला 1.5 एमएल ट्यूब का हल जोड़ें.
  3. 3 मिनट के लिए उबलते पानी की एक बड़ी बीकर में 200 एनएम आण्विक बीकन काम समाधान युक्त ट्यूब सेते हैं.
  4. 3 मिनट के बाद, गर्मी स्रोत से बीकर को हटाने और annealing के बढ़ावा देने के लिए रात भर पानी में आण्विक Beacons सेते हैं. गर्मी इन्सुलेट दोनों पर और बीकर के तहत सामग्री को ठंडा करने की प्रक्रिया को धीमा का उपयोग करें.
  5. अशेष भाजक Beacons, बाँझ, काला 1.5 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक ट्यूब के लिए 100 μL.
  6. -30 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर

1.3 अपने आणविक बीकन की गुणवत्ता मूल्यांकन

  1. एक पिघल वक्र विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए पुष्टि करते हैं कि आणविक बीकन के हिट गर्म जब तक नहीं प्रतिदीप्ति, करने के लिए इष्टतम पिघलने के तापमान को निर्धारित करने के लिए और पुष्टि करते हैं कि प्रत्येक बीकन जब गरम प्रतिदीप्ति.
  2. के लिए प्रत्येक बीकन 200 एनएम आण्विक बीकन काम समाधान और संख्या प्रतिक्रिया बफर के संकेत मात्रा जोड़ने के लिए, के रूप में तालिका 1 में दर्शाए गए एक फास्ट ऑप्टिकल 96 अच्छी तरह से थाली के 6 कुओं (एप्लाइड Biosystems, बिल्ली 4,346,906 #).
  3. StepOnePlus प्रणाली (एप्लाइड Biosystems) या इसी तरह पिघल वक्र विश्लेषण के दौरान परिवार डाई उत्तेजना पर नजर रखने के लिए के रूप में वास्तविक समय पीसीआर साधन का प्रयोग करें.
  4. कार्यक्रम पिघल वक्र विश्लेषण के लिए छोटे वेतन वृद्धि में बढ़ती तापमान के एक समारोह के रूप में अपने वास्तविक समय पीसीआर साधन (StepOnePlus प्रणाली) परिवार डाई उत्तेजना पर नजर रखने के लिए. StepOnePlus प्रणाली को मापने के लिए परिवार प्रतिदीप्ति क्रमादेशित हैऔर nce रैंप से 25 डिग्री सेल्सियस डिग्री सेल्सियस 0.5 डिग्री सेल्सियस के अंतराल में 95. एक ठेठ पिघल वक्र चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  5. कम या कोई पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति 50 डिग्री सेल्सियस से नीचे तापमान पर दिखाई जानी चाहिए प्रतिदीप्ति में एक समान और तेजी से वृद्धि हुई है, शुद्ध और उच्च गुणवत्ता बीकन के संकेत के लिए जाँच करें. Tm मूल्यों लगभग 60 डिग्री सेल्सियस से 80 डिग्री सेल्सियस अनुकूल हैं और सभी dilutions के लिए बराबर होना चाहिए.
  6. इस विश्लेषण से टी अधिकतम तापमान अधिकतम प्रतिदीप्ति [FL (अधिकतम)] मूल्यों पर, निर्धारित करते हैं. टी मीटर या बीकन इनपुट (एकाग्रता) टी अधिकतम पर प्रतिदीप्ति मूल्यों की समानता में रैखिक होना चाहिए. टी अधिकतम, FL (अधिकतम), प्रतिदीप्ति मूल्य 37 डिग्री सेल्सियस कम से कम 5 गुना पर पृष्ठभूमि मान से अधिक होना चाहिए.

2. परमाणु lysate तैयारी

2.1 बेस छांटना मरम्मत प्रतिक्रिया बफर 5 तैयारी

  1. सभी सूचीबद्ध घटकों जोड़ेंतालिका 2 और DDH 2 ओ के साथ 900 एमएल बफर की मात्रा लाने में
  2. पीएच 7.8 पोटेशियम हीड्राकसीड 8.0 एन (सिग्मा, बिल्ली 17-8 #) का उपयोग करने के लिए समायोजित करें.
  3. 1000 DDH 2 ओ का उपयोग एमएल बफर की मात्रा लाओ
  4. बफर .22 माइक्रोन फिल्टर, Nalgene 1 एल फिल्टर है (# बिल्ली 167-0020 पर) का उपयोग कर फ़िल्टर.
  5. Dithiothreitol (डीटीटी) तुरंत जोड़ें संख्या प्रतिक्रिया बफर का उपयोग करने से पहले.

2.2 सेल संस्कृति और सेल अलगाव

  1. यह 90-100% संगामी तक संस्कृति कोशिकाओं को सुझाव दिया है. 4-6 बर्तन (150 मिमी) से कोशिकाओं को अलग करने के लिए विश्लेषण का एक पूरा सेट (कुल लगभग 5 x 10 7 कोशिकाओं) के लिए पर्याप्त परमाणु lysate प्राप्त करने के लिए.
  2. यह 3 3 स्वतंत्र सेल छर्रों के लिए स्वतंत्र संस्कृतियों को तैयार करने के लिए प्राप्त करने के लिए प्रत्येक विश्लेषण के लिए जैविक प्रतिकृति की सलाह दी है.
  3. परमाणु lysates आसानी NucBuster अलगाव (ईएमडी बायोसाइंस Calbiochem बिल्ली 71,183-3 #) प्रक्रिया alth का उपयोग कर तैयार कर रहे हैंough किसी भी परमाणु अलगाव प्रोटोकॉल उपयुक्त हो (नीचे देखें खंड 2.3.).

