Summary
חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.
Abstract
Atherogenesis הוא potentiated על ידי הפרעות מטבוליות שתורמים למדינה מוגברת של דלקת מערכתית וכתוצאה מכך תפקוד האנדותל. עם זאת, שינויים תפקודיים מוקדמים האנדותל מסמנים כי רמת הסיכון של הפרט לא מוערכים ישירות קלינית לעזור האסטרטגיה מדריך טיפולי. יתר על כן, ויסות דלקת ידי ופרמטרים המודינמיים מקומיים תורם ההפצה הלא אקראית המרחבי של טרשת עורקים, אך המנגנונים קשה להתוות in vivo. אנו מתארים גישה מבוססת מעבדה על שבב כדי ההפרעות כמותית assay חילוף החומרים של אירועים דלקת בתאי אנדותל אנושיים (EC) ומונוציטים בתנאים תזרים מדויקות. שיטות סטנדרטיות של ליתוגרפיה רך משמשים microfabricate כלי הדם לתאי microfluidic כוזב (VMMC), אשר קשורים ישירות בתרבית monolayers EC. 1 מכשירים אלה יש את היתרון של שימוש בכמויות קטנות של חומרים כימיים תוךמתן במה הדמיה ישירות את האירועים דלקת קרום בבית של EC נחשף לשדה מוגדר היטב גזירה. יש לנו מיושם בהצלחה את המכשירים האלו לחקור ציטוקינים-2, שומנים בדם 3, 4 ו - 5 RAGE-Induced דלקת האנושי אבי העורקים EC (HAEC). כאן אנו מתעדים את השימוש VMMC לתא assay מתגלגל monocytic (THP-1) ומעצר על monolayers HAEC כי הם מותנים על פי מאפיינים גזירה דיפרנציאלי והופעל על ידי ציטוקינים דלקתיים TNF-α. מחקרים כגון אלה מספקים תובנה מכניסטית לתוך atherosusceptibility תחת גורמי סיכון מטבוליים.
Protocol
1. התא התרבות הכנת התשתית
- חותכים 3 אינץ' מצעים מעגליות של 100 x 20 מאכל רקמת התרבות מ"מ (BD פלקון) באמצעות מחרטה. לעקר מצעים ידי והשקיעה אתנול 70%. מקום בצלחת פטרי ומעיל עם קולגן 4 מ"ל סוג אני (100 מיקרוגרם / מ"ל) עבור שעות 1 בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן לשטוף עם 4 x 1 מ"ל PBS.
- להשעות אדם לתאי אנדותל אבי העורקים (HAEC, מעבר 4-6) בשעה 6.5x10 5 תאים למ"ל וזרעי על ידי יישום 1 מ"ל ישירות המצע. מקום 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור ולאפשר התאים להיצמד למצע עבור שעה 1.
- הוסף 9 מ"ל של צמיחה האנדותל בינוני-2 (EGM-2) להשלים את הפתרון לאנטיביוטיקה antimycotic 1x אל התאים. לשנות את התקשורת כל 2 ימים עד שהתאים מגיעים 90% confluency.
- לשמור על THP-1 התאים במדיום 1640 RPMI השלימו עם 10% FBS ו 1x לאנטיביוטיקה antimycotic פתרון. המעבר התאים כאשר הם מגיעים צפיפות 10 6 תאים למ"ל.
2. שירינג תא פרוטוקול
תאים מותנים ב מכשיר סלולרי מותאם אישית חרוט ו-צלחת הגז (CSD). פרטים התקנים והמפרטים עיצוב מתועדים טבלה 1, איור 4.
- הכן CSD. לעקר הדיור קאמרית עם אתנול ולשטוף עם PBS סטרילית. מחממים את הדיור ל 37 מעלות צלזיוס ורמת להבטיח חרוט ניצב monolayer התא. להרכיב את המצע עם תאים מן החלק התחתון של הדיור ולהגדיר חרוט לגובה הרצוי.
- השתמש ליבוביץ-15 (L-15) בינוני השלימו עם BulletKit האנדותל כמדיום הגז כדי לשמור על pH תקין בהעדר CO 2. כדי לעורר דלקת, נמק להוסיף הגידול גורם-α (TNF-α, 0.5 נ"ג / מ"ל) עד בינוני הגז ולהזריק 6 מ"ל במכשיר באמצעות מזרק מחובר ליציאת מפרצון, נזהר שלא להכניס אווירבועות החדר.
- תאים גזירה על מתח קבוע בעוצמה גבוהה גזירה (HSS, דיין 15 / ס"מ 2) או מאמץ גזירה oscillatory (OSS, 0 5 ± דיין / 2 ס"מ, 1 הרץ) עבור 4 שעות. אס הרצויה מושגת על ידי החלפה של קונוס מעל תאים, הנשלטת דווקא עם מנוע מיקרו דורך כפי שתואר קודם 6 אס הקיר על פני השטח (τ W) הוא מקורב על ידי.:
שם μ הוא צמיגות של המדיום, ω היא המהירות הזוויתית של החרוט, ו - α היא זווית קונוס (0.5 מעלות). יישור קונוס עם מצע מותאם בתוך 0.05 ° פילוס דרך הדיוק ואת גובה הפער נקבע על 20 ± 10 מיקרומטר באמצעות מד עומק למזער וריאציה ההיקפי ו רדיאלי ב τ W. המכשיר קיבל תוקף על מנת להבטיח זרימה למינרית מאפיינים. הסרה גאמות מהמכשיר ולהתכונן ניתוח של הידבקות מונוציטים.
