Summary
Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysat. Analysen ger hastigheter av DNA-reparation aktivitet som lämpar sig för kinetisk analys och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnad och lysat tumör eller med renade proteiner.
Abstract
Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysaten med bas excision reparation (BER) molekylära fyrar. Substratet (signal) består av en deoxioligonukleotid med en enda bas lesion med en 6-karboxifluorescein (6-FAM) grupp konjugerad till 5'-änden och en Dabcyl grupp konjugerad till 3'-änden av oligonukleotiden. BER molekylära fyren är 43 baser i längd och sekvensen är utformad för att gynna bildandet av en stam-loop struktur med 13 nukleotider i slingan och 15 baspar i stammen 1,2. När den är hopfälld i denna konfiguration 6-FAM-delen avbryts genom Dabcyl i en icke-fluorescerande sätt via Förster-energiöverföring (FRET) 3,4. Lesionen är placerad så att efter avlägsnande bas lesion och strängen klyvning återstående 5 bas oligonukleotid innehållande 6-FAM-delen frigörs från skaftet. Släpp ennd avskildhet från släckningsenheten (Dabcyl) resulterar i en ökning av fluorescens som står i proportion till nivån på DNA-reparation. Genom att samla flera läser av fluorescens värden är i realtid bedömning av BER verksamheten möjlig. Användningen av standard kvantitativ realtids-PCR-instrument medger samtidig analys av flera prov. Utformningen av dessa BER molekylära fyrar, med en enda bas lesion, är mottaglig för kinetiska analyser, BER kvantifiering och hämmare validering och är anpassningsbar för kvantifiering av DNA-reparation aktivitet i vävnader och tumör cellysater eller med renad proteiner. Analysen av gruppundantagsförordningen aktivitet i tumör lysat eller vävnad aspirerar som använder dessa molekylära fyrar kan vara tillämpliga på funktionella biomarkör mätningar. Vidare tillhandahåller analys av BER aktivitet med renade proteiner med användning av denna kvantitativ analys en snabb, högeffektiv metod för upptäckt och validering av BER-inhibitorer.
Protocol
1. Molekylär design Beacon
1,1 Utforma och beställa din molekylära beacon
Utformningen av din molekylär ledstjärna måste tänka på följande:
- Vi har goda resultat med 43-mer-DNA oligonukleotider. GC-innehåll bör vara> 32%. Utesluta en G bas vid 5'-änden.
- Begäran 6-FAM (6-karboxifluorescein) konjugering på 5'-änden och Dabcyl som en 3 'modifiering.
- Positionen av lesionen bör ligga på basen # 6 från 5 'änden.
- Längden av stammen eller hårnålen duplex bör vara minst 15 bp.
- Den rekommenderade öglelängden är 13 baser.
- Den totala strukturen av fyrsignalen som visas i figur 1.
- När sekvensen och lesionen typ avgörs, kan oligonukleotiden beställas från de flesta Oligonukleotid företag. Vi beställer våra oligonukleotider från IDT och begära att de oligonukleotider är HPLC renade och provided som ett pulver eller i en torkad form.
1,2 Glödgning din molekylär fyr
- Lös lyofiliserade DNA-oligonukleotider i Oligo utspädningsbuffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,1 mM EDTA) för att ge en koncentrerad lösning Molecular Beacon lager av 40 | iM.
- Förbered en 200 nM Molecular Beacon arbetslösning från 40 M Molecular Beacon stamlösning med BER reaktionsbuffert (se nedan). Lägg till 200 nM Molecular Beacon fungerande lösning till en steril svart 1,5 ml rör.
- Inkubera röret innehållande 200 nM Molecular Beacon arbetslösning i en stor bägare med kokande vatten under 3 minuter.
- Efter 3 minuter, avlägsna bägaren från värmekällan och inkubera Molecular Beacons i vatten över natten för att främja härdning. Använda värme-isolerande material både över och under bägaren för att sakta kylprocessen.
- Alikvot Beacons till sterila, svarta 1,5 ml rör och 100 | il för varje rör.
- Lagra vid -30 ° C.
1,3 Kvalitetsbedömning av din molekylär beacon
- Gör en smälta kurva analys för att bekräfta att BER molekylära beacons inte fluorescerar förrän uppvärmd, för att bestämma den optimala smälttemperatur och att bekräfta att varje ledstjärna kommer fluorescera vid upphettning.
- För varje fyr tillsätt den indikerade mängden av 200 nM Molecular Beacon arbetslösningen och BER reaktionsbuffert, såsom anges i tabell 1, att 6 brunnar i en snabb optisk 96-brunnsplatta (Applied Biosystems, Kat # 4.346.906).