2.3 परमाणु lysate तैयारी

  1. पहले शुरू करने के लिए, एक lyophilized Protease एफडीए कॉकटेल (Calbiochem, बिल्ली 539,131 #, 1 सेट) के पहले 100 μl बाँझ पानी में फिर से निलंबित एक 100x स्टॉक तैयार है. तुरंत का उपयोग करें या लंबी अवधि के भंडारण के लिए aliquots में -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है. हर 10 7 निकाली गई कोशिकाओं, के रूप में की जरूरत के लिए के 100x स्टॉक 1 μl गणना.
  2. निष्कर्षण प्रक्रिया के दौरान सभी चरणों बर्फ पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए करने के लिए प्रोटीन स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए.
  3. लेबल 15 एमएल फाल्कन ट्यूबों और बर्फ पर जगह.
  4. कोशिकाओं के विकास से मीडिया निकालें और ठंडा पीबीएस के 7.5 एमएल के साथ दो बार धोना.
  5. प्रत्येक और थाली एक सेल चोर का उपयोग कर से पकवान परिमार्जन की कोशिकाओं को ठंड पीबीएस के 5 एमएल जोड़ें. ठंडा एमएल 15 फाल्कन ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
  6. 5 मिनट के लिए कम गति (500x जी, 4 डिग्री सेल्सियस) पर अपकेंद्रित्र. सतह पर तैरनेवाला निकालेंऔर तुलना द्वारा पैक सेल मात्रा का अनुमान है. (ऊपर 250 μl पैक सेल मात्रा एक एकल 1.5 एमएल ट्यूब में संसाधित किया जा सकता है)
  7. 500x जी में एक और 1 मिनट और एक विंदुक के साथ शेष पीबीएस हटाने के लिए अपकेंद्रित्र. 150 μl NucBuster निकालना 1 अभिकर्मक प्रति 50 μl पैक सेल मात्रा: NucBuster निकालना 1 अभिकर्मक में सेल गोली पैक सेल मात्रा के आकार के अनुसार Resuspend. (वैकल्पिक रूप से, सेल गोली जल्दी से जमे हुए सूखी बर्फ पर या तरल नाइट्रोजन के साथ हो सकता है और -80 में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस तक तैयार आगे बढ़ने के लिए कर सकते हैं).
  8. फिर से निलंबन के बाद, एक पूर्व - ठंडा 1.5 एमएल ट्यूब lysate हस्तांतरण.
  9. भंवर 15 सेकंड उच्च गति, 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, और भंवर उच्च गति पर फिर से 15 सेकंड में.
  10. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र
  11. सतह पर तैरनेवाला cytoplasmic अंश शामिल हैं. निकालें और -80 डिग्री सेल्सियस पर दुकान या त्यागें.
  12. 1 फिर से निलंबित 100x protease अवरोध करनेवाला कॉकटेल के μl, 1 और मीटर का एक मिश्रण में गोली पुनः निलंबितयू, 100 मिमी के डीटीटी और 75 50 μl पैक सेल मात्रा प्रति μl NucBuster निकालना 2 अभिकर्मक के एल.
  13. भंवर 15 उच्च गति पर सेकंड, 5 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, और फिर भंवर उच्च गति पर 15 सेकंड.
  14. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 13,000 XG पर अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला परमाणु प्रोटीन शामिल हैं. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और अगले चरण पर जाएँ.

2.4 डायलिसिस, प्रोटीन मात्रा का ठहराव और aliquoting

  1. डायलिसिस प्रक्रिया के दौरान सभी चरणों पूर्व ठंडा समाधान, सामग्री, उपकरण और के साथ प्रदर्शन किया जाना चाहिए करने के लिए निकालने गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए.
  2. तालिका 3 में विस्तृत रूप डायलिसिस बफर (1 एल नमूना प्रति अपेक्षित) तैयार करें. महत्वपूर्ण: बफर ठंडा होना चाहिए (4 डिग्री सेल्सियस). हम कम से कम दिन पहले की तैयारी की सलाह देते हैं. छनित डायलिसिस बफर 4 में संग्रहीत किया जा सकता ° सी अनिश्चित काल अगर डीटीटी जोड़ा नहीं गया है.
  3. पूर्व सर्द beakers के (1 2 नमूना प्रति एल beakers), डायलिसिस बफर, डायलिसिस कक्षों, सूक्ष्म अपकेंद्रित्रट्यूबों, सीरिंज और सुई.
  4. सही से पहले उपयोग - डायलिसिस बफर प्रति लीटर 1 एमएल 1 एम डीटीटी.
  5. 4 में 90 मिनट के लिए 0.5 एल डायलिसिस पूर्व ठंडा बफर में 2.3 चरण में तैयार lysate Dialyze डिग्री सेल्सियस कोमल सरगर्मी Pierce - स्लाइड एक Lyzer डायलिसिस कैसेट (सत्तर सौ मेगावाट cutoff के साथ 0.5-3 एमएल डायलिसिस कैसेट) का उपयोग कर के साथ.
  6. एक दूसरे बीकर युक्त 0.5 एल डायलिसिस पूर्व ठंडा बफर के स्थानांतरण के लिए डायलिसिस कैसेट और 90 मिनट के लिए lysate 4 ° कोमल सरगर्मी के साथ सी dialyze.
  7. डायलिसिस एक सिरिंज का उपयोग कैसेट (फिशर, # बिल्ली ३,०९,६५९) से dialyzed परमाणु प्रोटीन समाधान लीजिए. एक अलग गैसकेट से पहले डायलिसिस कैसेट में प्रोटीन इंजेक्षन का उपयोग करें. नोट करें कि निकालने उच्च प्रोटीन सांद्रता के कारण सघन हो सकता है. बादल देख क्रिस्टल जब dialyzed परमाणु प्रोटीन समाधान निकालने की कोशिश करो.
  8. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों, 20 μl प्रत्येक नमूना अशेष भाजक. पर त्वरित फ्रीज शुष्क बर्फ और stor-80 में ई ° सी का उपयोग करें जब तक.
  9. Dialyzed मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. उम्मीद परमाणु lysate सांद्रता का उदाहरण तालिका 4 में दिखाया जाता है.
  10. अंत में, lysates गुणवत्ता नियंत्रण के लिए मूल्यांकन किया जाना चाहिए. Lysates का आकलन प्रयोग के साथ अलग अलग होंगे. जैसा कि पहले वर्णित है, हम नियमित रूप से कई हिट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के लिए immunoblot 1,2 के माध्यम से lysates विश्लेषण.
  11. डायलिसिस कदम सेल लाइनों के पार एक समान प्रतिक्रिया समाधान की तुलना की सुविधा के लिए प्रयोग किया जाता है. डायलिसिस कदम छोड़ना एंजाइमी दर और प्रभावित गतिज विश्लेषण के बाद नमक समाधान और स्थितियों की प्रतिक्रिया अब विभिन्न सेल लाइनों और विभिन्न आवश्यक dilutions के कारण तैयारी में समान नहीं हो सकता है. हालांकि, हमने देखा है कि अधिक से अधिक 5 μg / μl की lysates का उपयोग और पर्याप्त प्रतिक्रिया बफर जोड़ने डायलिसिस कदम (नहीं दिखाया डेटा) की चूक की अनुमति नहीं है. अवरोध करनेवाला अध्ययन वें के लिएपर अलग सेल lysates के बीच तुलना की आवश्यकता नहीं है, डायलिसिस की आवश्यकता नहीं किया जा सकता है. हालांकि, हम डायलिसिस सिफारिश के रूप में संकेत दिया.