3. ייצור של PDMS Microfluidic הקאמרית
- להשיג עובש אב המספר הרצוי ערוץ microfluidic וגובה ערוץ בהתאם ליישום. מאפייני העיצוב המסוים של פרוטוקול זה מפורטים בטבלה 1. שיטה ליצירת אלה כבר מתועד היטב בספרות. 1 בקצרה, רשת של תעלות נועד באמצעות תוכנות CAD (Autodesk Inventor) והודפס ב 5000 dpi על שקיפות. Photoresist שלילית (SU8) הוא הסתובב על גבי פרוסות סיליקון בעובי של 100 מיקרומטר. שקיפות המאוחסן ונחשפו לאור UV. ללא polymerized photoresist מוסר על מנת ליצור את המאסטר העתק חיובי.
- כדי להפוך את תמהיל PDMS פתרון בסיס סיליקון עם סיליקון ריפוי סוכן 10:01 לפי משקל בסירה לשקול ומערבבים עם pipet סרולוגית 5 מ"ל. להיזהר לא לגרד את הקירותשל הספינה שוקלים להימנע מהוספת פתיתי פלסטיק לפתרון.
- מניחים את פרוסות שני צלחת פטרי 100x15mm ויוצקים את הפתרון PDMS לתוך צלחת.
- לכסות את התבשיל ומניחים אותו לתוך מיכל ריק במשך 15 דקות כדי להסיר בועות. אחרי 15 דקות לקחת את צלחת פטרי החוצה להסיר בועות עודף ידי בעדינות נושבת באוויר מעל פני השטח.
- מניחים צלחת פטרי בתנור במשך שעה 1 ב 70 ° C. הסר את הצלחת לגזור לתאי microfluidic באמצעות סכין חדה.
4. הרכבה של התקן על מיקרוסקופ
- הפעל את מקור האור אל מיקרוסקופ הפוכה ולהגדיר תנור ל 37 ° C. צרף צינורות כדי מזרק 10 מ"ל וממלאים מים מזוקקים כך יש בועות לא. הנח את המזרק משאבת מזרק ספיקת סט לגרום אס הקיר של דיין 1/2 ס"מ. הלחץ גזירה הקיר (τ W) שנוצר לאורך קו האמצע של הערוץ הוא מקורב באמצעות תקןהמשוואה עבור חדר מקבילות צלחת זרימה:
שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה הערוץ, ו-W הוא רוחב הערוץ. הערה: מאז הערוצים הם בעלי רוחב סופי בפועל τ W תשתנה בהתאם W תלוי ערוץ יחס הממדים, ומדידות הם נמנעו על 25% הקרוב הקירות הצדדיים. 1,7 - מניחים PDMS קאמרית במים ולהשתמש micropipette 100μl להוציא אוויר מן הערוצים בודדים. צרף מתאם ואקום לחדר לוודא כי השסתום מבוטלת.
- מניחים צלחת פטרי עם monolayer HAEC על המטרה. מניחים את החדר PDMS על צלחת פטרי ובזהירות תניח אותו על monolayer HAEC תוך הבטחת כי לא ליצור בועות אוויר בין ההתקן לבין monolayer. סובבו את שסתום כך ואקום על וחדר מחובר כהלכה. חותכים 19 מחטים מד להקהות כזה שיש רק 5 מ"מ של השמאל מתכת. מלאו את מיכל פלסטיק עם חיץ והכניסו הכניסה לחדר PDMS. חזור על הפעולה עבור מספר מתאים של ערוצי לשמש. צרף צינורות מ משאבות המזרק יוצא PDMS הערוץ.
5. הדבקה Assay מונוציטים תחת מאמץ גזירה
- להשעות THP-1 תאים ב 2x10 6 תאים למ"ל ב HBSS + Ca 2 + / 2 + Mg HSA + 0.1%. הפעל THP-1 תאים על ידי דוגרים עם מקדם-1 נגזרות סטרומה (SDF-1, 50 מיקרוגרם / מ"ל) במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הפעל את משאבת מזרק להקים זרם, ולאחר מכן להוסיף 50 μl של השעיה תא למאגר ללא החדרת בועות אוויר. לאחר זרימה מפותחת במלואה, להתחיל רכישת נתונים.
- לרוץ 5 דק 'בקצב זרימה מתאימה, הוספת המאגר למאגר אם הפתרון מקבל נמוך. ממשיכים לזרום אל תוך המאגר הערוצים כדי לשטוף את כל התאים מאוגד בנחל זרימה.