- Använd en realtids-PCR instrument som en StepOnePlus (Applied Biosystems) system eller liknande för att övervaka FAM-färg excitation under smältan kurvan analysen.
- Programmera din realtids-PCR instrument (StepOnePlus system) för att övervaka FAM färgämne excitation som en funktion av ökande temperatur i små steg för smälta kurvan analys. Den StepOnePlus är programmerat för att mäta FAM fluoresceraNCE och ramp från 25 ° C till 95 ° C i 0,5 ° C intervall. En typisk smälta kurva visas i fig. 2.
- Liten eller ingen bakgrundsfluorescens bör vara synlig vid temperaturer under 50 ° C. Kontrollera om en enhetlig och kraftig ökning av fluorescens indikativ av rena och högkvalitativa fyrar. Tm-värden i närheten av 60 ° C till 80 ° C är gynnsamma och bör vara lika för alla spädningar.
- Bestämma Tmax, den temperatur vid maximal fluorescens [fl (max)] värden, från denna analys. Av om de fluorescensvärdena vid T m eller T max för att fyren ingång (koncentrationen) bör vara linjär. Fluorescensen värdet vid Tmax, Fl (max), bör överstiga bakgrundsvärdena vid 37 ° C i minst 5-faldigt.
2. Nukleär lysat Framställning
2,1 Base excision reparation reaktionsbuffert 5 förberedelser
- Lägg till alla uppräknade komponenteri tabell 2 och bringa volymen i bufferten till 900 ml med ddHaO 2 O.
- Justera pH till 7,8 med användning av kaliumhydroxid 8,0 N (Sigma, Cat # 17-8).
- Bringa volymen hos bufferten till 1000 ml med användning av ddHaO 2 O.
- Filtrera buffert med användning av 0,22 ^ M filter Nalgene 1 L-filter (kat # 167-0020).
- Lägg Ditiotreitol (DTT) omedelbart innan du använder bufferten BER reaktion.
2,2 Cell kultur och cellisolering
- Det föreslås att odla celler till 90-100% konfluens. Isolera celler från 4-6 rätter (150 mm) för att erhålla tillräcklig kärnkraft lysat för en full uppsättning av analyser (ca 5 x 10 7 celler totalt).
- Det rekommenderas att förbereda 3 oberoende kulturer för 3 oberoende cellpelletar att få biologiska replikat för varje analys.
- Nukleära lysat framställs lätt med användning av förfarandet NucBuster isolering (EMD Bioscience Calbiochem katalognr 71.183-3) althgrundlig någon kärnteknisk isolering protokoll skulle vara lämpligt (se nedan, avsnitt 2,3.).
2,3 Nuclear lysat framställning
- Före start, är en lyofiliserad blandning av proteashämmare (Calbiochem, Cat # 539.131, Set 1) först återsuspenderades i 100 | il sterilt vatten för att framställa en 100x lager. Använd omedelbart eller frysas i alikvoter vid -20 ° C under långtidslagring. Beräkna 1 pl av 100x lager för varje 10 extraherade 7 celler som behövs.
- Alla steg under extraktionen bör utföras på is eller vid 4 ° C för att säkerställa proteinstabilitet.
- Label 15 ml Falcon rör och placera på is.
- Avlägsna tillväxtmediet från celler och tvätta två gånger med 7,5 ml kall PBS.
- Tillsätt 5 ml kall PBS till varje skål och celler skrapa från plattan med en cell lyftare. Överföra cellerna till den kylda 15 ml Falcon-rör.
- Centrifugera vid låg hastighet (500x g, 4 ° C) under 5 minuter. Avlägsna supernatantenoch uppskatta hematokritvärdet i jämförelse. (Upp till 250 | il packad cellvolym kan bearbetas i en enda 1,5 ml rör)
- Centrifug under ytterligare 1 minut vid 500x g och avlägsna den återstående PBS med en pipett. Resuspendera cellpelleten i NucBuster extraktionsreagens 1 i enlighet med storleken av den packade cellvolymen: 150 | il NucBuster extraktionsreagens 1 per 50 | il packad cellvolym. (Alternativt kan cellpelleten vara djupfrysta på torris eller med flytande kväve och lagrades vid -80 ° C tills de ska fortskrida).
- Efter resuspension, överföra lysatet till en i förväg kyld 1,5 ml rör.
- Virvel 15 sek vid hög hastighet, inkubera på is i 5 minuter, och virveln igen 15 sek vid hög hastighet.
- Centrifugera vid 13.000 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Supernatanten innehåller cytoplasmisk fraktion. Ta bort och förvara vid -80 ° C eller kasta.