3. आण्विक बीकन परख

3.1 उपकरण आवश्यकताओं

  1. मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर साधन, qRT - पीसीआर या तुलनीय StepOnePlus के, या 96 अच्छी तरह से एक थाली fluorometer का पता लगाने और वास्तविक समय में परिवार प्रतिदीप्ति उपाय करने में सक्षम के रूप में. नोट: यह प्रक्रिया किसी भी बीकन्स की प्रतिदीप्ति मूल्यों को पढ़ने के लिए और उन्हें वास्तविक समय में रिकॉर्ड करने में सक्षम मशीन के लिए लागू है. मशीन, तथापि, उपयोगकर्ता डेटा विश्लेषण के लिए कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों का उपयोग करने की अनुमति चाहिए.
  2. ऑप्टिकल qRT-पीसीआर ट्यूब या प्लेट इस्तेमाल किया जा रहा है के साथ संगत अपकेंद्रित्र.
  3. Microsoft Excel में डेटा एकत्र का विश्लेषण करने के लिए.

3.2 Buffers और अभिकर्मकों

  1. ऑप्टिकल qRT-पीसीआर ट्यूब या इसी कवर के साथ प्लेट.
  2. प्रासंगिकता प्रतिक्रिया बफर (एक देखनाbove और तालिका 2).
  3. Dialyzed परमाणु प्रोटीन के रूप में 2.3 और 2.4 चरणों में तैयार और हिट प्रतिक्रिया युक्त बफर डीटीटी के साथ 2 μg / μL प्रोटीन पतला निकालता है.
  4. आणविक Beacons संख्या प्रतिक्रिया बफर के साथ 200 माइक्रोन के लिए पतला करने के लिए आण्विक बीकन्स काम कर समाधान (ऊपर देखें).

3.3 परख सेट अप (सारणी 5)

  1. qRT - पीसीआर मशीन आम तौर पर एक fluorimeter के रूप में प्रयोग किया जाता है तो रन विधि परिवर्तित किया जाना चाहिए.
    1. पहले चरण के कार्यक्रम और प्रतिक्रिया तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 20 सेकंड का एक चक्र (माप के लिए समय अंक) 180 चक्र (या अधिक, मरम्मत परख डिजाइन पर निर्भर करता है) की एक न्यूनतम के साथ समय के साथ सेट. चक्र के दौरान डेटा इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें. इसलिए, मशीन डेटा 1 घंटे की कुल के लिए हर 20 सेकंड एकत्रित करेगा.
    2. दूसरे चरण है कि रैंप विशेष बीकन की Tmax तापमान, अधिकतम प्रतिदीप्ति के साथ तापमान, के रूप में रोकते बनाएँ1.3 चरण (अपने आणविक बीकन की गुणवत्ता मूल्यांकन) में खनन. समय चक्र फिर से 15 चक्र का एक कुल के साथ 20 सेकंड का होना चाहिए. यह डेटा अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति में 5 मिनट बीकन के संभव के लिए हर 20 सेकंड एकत्रित करेगा. प्रतिदीप्ति Tmax में चक्र के दौरान मापा मूल्यों के लिए एक अच्छी तरह 4.2a कदम में प्रतिदीप्ति मूल्यों के मानक के अनुसार किया जाता है. यदि कई विभिन्न का उपयोग करके beacons कदम है कि उन बीकन्स Tmax के लिए समान दोहराए मूल्यों के रूप में अच्छी तरह से प्रदान करते हैं को शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें.
    3. 25 μL करने के लिए प्रतिक्रिया मात्रा सेट.
  2. QRT पीसीआर एप्लाइड Biosystems सॉफ्टवेयर के प्रयोग मशीन पर थाली डिजाइन के लिए सेट अप. प्रयोग प्रकार हम केवल कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों में रुचि रखते हैं, तो "मानक वक्र का चयन करें.
  3. पूरा प्लेट लेआउट. एक उदाहरण तालिका 5 में दिखाया गया है. मानक वक्र के रूप में चयनित कुओं को जोड़ने के कुछ मत करो.