- Återsuspendera pelleten i en blandning av 1 pl av återsuspenderade 100x proteasinhibitorcocktail, 1 & mu, l av 100 mM DTT och 75 pl NucBuster Extraktion reagens 2 per 50 | il packad cellvolym.
- Virvel 15 sek vid hög hastighet, inkubera på is i 5 minuter, och återigen virvel 15 sek vid hög hastighet.
- Centrifugera vid 13.000 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Supernatanten innehåller nukleära proteiner. Samla supernatanten och gå vidare till nästa steg.
2,4 Dialys, protein kvantifiering och alikvotering
- Alla steg under dialys bör utföras med i förväg kylda lösningar, material och utrustning för att säkerställa extrakt kvalitet.
- Förbered dialysbuffert (1 L krävs per prov) enligt beskrivningen i tabell 3. Viktiga: Buffert bör vara kall (4 ° C). Vi föreslår att förbereda åtminstone dagen innan. Filtrerades dialysbuffert kan lagras vid 4 ° C på obestämd tid om DTT inte har tillsatts.
- Pre-chill bägare (2 av 1 L bägare per prov), dialysbuffert, dialys kammare, mikro-centrifugrör, sprutor och kanyler.
- Precis innan användning - tillsätt 1 ml 1 M DTT per liter dialysbuffert.
- Dialysera lysat framställt i Steg 2,3 i 0,5 L förväg kyld dialysbuffert under 90 minuter vid 4 ° C med försiktig omröring med användning av en PIERCE Slide-A-analysatorn Dialys kassett (0,5-3 ml dialys kassetter med 7000 MW cutoff).
- Överföra dialyskassett med en andra bägare innehållande 0,5 L förväg kyld dialysbuffert och dialysera-lysat under 90 minuter vid 4 ° C med försiktig omrörning.
- Uppsamla det dialyserade nukleära proteinlösningen från det dialyskassett med användning av en spruta (Fisher, kat # 309.659). Använd en annan packning än vad som tidigare använts för att injicera proteinet i dialys kassetten. Observera att extraktet kan ha kristalliserat på grund av höga proteinkoncentrationer. Försök att ta molniga söker kristaller när du tar bort dialyserade nukleära proteinet lösning.
- Alikvotera provet mikro-centrifugrör, 20 pl vardera. Snabb frysning på torr is och lagringe vid -80 ° C fram till användning.
- Bestämma koncentrationen av den dialyserade proteinet med användning av standardprotokoll. Exempel på förväntade nukleära lysat koncentrationer visas i tabell 4.
- Slutligen bör lysaten utvärderas för kvalitetskontroll. Bedömningen av lysaten kommer att variera med experimentet. Såsom beskrivits tidigare, analyserar vi rutinmässigt lysat för expression av flera BER proteiner via immunoblot 1,2.
- Dialysen steg används för att göra en enhetlig reaktionslösningen över cell-linjer för att underlätta jämförelse. Med utelämnande av dialys steg kan påverka enzymatiska och kinetiska analyser eftersom saltlösningar och reaktionsbetingelser är inte längre enhetlig i de olika cellinjerna och preparat på grund av de olika nödvändiga spädningarna. Vi har emellertid observerat att användning av lysat av större än 5 pg / pl och tillsätta tillräckligt med reaktionsbuffert medger utelämnande av dialys steg (data ej visade). För hämmare studier thvid inte kräver jämförelse mellan olika cell-lysat kan dialys inte vara nödvändigt. Vi rekommenderar dock dialys som anges.
3. Molekylär Beacon Analys
3.1 Krav på utrustningen
- En kvantitativ realtids-PCR instrument, såsom StepOnePlus QRT-PCR eller därmed jämförlig, eller en 96-brunnars platta fluorometer kapabel att detektera och mäta FAM fluorescens i realtid. Obs: Detta förfarande är tillämpligt på varje maskin kan läsa fluorescens värdena för fyrarna och spela dem i realtid. Maskinen bör dock tillåta användaren att komma åt råa fluorescens värdena för dataanalys.
- Centrifugera kompatibel med optiska QRT-PCR-rör eller plattor som används.
- Microsoft Excel för att analysera insamlade data.
3,2 Buffertar och reagens
- Optiska QRT-PCR rör eller plattor med motsvarande omslag.
- BER reaktionsbuffert (se ettBove och tabell 2).
- Dialyserat nukleära proteinextrakt som framställts i steg 2.3 och 2,4 och späddes till 2 pg / il protein med BER reaktionsbuffert innehåller DTT.