3.4 रन परख

  1. छोटा सा भूतortant: का प्रयोग करें पूर्व ठंडा सामग्री और समाधान. चलाने के लिए और पहचान जब तक शांत रहो.
  2. हिट प्रतिक्रिया करने के लिए इस्तेमाल किया जा बफर के डीटीटी की उचित राशि जोड़ें.
  3. प्रोटीन 2 μg / μL के एक एकाग्रता संख्या प्रतिक्रिया बफर (डीटीटी साथ) का उपयोग करने के लिए समाधान जलमिश्रित.
  4. प्रारंभिक प्रयोगों के लिए हम 10 μg dialyzed परमाणु lysate के प्रति अच्छी तरह से (5 μL / अच्छी तरह से) और सब्सट्रेट के 1 pmole, एक 40 एनएम अंतिम एकाग्रता आणविक बीकन (5 μL अच्छी तरह /) का उपयोग करने का सुझाव देते हैं. हम लगातार उच्च गुणवत्ता और सेल lysate के 10 μg के साथ प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त किया है, हालांकि यह संभव है कि अलग सेल lysates या बीकन substrates के अधिक या कम प्रोटीन सांद्रता हुक्म हो सकता है.
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से परख घटकों 15 μL संख्या प्रतिक्रिया बफर, 5 μL बीकन और 5 μL परमाणु lysate हैं. तीन प्रतियों में प्रत्येक संयोजन / बीकन lysate चलाएँ.
    2. कई नकारात्मक नियंत्रण हर बीकन के लिए आवश्यक हैं, के रूप में 25 और बीकन के बिना नमूने सहितम्यू, हिट प्रतिक्रिया केवल बफर, और 5 μl lysate और lysate बिना 5 बीकन की μL साथ हिट प्रतिक्रिया बफर के 20 μL के साथ 20 μl संख्या प्रतिक्रिया बफर के एल.
    3. कई नियंत्रण नमूने प्रत्येक नाभिकीय lysate के लिए आवश्यक हैं. इन नकारात्मक नियंत्रण [15 μL संख्या प्रतिक्रिया बफर, 5 μL नियंत्रण बीकन (कोई घाव) और 5 μL नमूना lysate] शामिल हैं. हम यह भी सुझाव है कि बीकन्स कि चलन - अक्षमता संबंधी अथवा चलन अक्षम oligos युक्त साइट की नकल कर रहे हैं और आसानी से [15 μL संख्या प्रतिक्रिया बफर, 5 μL THF बीकन और 5 μL नमूना lysate] छिन्न युक्त THF के शामिल किए जाने के रूप में प्रयोगात्मक सकारात्मक नियंत्रण शामिल है. बेशक, सटीक सकारात्मक नियंत्रण समग्र प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करेगा.
  5. एक उदाहरण के रूप में, प्लेट लेआउट के लिए नीचे 5 टेबल का पालन करें.
  6. ऑप्टिकल ट्यूब या प्लेट में pipet, जबकि बर्फ या ठंडा स्टैंड पर प्रतिक्रिया दीक्षा संकेत का पता लगाने से पहले कम से कम.
  7. Pipet संख्या प्रतिक्रिया बफर सभी कुओं में पहली बार.
  8. पता pipet बीकन के सही कुओं और हमेशा pipet में थाली लेआउट के अनुसार कुओं में पिछले lysates प्रतिक्रिया दीक्षा संकेत का पता लगाने से पहले कम से कम.
  9. सील ट्यूब या थाली को अच्छी तरह से मिश्रण है, और एक अपकेंद्रित्र के साथ स्पिन ट्यूब या प्लेट के नीचे करने के लिए समाधान इकट्ठा
  10. QRT-पीसीआर मशीन में थाली डालें और परख शुरू.
  11. पूरा होने के बाद कच्चे डेटा निर्यात करने के लिए, अधिमानतः एक्सेल प्रारूप में है. StepOnePlus प्रणाली के लिए केवल बहु घटक डेटा की जरूरत है. यह कई पर प्रतिदीप्ति मूल्यों पढ़ता डाई रंग और अच्छी तरह से हल होता है.

4. आणविक बीकन परख विश्लेषण

हम माइक्रोसॉफ्ट एक्सेल सॉफ्टवेयर का इस्तेमाल करने के लिए इन विश्लेषण और परिकलन. हम स्थापना टेम्पलेट्स और मैक्रोज़ है कि मानक 96 अच्छी तरह प्रारूपों से प्राप्त आंकड़ों के आधार पर आसान और त्वरित विश्लेषण और ग्राफ को प्रदर्शित करता है की अनुमति देगा की सलाह देते हैं.

पृष्ठभूमि की 4.1 हटाना

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  • बहु घटक डेटा से कच्चे प्रतिदीप्ति मूल्यों का प्रयोग, पहली बार अच्छी तरह / नमूना के द्वारा डेटा को व्यवस्थित. StepOnePlus प्रणाली के लिए इस डेटा व्यक्तिगत एकाधिक प्रदर्शित पंक्तियों के साथ एक एक्सेल फ़ाइल में जिसके परिणामस्वरूप "" स्तंभों में निर्यात से प्राप्त किया जा सकता है स्तंभों में अलग कुओं के लिए अलग चक्र में पढ़ता है.
  • हर व्यक्ति आणविक बीकन के लिए, पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कि आणविक बीकन का उपयोग कुओं में प्रत्येक चक्र में प्रतिदीप्ति मूल्यों (संख्या प्रतिक्रिया बफर के 20 μL और बीकन के 5 μL) से नकारात्मक नियंत्रण में पाया मूल्यों को घटाना. इस पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति परिवर्तन भविष्य के विश्लेषण से lysate साथ जुड़ा नहीं हटा है.
  • 4.2 Fl सामान्य (Tmax)

    Pipetting और विभिन्न कुओं में प्रतिदीप्ति पता लगाने में परिवर्तनशीलता पता है, हम अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति मूल्यों (कि बीकन इनपुट के साथ सहसंबंधी) डेटा मानक के अनुसार.

    1. FL (टी अधिकतम) (3.3aii कदम): टी अधिकतम औसत प्रतिदीप्ति चक्र की अच्छी तरह से व्यक्ति के लिए मानों की गणना.
    2. गणना अनुपात (चक्र) x FL / FL (टी अधिकतम) और 100 से गुणा. संभावना इस धारणा है कि FL (टी अधिकतम) अधिक से अधिक संभव प्रतिदीप्ति मूल्य से मेल खाती है जब पूरी तरह से छिन्न के तहत, इन सामान्यीकृत डेटा% मुक्त परिवार (=% संख्या छिन्न बीकन) का प्रतिनिधित्व करते हैं.
    3. हर चक्र के लिए 3 कुओं के डेटा (% मुक्त परिवार) (180 चक्र तक) औसत से तीन प्रतियों के नमूनों का मिश्रण है और प्रत्येक पर त्रुटियों की गणना.
    4. हर चक्र 20 सेकंड गुणा करके समय की गणना.
    5. प्रतिदीप्ति का पता लगाने में विचरण के बाद से अच्छी तरह से अच्छी तरह से महत्वपूर्ण हो सकता है, हम आणविक बीकन स्टॉक है कि अलग - अलग कुओं फिर से प्रतिदीप्ति मूल्यों को समायोजित करने के लिए मानक के रूप में कार्य करता है के के Rox के रूप में एक फ्लोरोसेंट डाई जोड़ने की सलाह देते हैं. इस मामले में, Rox डाई हर अच्छी तरह से एकल में एक आंतरिक मानक (निष्क्रिय संदर्भ) के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा. Roxउत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा (उत्तेजना - 588 एनएम, उत्सर्जन 608 एनएम) कि 6 परिवार डाई की परख (- 495 एनएम, उत्सर्जन - 520 एनएम उत्तेजना) में कार्यरत से अलग है. Rox डाई सामान्य परंपरागत RT-पीसीआर प्रक्रियाओं के लिए समान कदम है कि अच्छी तरह से अच्छी तरह से मतभेद कि कलाकृतियों करने के लिए कारण हो सकता है की सामान्य अनुमति देता है सक्षम होगा. इन त्रुटियों pipetting या प्रतिदीप्ति का पता लगाने दक्षता में अच्छी तरह से अच्छी तरह से भिन्नता से उत्पन्न हो सकता है से हो सकता है.

    4.3 प्लॉट

    1. प्लॉट समय (सेकंड में) के खिलाफ सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति (मुक्त परिवार%) इसी त्रुटियों के साथ एक तितर बितर साजिश में डेटा.
    2. हम कम से कम तीन अलग lysate परमाणु जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करने की तैयारी में मरम्मत कैनेटीक्स का विश्लेषण करने की सलाह देते हैं. प्रसरण का आकलन करने के लिए, अंतर - प्रयोगात्मक प्रत्येक व्यक्ति के प्रयोग के औसत से गणना त्रुटियों को प्रदर्शित किया जाना चाहिए.
    3. दो ट्यूमर सेल lysates विश्लेषण का एक प्रतिनिधि: LN428, एक gliomaसेल लाइन मिथाइल प्यूरीन डीएनए (MPG) glycosylase और LN428/MPG, एक ही सेल लाइन MPG का ऊंचा अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर की undetectable स्तर के साथ, दोनों सेल लाइनों, एपी 1 endonuclease (APE1) 1,2 के बराबर स्तर पर है. प्रत्येक गतिविधि APE1 और MPG गतिविधि संख्या THF आण्विक (चित्रा 3) बीकन और हिट Hx आण्विक बीकन, (चित्रा 4) का उपयोग कर के लिए जांच किया गया जहां THF = (APE1 के लिए एक सब्सट्रेट) tetrahydrofuran और Hx है = hypoxanthine (MPG लिए एक सब्सट्रेट) . नोट: चित्रा 3 (THF सब्सट्रेट), LN428/MPG lysates से परिणाम एक कम अधिकतम पूर्ण प्रतिदीप्ति दिखाने LN428 lysates की तुलना में. यह एक कम बीकन निवेश के रूप में Tmax मूल्यों (3.3a देखें) का उपयोग कर निर्धारित मूल्य का परिणाम है. जब यह कम मूल्य के लिए परिणामों को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, यह साजिश में एक बड़े परिवर्तन में परिणाम है. यह अच्छी तरह से सामान्य डेटा के महत्व को दिखाता है. अकेले पूर्ण प्रतिदीप्ति मूल्यों की साजिश रचने repa सुझाव देना चाहूँगाLN428 और LN428/MPG कोशिकाओं के बीच ir दरें अलग हैं. हालांकि, जब डेटा अच्छी तरह से अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता पर विचार करने के लिए सामान्य है, APE1 की मध्यस्थता मरम्मत दर अंतर को कम से कम होना दिखाया गया है.

    5. प्रतिनिधि परिणाम

    हम मात्रात्मक, से डीएनए glycosylase और सेल परमाणु lysates में एपी endonuclease गतिविधियों के वास्तविक समय की माप के आधार काटना की मरम्मत (BER) आणविक बीकन्स (चित्रा 1) का उपयोग के लिए एक विधि का वर्णन करता है. एक बार annealed, हम अपने आणविक बीकन के एक गुणवत्ता मूल्यांकन (चित्रा 2) के रूप में पिघल वक्र विश्लेषण (तालिका 1) प्रदर्शन का सुझाव देते हैं. परमाणु lysates तो तैयार हो सकते हैं, तालिका 2 में सूचीबद्ध बफर घटकों का उपयोग कर. 90 मिनट के लिए 4 में 0.5 एल डायलिसिस पूर्व ठंडा बफर में lysate Dialyze डिग्री सेल्सियस कोमल डायलिसिस 3 तालिका में सूचीबद्ध बफर के खिलाफ Pierce स्लाइड एक Lyzer डायलिसिस कैसेट का उपयोग सरगर्मी के साथ. लीजिएdialyzed डायलिसिस एक सिरिंज का उपयोग कैसेट से परमाणु प्रोटीन समाधान. एक अलग गैसकेट से पहले डायलिसिस कैसेट में प्रोटीन इंजेक्षन का उपयोग करें. Dialyzed मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्रोटीन की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. उम्मीद परमाणु lysate सांद्रता का उदाहरण तालिका 4 में दिखाया जाता है. भागो प्रतिक्रिया के रूप में उपर्युक्त (3.4 कदम), थाली लेआउट का उपयोग कर के रूप में 5 तालिका में दिखाया गया. दो ट्यूमर सेल lysates विश्लेषण का एक प्रतिनिधि: LN428, मिथाइल प्यूरीन डीएनए (MPG) glycosylase और LN428/MPG, एक ही सेल लाइन MPG का ऊंचा अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर की undetectable स्तर के साथ एक glioma सेल लाइन, दोनों सेल लाइनों एपी के बराबर स्तर पर है endonuclease 1 (APE1) 1,2. प्रत्येक APE1 गतिविधि और MPG गतिविधि संख्या THF आण्विक बीकन (चित्रा 3) और हिट Hx आण्विक बीकन (चित्रा 4), जहां THF = (APE1 के लिए एक सब्सट्रेट) tetrahydrofuran और Hx = hypoxanthine का उपयोग कर के लिए जांच गया(MPG के लिए एक सब्सट्रेट). अंत में, एक संख्या ड्यू / एक आण्विक बीकन का उपयोग कर कि uracil glycosylase गतिविधि पर रिपोर्ट, हम बताते हैं कि प्रोटीन की 10μg पर संकेत उत्पादन या सिग्नल की शक्ति अधिक से अधिक है और प्रोटीन की 0.62 μg (चित्रा 5) पर एक से undetectable स्तर कम हो जाती है.