- Molecular Beacons späddes till 200 | iM med BER reaktionsbuffert för att skapa den Molecular Beacons arbetslösning (se ovan).
3,3 Analys set-up (tabell 5)
- Den QRT-PCR maskin normalt inte används som en fluorimeter så run metoden måste ändras.
- Program ett första steg och ställ in reaktionstemperaturen till 37 ° C med en cykeltid (tidpunkter för mätningar) på 20 sek med ett minimum av 180 cykler (eller mer, beroende på reparation analysen design). Se till att samla in data under cyklerna. Därför kommer maskinen samla data varje 20 sekunder under totalt 1 timme.
- Skapa ett andra steg att ramperna temperaturen till Tmax den särskilda beacon, temperaturen med maximal fluorescens, som avskräckerbryts i steg 1,3 (Kvalitetsbedömning av din molekylär beacon). Cykeltiden bör återigen vara 20 sek med totalt 15 cykler. Detta kommer att samla in data var 20 sekund i 5 minuter vid maximal fluorescens möjligt av fyren. Fluorescensvärdena värden som uppmätts under de cykler vid Tmax används för att normalisera fluorescensvärdena i varje brunn (steg 4.2a). Om du använder flera olika beacons se till att omfatta åtgärder som ger liknande repetitiva värden för Tmax för dem beacons också.
- Ställa reaktionsvolymen till 25 | il.
- Set-up plattan designen på QRT-PCR maskinen med Applied Biosystems programvara. Vi bara är intresserade av de råa fluorescens värden så välj "Standard Curve" - experiment typ.
- Fyll plattan layout. Ett exempel visas i tabell 5. Lägger ingenting till brunnarna som valts ut som standardkurvan.
3,4 Kör-analys
- Important: Använd pre-kylda material och lösningar. Förvaras svalt tills vattnet och detektion.
- Tillsätt lämplig mängd av DTT till BER reaktionsbuffert som skall användas.
- Utspädd proteinlösning till en koncentration av 2 | ig / | il med användning av buffert BER reaktion (med DTT).
- För inledande experiment föreslår vi att använda 10 ng av dialyserat nukleär lysat per brunn (5 | il / brunn) och 1 pmol av substratet, den molekylära fyr vid en 40 nM slutlig koncentration (5 | il / brunn). Vi har konsekvent erhållna hög kvalitet och reproducerbara resultat med 10 pg av cellysat, även om det är möjligt att olika cellysat eller substrat beacon kan diktera högre eller lägre proteinkoncentrationer.
- Analyskomponenterna i varje brunn är 15 | il BER reaktionsbuffert, 5 | il fyr och 5 | il nukleär lysat. Körs varje ledstjärna / lysat kombinationen i tre exemplar.
- Flera negativa kontroller krävs för varje fyr, inklusive prover utan ledstjärna som 25 μ L av BER reaktionsbuffert enbart och 20 | il BER reaktionsbuffert med 5 pl lysat och 20 | il av BER reaktionsbuffert med 5 pl av fyr utan lysat.
- Flera kontrollprover krävs för varje kärnteknisk lysat. Dessa inkluderar en negativ kontroll [15 pl BER reaktionsbuffert, 5 pl kontrollen beacon (ingen skada) och 5 pl prov lysat]. Vi föreslår också att inkludera experimentella positiva kontroller såsom införande av THF innehållande fyrar som efterliknar abasiska webbplats med oligos och lätt anskäras [15 pl buffert BER reaktion 5 pl THF ledstjärna och 5 pl prov lysat]. Naturligtvis kommer den exakta positiva kontrollen beroende av den totala experimentella utformningen.
- Som ett exempel följer Tabell 5 nedan för plattan layouten.
- Pipettera i optiska rör eller plattor samtidigt på is eller kyld monter för att minimera reaktionen initiering innan signalen upptäckt.
- Pipettera BER reaktionsbuffert först i alla brunnar.
- Den n Pipettera fyrar enligt tallriksmodellen layout i rätt brunnar och alltid Pipettera lysaten sista i brunnar för att minimera reaktionen initiering innan signalen upptäckt.
- Slutna rör eller plåt grundligt, blanda och snurra med en centrifug för att samla lösningar till botten av rören eller platta
- Sätt plattan i QRT-PCR maskin och börja analysen.
- Efter avslutad, exportera rådata, helst i Excel-format. För StepOnePlus systemet endast flera komponenter data behövs. Denna innehåller alla de fluorescens värden på flera läser sorterade efter färg färg och väl.