    चित्रा 1
    आकृति 1. संख्या आण्विक बीकन के समग्र संरचना दिखाया गया है. अनुक्रम और संख्या आण्विक इस के साथ साथ एक एकल असहाय अणु के रूप में इस्तेमाल किया Beacons के समग्र डिजाइन annealing के बाद और फिर से पिघलने के बाद, है. Bolded, अनुक्रम की तिर्छा भाग स्टेम (15 कुर्सियां) और अनुक्रम का रेखांकित भाग पाश (13 कुर्सियां) है. और Dabcyl = 5 'फ्लोरोसेंट रंजक 6 Carboxyfluorescein [;:; 20,960 विलुप्त होने के गुणांक (absorbance के अधिकतम पर) 75,000 Abmax = 495 एनएम, Emmax = 520 एनएम, विलुप्त होने (260 एनएम) गुणांक 5'end पर परिवार '3 शमन एजेंट थपका cyl [पर 3'end Abmax = 453 एनएम, शमन रेंज = 425-520 एनएम] एक्स = घाव (बदलता है अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है) और वाई = घाव विपरीत आधार बदलता है अनुसंधान के सवाल पर निर्भर करता है. .

    चित्रा 2
    चित्रा 2. वक्र पिगलो एक प्रतिनिधि पिघलने वक्र संख्या आण्विक बीकन नियंत्रण के लिए दिखाया गया है (ए), और हिट आण्विक tetrahydrofuran (THF) (बी) आधा भाग या Hypoxanthine आधा भाग (Hx) (सी) युक्त Beacons. Oligonucleotide सांद्रता 0 (गहरे नीले) एनएम, 8 एनएम (लाल), 16 एनएम (हरा), 32 एनएम (बैंगनी), 64 एनएम 128 एनएम (नारंगी) के लिए नीले रंग से लेकर. 1.3 चरण में वर्णित है, annealed oligonucleotides के 25 से गरम डिग्री सेल्सियस 95 के लिए डिग्री सेल्सियस 0.5 डिग्री सेल्सियस अंतराल और StepOnePlus प्रणाली के प्रत्येक 0.5 डिग्री सेल्सियस अंतराल पर परिवार प्रतिदीप्ति उपाय क्रमादेशित है.

    "सामग्री> चित्रा 3
    चित्रा 3. प्रतिनिधि हिट THF आण्विक बीकन का उपयोग कर डेटा. एपी endonuclease चलन - अक्षमता संबंधी अथवा चलन अक्षम साइट अनुरूप tetrahydrofuran (THF) की hydrolysis के लिए विशिष्ट गतिविधि नियंत्रण कक्ष (LN428) लाइन और MPG अधिक अभिव्यक्ति सेल लाइन (LN428/MPG) के से परमाणु lysates में मापा गया था . या हिट THF आण्विक बीकन (LN428, नीले, LN428/MPG, लाल), प्रत्येक lysate या तो हिट आण्विक बीकन (LN428/MPG, LN428 बैंगनी, हरे रंग का) नियंत्रण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. परिणाम के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं (ए) का मतलब यह प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया इकाइयों और (ख) एक ही डेटा बीकन इनपुट के लिए सामान्य रूप में ऊपर धारा 4 (THF tetrahydrofuran =) में वर्णित है.

    चित्रा 4
    चित्रा 4. प्रतिनिधि संख्या Hx आण्विक बीकन डीएनए glycosylase गतिविधि MPG सब्सट्रेट घंटे के हटाने के लिए विशिष्ट का उपयोग डेटाypoxanthine (Hx) नियंत्रण कक्ष (LN428) लाइन और अधिक अभिव्यक्ति MPG सेल लाइन (LN428/MPG) से परमाणु lysates में मापा गया था. या हिट Hx आण्विक बीकन (LN428, नीले, LN428/MPG, लाल), प्रत्येक lysate या तो हिट आण्विक बीकन (LN428/MPG, LN428 बैंगनी, हरे रंग का) नियंत्रण का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था. परिणाम के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं (ए) मतलब यह प्रतिदीप्ति प्रतिक्रिया इकाइयों और (ख) एक ही सामान्य रूप में (Hx = hypoxanthine) ऊपर धारा 4 में वर्णित डेटा.

    चित्रा 5
    चित्रा 5. प्रतिनिधि हिट ड्यू / विभिन्न प्रोटीन के स्तर पर आणविक बीकन का उपयोग कर डेटा डीएनए (UNG) glycosylase गतिविधि uracil (ड्यू / ए) को हटाने के लिए विशिष्ट है. T98G कोशिकाओं से परमाणु lysates में मापा गया था. T98G lysate या तो हिट आण्विक बीकन नियंत्रण या हिट ड्यू / एक आण्विक बीकन प्रोटीन के स्तर से 10, 5, 2.5, 1.25 या 0.62 μg, का उपयोग विश्लेषण किया गया था, के रूप में च में संकेत दियाigure. परिणाम सामान्यीकृत डेटा के रूप में ऊपर धारा 4 में वर्णित हैं.