4. Molekylär Beacon Analys Analys
Vi använde Microsoft Excel programvara för att utföra dessa analyser och beräkningar. Vi rekommenderar upprättandet mallar och makron som gör det möjligt enkel och snabb analys och visar diagrammet bygger på data från vanliga 96-väl format.
4,1 Borttagning av bakgrund
">4,2 Fl (Tmax) normalisering
För att hantera variationen i pipettering och fluorescensdetektering i olika brunnar, normaliserar vi data till maximal fluorescens värden (som korrelerar med fyren ingång).
- Beräkna de genomsnittliga fluorescensvärden av cykler vid Tmax för individuell brunn: Fl (Tmax) (steg 3.3aii).
- Beräkna nyckeltal Fl (cykel x) / Fl (T max) och multiplicera med 100. Under sannolikt antagandet att Fl (T max) motsvarar den största möjliga fluorescensvärdet när den är helt snittas dessa normaliserade data representerar% fritt FAM (=% BER anskäras beacon).
- Kombinera triplikatprov genom medelvärdesbildning data (% fri FAM) av de 3 brunnar för varje cykel (fram cykeln 180) och beräkna fel på varje.
- Beräkna tider genom att multiplicera 20 sek till varje cykel.
- Eftersom den väl till brunnar variansen i fluorescensdetektering kan vara betydande, rekommenderar vi att lägga till en fluorescerande färgämne, såsom ROX till molekylära ledstjärna materiel som fungerar som standard av att anpassa fluorescens värdena för de enskilda brunnarna. I detta fall skulle den ROX färgämne användas som en intern standard (passiv referens) i varje enskild brunn. ROXexcitations-och emissionsspektra (excitation - 588 nm, emission 608 nm) är skild från den för 6-FAM-färgämne som används i analysen (excitation - 495 nm, emission - 520 nm). Den ROX färgämnet skulle möjliggöra en normalisering steg liknar konventionella RT-PCR-förfaranden som möjliggör normalisering av väl till brunnar skillnader som kan uppstå på grund av artefakter. Dessa kan bero på pipetteringsfel eller kan härröra från well-to-bra variation i fluorescensdetektering effektivitet.
4,3 Plot
- Rita normaliserade fluorescensdata (% fri FAM) mot tid (i sek) i ett punktdiagram med motsvarande fel.
- Vi rekommenderar att analysera reparation kinetik i minst tre olika nukleära lysat preparat som representerar biologiska replikat. För att bedöma varians bör inter-experimentella fel beräknade från medelvärdena för varje enskild experiment visas.
- En representativ analys av två tumörcellinjer: lysat LN428, en gliomcellinjen med ej mätbara nivåer av metyl-purin DNA glykosylas (MPG) och LN428/MPG, samma cellinje konstruerad för förhöjt uttryck av MPG, båda cellinjer har likvärdiga nivåer av AP-endonukleas 1 (APE1) 1,2. Varje sonderades för APE1 aktivitet och MPG aktivitet med användning av Ber THF Molecular Beacon (figur 3) och BER Hx Molecular Beacon (figur 4), där THF = tetrahydrofuran (ett substrat för APE1) och Hx = hypoxantin (ett substrat för MPG) . Notera: I Figur 3 (THF substrat), är resultaten från de LN428/MPG lysaten visar en lägre maximala absoluta fluorescens jämfört med de LN428 lysat. Detta är ett resultat av en lägre fyr ingång värde bestämt med användning av Tmax-värden (se 3.3a). När detta lägre värde användes för att normalisera resultat, resulterar det i en stor förändring i ytan. Detta illustrerar fint vikten av att normalisera data. Plotta de absoluta fluorescensvärdena ensam skulle föreslå repair priser mellan LN428 och LN428/MPG celler är olika. Men när data normaliseras att överväga well-to-brunn variabilitet är APE1-medierade reparation kursdifferens visat sig vara minimal.
5. Representativa resultat
Vi beskriver en metod för kvantitativ realtids-mätning av DNA glykosylas och AP verksamheten endonukleas i cellnukleära lysaten med bas excision reparation (BER) Molecular Beacons (figur 1). När glödgat, föreslår vi att utföra en smälta kurva analys (tabell 1) som en kvalitetsbedömning av din molekylär beacon (Figur 2). Kärn-lysat kan då vara förberedd, med buffertlösningarna komponenter som anges i tabell 2. Dialysera lysatet i 0,5 L förväg kyld dialysbuffert under 90 minuter vid 4 ° C med försiktig omröring med användning av en PIERCE Slide-A-analysatorn Dialys kassetten mot dialysbuffert som anges i tabell 3. Samla uppdialyserat kärnprotein lösningen från dialyskassett med användning av en spruta. Använd en annan packning än vad som tidigare använts för att injicera proteinet i dialys kassetten. Bestämma koncentrationen av den dialyserade proteinet med användning av standardprotokoll. Exempel på förväntade nukleära lysat koncentrationer visas i tabell 4. Genomföra reaktionen enligt ovan (steg 3.4), med användning av plattan layouten som visas i tabell 5. En representant analys av två tumör cellysat: LN428, en gliomcellinje med ej mätbara nivåer av metyl-purin DNA glykosylas (MPG) och LN428/MPG, samma cellinje konstruerad för förhöjt uttryck av MPG, båda cellinjer har likvärdiga nivåer av AP endonukleas 1 (APE1) 1,2. Varje sonderades för APE1 aktivitet och MPG aktivitet med användning av Ber THF Molecular Beacon (figur 3) och BER Hx Molecular Beacon (figur 4), där THF = tetrahydrofuran (ett substrat för APE1) och Hx = hypoxantin(Ett substrat för MPG). Slutligen, med hjälp av en BER dU / A Molecular Beacon som rapporterar om uracil glykosylas verksamheten visar vi att utsignalen eller signal styrka är maximal vid 10 pg av protein och minskar till en odetekterbar nivå 0,62 ng protein (Figur 5).
Figur 1. Övergripande strukturen gruppundantagsförordningen Molecular Beacon. Visas är sekvensen och övergripande utformningen av BER Molecular Beacons används här som en enda molekyl, efter glödgning och igen efter smältning. Den fet, kursiv del av sekvensen är skaftet (15 baser) och den understrukna delen av sekvensen är slingan (13 baser). FAM = 5 'fluorescerande färgämnet 6-karboxifluorescein [om 5'-änden; Abmax = 495 nm, Emmax = 520 nm, extinktionskoefficient (260 nm): 20.960; extinktionskoefficient (vid absorbans max): 75 tusen] och Dabcyl = den 3 'släckningsmedel Dab cyl [om 3'-änden, Abmax = 453 nm, Släckning Range = 425-520 nm] X = lesionen (varierar beroende på frågeställningen) och Y = basen mittemot lesionen (varierar beroende på frågeställningen). .
Figur 2. Smälta kurva. En representativ smältkurva visas för BER Molecular Beacon Kontroll (A), och BER-Molecular Beacons innehållande tetrahydrofuran (THF)-grupp (B) eller hypoxantin (HX)-grupp (C). Oligonukleotid koncentrationer varierade från 0 nM (mörkblå), 8 nm (röd), 16 nM (grön), 32 nM (lila), 64 nM blå till 128 nM (orange). Såsom beskrivits i Steg 1,3, de hybridiserade oligonukleotiderna upphettades från 25 ° C till 95 ° C i 0,5 ° C intervall och StepOnePlus är programmerat för att mäta FAM fluorescens vid varje 0,5 ° C-intervallet.
Figur 3. Representativa data med användning av Ber THF Molecular Beacon. AP-endonukleas aktivitet specifik för hydrolys av det abasiska stället analoga tetrahydrofuran (THF) mättes med nukleära lysat från kontroll-cellinje (LN428) och MPG överuttryck cellinje (LN428/MPG) . Varje lysat analyserades med antingen BER Molecular Beacon Control (LN428, grön, LN428/MPG, lila) eller BER THF Molecular Beacon (LN428, blå, LN428/MPG, röd). Resultaten redovisas som (A) de genomsnittliga fluorescensenheter respons och (B) samma data normaliserades till Beacon ingång som beskrivs i avsnitt 4 ovan (THF = tetrahydrofuran).
Figur 4. Representativa data med hjälp av gruppundantagsförordningen Hx Molecular Beacon DNA glykosylas aktivitet specifik för avlägsnande av MPG underlaget hypoxanthine (Hx) mättes med nukleära lysat från kontroll-cellinje (LN428) och MPG överuttryck cellinje (LN428/MPG). Varje lysat analyserades med antingen BER Molecular Beacon Control (LN428, grön, LN428/MPG, lila) eller BER Hx Molecular Beacon (LN428, blå, LN428/MPG, röd). Resultaten redovisas som (A) de genomsnittliga fluorescensenheter respons och (B) samma data normaliseras enligt i avsnitt 4 ovan (Hx = hypoxantin).