    बीकन की एकाग्रता (एनएम) 0 8 16 32 64 128
    आणविक बीकन काम कर समाधान (200nm) (μL) जोड़ा 0 1 2 4 8 16
    प्रासंगिकता प्रतिक्रिया बफर (डीटीटी w / ओ) (μL) 25 24 23 21 17 9

    तालिका 1. एक पिघल वक्र प्रयोग के लेआउट.

    1 एल कुल स्टॉक समाधान की मात्रा की जरूरत कांग्रेस. स्टॉक समाधान अंतिम कोन.
    HEPES - KOH 25 एमएल 1M pH7.8 25 मिमी </ P>
    KCl 75 एमएल 2 एम 150 मिमी
    EDTA 1 एमएल 0.5m pH8.0 0.5 मिमी
    ग्लिसरॉल 10 मिलीलीटर N / A 1%
    डीटीटी (प्रयोग करने से पहले जोड़) 0.5 एमएल एम 1 0.5 मिमी
    एच 2 हे 888.5 एमएल N / A N / A

    तालिका 2. संख्या प्रतिक्रिया बफर.

    1 एल कुल स्टॉक समाधान की मात्रा की जरूरत कांग्रेस. स्टॉक समाधान अंतिम कोन.
    HEPES - KOH 50 मिलीलीटर 1M pH7.5 50 मिमी
    KCl 50 मिलीलीटर 2 एम 100 मिमी
    EDTA 1 एमएल 0.5m pH8.0 0.5 मिमी
    ग्लिसरॉल 200 एमएल N / A 20%
    डीटीटी (प्रयोग करने से पहले जोड़) 1 एमएल एम 1 1 मिमी
    एच 2 हे 698 एमएल N / A N / A

    तालिका 3. डायलिसिस बफर.

    सेल लाइन प्रोटीन एकाग्रता (μg / μL)
    LN428 5.34
    LN428/MPG 4.79

    तालिका 4. प्रोटीन निर्धारण परिणाम.

    नकारात्मक नियंत्रण 25μL संख्या बफर (पृष्ठभूमि नियंत्रण) 20μL संख्या बफर
    5μL कोन बीकन
    सं lysate
    <(तीन प्रतियों में टेस्ट)br /> 15μL संख्या बफर
    5μL कोन बीकन
    5μL LN428 lysate
    (तीन प्रतियों में टेस्ट)
    15μL संख्या बफर
    5μL कोन बीकन
    5μL LN428/MPG lysate
    नकारात्मक नियंत्रण 25μL संख्या बफर (पृष्ठभूमि नियंत्रण) 20μL संख्या बफर
    5μL THF बीकन
    सं lysate
    तीन प्रतियों में (टेस्ट) 15μL संख्या बफर
    5μL THF बीकन
    5μL LN428 lysate
    तीन प्रतियों में (टेस्ट) 15μL संख्या बफर
    5μL THF बीकन
    5μL LN428/MPG lysate
    नकारात्मक नियंत्रण
    20μL संख्या बफर
    5μL lysate
    (पृष्ठभूमि नियंत्रण) 20μL संख्या बफर
    5μL Hx बीकन
    सं lysate
    (तीन प्रतियों में टेस्ट)
    15μL संख्या बफर
    5μL Hx बीकन
    5μL LN428 lysate
    तीन प्रतियों में (टेस्ट) 15μL संख्या बफर
    5μL Hx बीकन
    5μL LN428/MPG Lyऊबाना
    नकारात्मक नियंत्रण
    20μL संख्या बफर
    5μL lysate

    सारणी 5. आणविक बीकन परख सेट अप.

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    Discussion

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    वहाँ का पता लगाने और बढ़ाता कई अणु और helicase गतिविधि 6, डीएनए पोलीमरेज़ गतिविधि 7,8, डीएनए ligase गतिविधि 9, गतिविधि टेलोमिरेज दस, डीएनए photolyase 11 गतिविधि और / डीएनए सहित enzymatic गतिविधियों, के लिए 600 शब्द 'आणविक बीकन' का उपयोग कर प्रशंसा पत्र से अधिक कर रहे हैं कई अन्य लोगों के बीच 12 संकर, शाही सेना. डीएनए की मरम्मत के ऊपर सूचीबद्ध गतिविधियों की माप के लिए आणविक बीकन के उपयोग के अलावा, और हम दूसरों को हिट 1,2,13-15 गतिविधि के विश्लेषण के लिए इन जांच की उपयोगिता का प्रदर्शन किया है.

    प्रासंगिकता वास्तविक समय गतिविधि परख हम यहाँ वर्णन एक एकल संशोधित आधार शामिल है और घाव विपरीत आधार में अलग घावों या परिवर्तन के लिए BER दर के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. आवेदन आणविक यंत्रवत अध्ययनों से अवरोध करनेवाला स्क्रीन करने के लिए रेंज कर सकते हैं. हम लाइसा तुलना द्वारा हिट विशिष्टता का प्रदर्शनMPG से tes गैर व्यक्त कोशिकाओं और नियंत्रण बीकन्स में गतिविधि की कमी के साथ कोशिकाओं को व्यक्त. बेहद संवेदनशील परख है, अनुमति संख्या प्रोटीन MPG 2 1 या XRCC1 की अभिव्यक्ति में दोष का पता लगाने और [तैयारी में पांडुलिपि] डीएनए की मरम्मत गतिज मानकों में मामूली परिवर्तन और डीएनए की मरम्मत inhibitors की प्रभावकारिता का पता लगाने के लिए पर्याप्त है. एकाधिक सक्रिय मरम्मत समय समर्थन गतिज दर और उन गतिज दरों में कोई परिवर्तन में महत्व की गणना भर पढ़ता है. प्रासंगिकता आणविक बीकन परख इसलिए डीएनए की मरम्मत एंजाइम inhibitors (अवरोध करनेवाला स्क्रीन) के लिए या व्यक्ति परमाणु के घटकों की भूमिका पर अध्ययन के लिए उच्च throughput स्क्रीन करने के लिए अध्ययन के लिए उपयुक्त है. परमाणु lysates का विश्लेषण संख्या परिसर के पूरे संदर्भ में डीएनए की मरम्मत का आकलन इसलिए भी अप्रत्यक्ष संख्या मशीनरी (उदाहरण के लिए, के बाद अनुवाद संशोधन या परिवर्तन) पर या परिवर्तन के प्रभावों का चित्रण करने की अनुमति देता है.