Figur 5. Representativa data med användning av Ber dU / A Molecular Beacon vid olika halter av protein. DNA-glykosylas (UNG)-aktivitet som är specifik för avlägsnande av uracil (dU / A) mättes med nukleära lysat från T98G-celler. Den T98G Lysatet analyserades med antingen BER Molecular Beacon kontroll eller BER dU / A Molecular Beacon på proteinnivåer av 10, 5, 2,5, 1,25 eller 0,62 mikrogram, som anges i fIGUR. Resultaten är normaliserade data som beskrivs i avsnitt 4 ovan.
| Koncentration av Beacon (nM) | 0 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 |
| Molekylär Beacon arbetslösning (200 nM) tillsattes (pl) | 0 | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 |
| BER reaktionsbuffert (v / o DTT) (il) | 25 | 24 | 23 | 21 | 17 | 9 |
Tabell 1. Layout av en smälta kurva experiment.
| 1 L Total | Volymen av Stock lösning behövs | Con. lagerlösning | Final Con. |
| HEPES-KOH- | 25 ml | 1 M pH 7,8 | 25 mm </ Td> |
| KCl | 75 ml | 2 M | 150 mM |
| EDTA | 1 ml | 0,5 M pH 8,0 | 0,5 mM |
| Glycerol | 10 ml | N / A | 1% |
| DTT (lägg före användning) | 0,5 ml | 1 M | 0,5 mM |
| H 2 O | 888,5 ml | N / A | N / A |
Tabell 2. BER reaktionsbuffert.
| 1 L Total | Volymen av Stock lösning behövs | Con. lagerlösning | Final Con. |
| HEPES-KOH- | 50 ml | 1 M pH 7,5 | 50 mM |
| KCl | 50 ml | 2 M | 100 mM |
| EDTA | 1 ml | 0,5 M pH 8,0 | 0,5 mM |
| Glycerol | 200 ml | N / A | 20% |
| DTT (lägg före användning) | 1 ml | 1 M | 1 mM |
| H 2 O | 698 ml | N / A | N / A |
Tabell 3. Dialysbuffert.
| Cellinje | Proteinkoncentration (| ig / | il) |
| LN428 | 5,34 |
| LN428/MPG | 4,79 |
Tabell 4. Proteinbestämning resultat.
| Negativ kontroll 25 ^ BER Buffer | (Bakgrund Control) 20 | il BER buffert 5 pl Con Beacon NR lysat | (Test i tre exemplar) <br /> 15 ^ BER Buffer 5 pl Con Beacon 5 pl LN428 lysat | (Test i triplikat) 15 ^ BER Buffert 5 pl Con Beacon 5 pl LN428/MPG lysat |
| Negativ kontroll 25 ^ BER Buffer | (Bakgrund Control) 20 | il BER buffert 5 pl THF Beacon NR lysat | (Test i tre exemplar) 15 ^ BER buffert 5 pl THF Beacon 5 pl LN428 lysat | (Test i tre exemplar) 15 ^ BER buffert 5 pl THF Beacon 5 pl LN428/MPG lysat |
| Negativ kontroll 20 | il buffert BER 5 pl lysat | (Bakgrund Control) 20 | il BER buffert 5 pl Hx Beacon NR lysat | (Test i triplikat) 15 ^ BER Buffert 5 pl Hx Beacon 5 pl LN428 lysat | (Test i tre exemplar) 15 ^ BER buffert 5 pl Hx Beacon 5 pl LN428/MPG Lysatt |
| Negativ kontroll 20 | il buffert BER 5 pl lysat |
Tabell 5. Molekylär Beacon Analys set-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns över 600 citat använder termen "molekylära ledstjärna" för att upptäcka och kvantifiera många molekyler och enzymatiska aktiviteter, inklusive helikasaktivitet 6, DNA-polymeras aktivitet 7,8, DNA-ligas aktivitet 9, telomerasaktivitet 10, DNA photolyase aktivitet 11 och DNA / RNA-hybrider 12, bland många andra. Förutom användningen av molekylära fyrar för mätning av de aktiviteter DNA-reparation som anges ovan, har vi och andra visade användbarheten för dessa prober för analys av BER aktivitet 1,2,13-15.