    प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित है, अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और मात्रात्मक परिणाम उपज चाहिए. हालांकि, वहाँ कई विवरण के लिए उचित विश्लेषण सुनिश्चित करने पर विचार कर रहे हैं: (1) नकारात्मक नियंत्रण की पृष्ठभूमि मान भी अधिक हो सकता है: यह बुरा भंडारण या प्रोटोकॉल के निर्माण के कारण हो सकता है. बीकन के बिना lysates में उच्च पृष्ठभूमि मूल्यों confounding ऑटो प्रतिदीप्ति (बहिर्जात फ्लोरोसेंट प्रोटीन के संक्रमण या सेलुलर अभिव्यक्ति द्वारा यानी) से संकेत मिलता है. यदि एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति अपरिहार्य है, रिपोर्टर डाई और फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए / उत्तेजना उत्सर्जन स्पेक्ट्रा ओवरलैप नहीं सकता है, (2) FL (Tmax) कम है डीएनए एकाग्रता अलग से दिया है. उदाहरण के लिए spectrophotometry द्वारा डीएनए एकाग्रता (260nm आयुध डिपो) की जाँच करें, Nanodrop का उपयोग कर. कम FL (Tmax) के साथ उच्च डीएनए एकाग्रता बीकन्स पर एक अपर्याप्त परिवार लोड हो रहा है इंगित करता है. HPLC शोधन है असंशोधित डीएनए (ऊपर देखें) के साथ संक्रमण से बचाता है, (3) मरम्मत गतिविधि गरीब है: यदि FL (Tmax) मूल्यों परअंतिम चक्र पर्याप्त बीकन इनपुट और प्रतिदीप्ति का पता लगाने का संकेत है, यह सुझाव दे सकता है कि परमाणु निकालने की तैयारी में विफल रहा है. परमाणु निकालने की गुणवत्ता महत्वपूर्ण है. यहां तक ​​कि बहुत कम नमूने के कमरे के तापमान को जोखिम विश्लेषण करने के लिए पहले की मरम्मत शुरू की: कम तापमान लंबी अवधि के भंडारण में -80 डिग्री सेल्सियस (4) मरम्मत गतिविधि घटता उच्च मूल्यों के साथ आरंभ है सहित प्रक्रिया के दौरान आश्वासन दिया जाना चाहिए. हर समय शांत रखें.

    इस बेहद संवेदनशील और मात्रात्मक संख्या परख भी शुट्ठ प्रोटीन, आणविक बीकन्स के अनुसार बदलकर सब्सट्रेट विशिष्टता पर अध्ययन को सक्षम करने का विश्लेषण करने के लिए लागू है. अंत में, परख ट्यूमर और ऊतकों lysates का विश्लेषण करने के लिए लागू है, एक प्रतिक्रिया या चिकित्सीय प्रभावकारिता की बायोमार्कर के रूप में कार्यात्मक डीएनए मरम्मत endpoints के उपाय के रूप में हम alkylating एजेंट 2 temozolomide की PARP1 अवरोध करनेवाला potentiation के लिए ट्यूमर के मूल्यांकन के लिए सुझाव दिया है करने का अवसर प्रदान करते हैं.

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    Disclosures

    RWS Trevigen, लेखकों के बाकी की घोषणा है कि ब्याज की कोई संघर्ष कर रहे हैं, Inc एक वैज्ञानिक सलाहकार है.

    Acknowledgments

    RWS के लिए यह काम पिट्सबर्ग फाउंडेशन और राष्ट्रीय संस्थानों स्वास्थ्य के (NIH) के; CA148629 ES019498 GM087798] से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. UPCI lentiviral सुविधा के लिए समर्थन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान से कैंसर केंद्र सहायता अनुदान द्वारा RWS के लिए प्रदान किया गया. [CA047904 p30] समर्थन भी पिट्सबर्ग विश्वविद्यालय औषध विभाग और रासायनिक डी एस के लिए जीवविज्ञान के द्वारा प्रदान किया गया. समर्थन भी CV को ESTRO द्वारा प्रदान किया गया था.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Potassium Chloride Fisher P217-500 Molecular grade
    EDTA Fisher BP120-500
    Glycerol Fisher BP229-1 Molecular grade
    DTT Fisher BP172-5
    HEPES- Solution Invitrogen 15630
    HEPES-Salt Sigma H4034-500G
    Potassium Hydroxide Sigma 17-8
    0.22μM filter Nalgene 167-0020
    Slide-A-Lyzer Dialysis Products Pierce 66373 MW 7000
    Syringe Fisher 309659
    Needle Fisher 305196
    1.5 mL Microcentrifuge Tubes Fisher 05-408-129 Black
    15 mL Falcon Tubes Fisher 352097
    NucBuster Protein Extraction Kit Calbiochem 71183
    PBS Invitrogen 14190
    Molecular Beacons IDT
    BioRad Protein assay dye reagent concentrate BioRad Cat# 500-0006

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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    मात्रात्मक, सेल lysates घाव विशेष आण्विक Beacons उपयोग में वास्तविक समय बेस छांटना मरम्मत गतिविधि का विश्लेषण
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    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).More

    Svilar, D., Vens, C., Sobol, R. W. Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons. J. Vis. Exp. (66), e4168, doi:10.3791/4168 (2012).

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