I realtid BER aktivitetstestning beskriver vi här innehåller en enda modifierad bas och medger kvantitativ bedömning av BER priser för olika skador eller förändringar i basen mittemot lesionen. Ansökningar kan vara allt från molekylära mekanistiska studier till hämmare skärmar. Vi visat BER specificitet genom att jämföra Lysates från MPG uttryckande celler med icke-uttryckande celler och brist på aktivitet i kontrollen fyrarna. Analysen är mycket känslig, vilket gör att upptäcka defekter i uttryck av gruppundantagsförordningen proteiner MPG 2 eller XRCC1 1 och är tillräckligt för att upptäcka små förändringar i kinetiska DNA-reparation parametrar och effektiviteten av inhibitorer DNA-reparation [manuskript under utarbetande]. Flera läser hela aktiva reparationstiden stöd beräknas kinetiska priser och betydelse i några förändringar i dessa kinetiska priser. BER molekylära fyren analysen är därför lämplig för high-throughput studier till skärmen för enzymet DNA-reparation hämmare (hämmare skärmar) eller för studier av rollen av enskilda nukleära komponenter. Analysen av nukleära lysaten möjligt att bedöma om DNA-reparation i den fullständiga ramen för gruppundantagsförordningen komplexet därmed också visar indirekta förändringar eller påverkan på BER maskiner (t.ex. post-översättning ändringar eller mutationer).
Denprotokoll, såsom beskrivits, bör ge mycket reproducerbara och kvantitativa resultat. Det finns dock flera detaljer att tänka på att säkerställa en korrekt analys: (1) Bakgrund värden för negativa kontroller kan vara för hög: Detta kan bero på dålig förvaring eller tillverkning av oligonukleotiden. Höga bakgrundsvärden i lysaten utan fyrar visar förbryllande autofluorescens (dvs. förorening eller cellulära uttrycket av exogena fluorescerande proteiner). Om expression av en fluorescerande protein är oundviklig, kan excitering / emissions-spektra för rapportörmolekylen färgämne och fluorescerande proteinet överlappar inte, (2) Fl (Tmax) är låg: DNA-koncentrationen är annorlunda än ges. Kontrollera DNA-koncentrationen genom spektrofotometri (OD 260 nm) exempelvis med hjälp av NanoDrop. Hög DNA-koncentrationen med låg Fl (Tmax) anger otillräcklig FAM belastning på fyrarna. HPLC-rening förhindrar förorening med omodifierade DNA (se ovan), (3) Reparation aktivitet är dålig: Om FL (Tmax) värden vidde senaste cyklerna lämna tillräckliga ledstjärna ingång och fluorescensdetektering, kan detta tyder på att cellkärnextraktframställning misslyckades. Kärnextrakt kvalitet är avgörande. Låga temperaturer bör säkerställas under hela förfarandet, inklusive långtidsförvaring vid -80 ° C och (4) Reparation aktivitet kurvorna inleda med höga värden: Även mycket kort exponering av proverna till rumstemperatur före analys initierar reparation. Förvaras svalt hela tiden.
Denna mycket känslig och kvantitativ analys BER är också tillämpbar på analys av renat protein, vilket möjliggör studier av substratspecificitet genom att ändra den molekylära fyrar därefter. Slutligen, är analysen gäller för analysen av tumören och lysat vävnad, vilket ger en möjlighet att mäta funktionella slutpunkter DNA reparation biomarkörer för svar eller terapeutisk effekt, som vi har föreslagit för att utvärdera tumörer för PARP1 hämmare potentiering av alkyleringsmedlet temozolomid 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
RWS är en vetenskaplig rådgivare till Trevigen, Inc. Resten av författarna förklara att det inte finns några intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats med bidrag från Pittsburgh Foundation och National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] för att RWS. Stöd för UPCl Lentiviral Facility lämnades till RWS genom Cancer Support Grant från National Institutes of Health [P30 CA047904]. Stöd gavs också av University of Pittsburgh Institutionen för farmakologi och kemisk biologi DS. Stöd gavs också av ESTRO till CV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Potassium Chloride | Fisher | P217-500 | Molecular grade |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Molecular grade |
| DTT | Fisher | BP172-5 | |
| HEPES- Solution | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Salt | Sigma | H4034-500G | |
| Potassium Hydroxide | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filter | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer Dialysis Products | Pierce | 66373 | MW 7000 |
| Syringe | Fisher | 309659 | |
| Needle | Fisher | 305196 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher | 05-408-129 | Black |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher | 352097 | |
| NucBuster Protein Extraction Kit | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Molecular Beacons | IDT | ||
| BioRad Protein assay dye reagent concentrate | BioRad | Cat# 500-0006 |
References
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide. Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).
- Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).
- Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes. Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).
- Kreklau, E. L. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).
- Belon, C. A., Frick, D. N. Monitoring helicase activity with molecular beacons. BioTechniques. 45, 433-442 (2008).
- Ma, C. Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).
- Summerer, D., Marx, A. A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).
- Liu, L. Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase. The Analyst. 130, 350-357 (2005).
- Xiao, Y. Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity. J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).
- Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity. Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).
- Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).
- Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon. Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).
- Mirbahai, L. Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells. DNA Repair (Amst). , (2009).
- Maksimenko, A. A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities. Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).