6. רכישת נתונים וניתוח
- לרכישת התמונה sequences דיגיטליים לאחר 3 מסגרות לשניה 2 דקות לאחר זרימה מפותחת לאורך ציר האורך של הערוץ ב -3 מקומות הערוץ, נזהר שלא להקליט מיד לאחר הכניסה או היציאה לפני יציאות או 25% בצד הקרוב קירות.
- ספור את מספר התאים שנעצרו בכל תחום על ידי זיהוי שלב המראה בהיר שלהם במישור מרחק זהה monolayer.
- תא מעצר המשרד מוגדר על ידי התנועה <½ קוטר של תא 10. נתונים ממוצעים על פני 3 שדות אקראיים / ערוץ ולכמת באמצעות תוכנת ImageJ.
7. נציג תוצאות
למרות האנדותל בכלי הדם נחשפת אחיד אגוניסטים התורמים דלקת מערכתית, טרשת עורקים היא מחלה מיקוד המפתחת מעדיפים באתרים של הפרעה בזרימת בעורקים, לסבך את ההטרוגניות המרחבית בתפקוד האנדותל. 8 9, 10 TNF-α גורם לתגובה היטב מאופיין של הנציבות האירופית, הכוללת את ויסות של מולקולות הידבקות התא (CAMS למשל: VCAM-1, ICAM-1, E-selectin) ו כמוקינים כי מונוציטים לגייס מהמחזור, סימן ההיכר של הנגע טרשת עורקים מוקדמת 11 ופרמטרים המודינמיים הוא הרגולטור חשוב של הפנוטיפ דלקתית האנדותל 12 מתח גבוה גזירה גודל (HSS.. למשל 15 dynes / cm 2) או מאמץ גזירה pulsatile (PSS, למשל 15 ± 5 dynes / 2 ס"מ) קשורה לאתרים של התנגדות טרשת עורקים בעורקים למטה המסדירים TNF-α-Induced תגובות. לעומת זאת, בסדר גודל נמוך גזירה מתח (LSS, למשל 2 dynes / cm 2) או oscillatory גזירה (OSS, למשל 0 5 ± dynes / 2 ס"מ), האופייניים לאתרים רגישים in vivo, להחמיר cytokine-Induced דלקת. 13, 14 microfluidic שלנו התקנים PDMS לספק פלטפורמה לביצוע מחקרים מכניסטית לבחון את ההשערות הקשורות סופרפוזיציה של מתח חילוף החומרים עם גורמים הידרודינמית בוויסות של תפקוד האנדותל והפתולוגיה. השירות צדדיות של הגישה באה לידי ביטוי באופן נרחב דרך את התוצאות הבאות מייצגות.
באיור 1. מאמץ גזירה דיפרנציאלי מודולציה THP-1 הידבקות התא TNF-אלפא monolayers אנדותל מודלק. נתונים אלה נרכשו באמצעות פרוטוקול מפורט לעיל ותיעד בווידיאו. Monolayers HAEC נחשפו בעת ובעונה אחת מינון נמוך של ציטוקינים דלקתיים TNF-α (0.5 ng / ml, EC ~ 50 עבור VCAM-1 את ויסות) ואו HSS (15 dynes / cm 2) או OSS (0 ± 5 dynes / 2 ס"מ, 1 הרץ) ב CSD מותאם אישית עבור שעות 4 כמו descriהמיטה בפרוטוקול מפורט. THP-1 תא המעצר היה לכמת תחת זרימת גזירה בתא זרימת PDMS. קו זה תא המחקה את הפנוטיפ של מונוציטים אדם נבחר שחזור שלו וקלות השימוש. HSS נחלש את התגובה הדלקתית לעומת OSS, וכתוצאה מכך ירד מעצר-1 THP התא. הנתונים נותחו על ידי הסטודנטים של מבחן t ו מיוצגים ממוצע ± SEM של 3 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור DeVerse et al. 5
את הנתונים הבאים ממחישים את צדדיות של הגישה שלנו באמצעות דוגמאות מן העבודה לאור שלנו. יציאות מן הפרוטוקול הנ"ל מסומנים לפי העניין.
איור 2. אפנון של ביטוי ציטוקינים הנגרמת-1 VCAM וגיוס מונוציטים ב שיפוע מאמץ גזירה. א) monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות תחת פלוw ב VMMC תוכנן בהתבסס על התיאוריה Hele, שו זרימה. 15 ירידה ליניארית בעוצמת SS לאורך קו האמצע של ערוץ הושגה על ידי עיצוב הצדדיים של החדר יעלה בקנה אחד עם מייעלת הזרימה 2 קיפאון ממדית ועיצוב בסוף הערוץ להתאים את ISO-פוטנציאליים הקווים. הלחץ גזירה הקיר (τ W) שנוצר לאורך קו האמצע של ערוץ זה במרחק צירית מהכניסה (x) נתון על ידי:
שם μ הוא צמיגות של המדיום, ש הוא שיעור זרימת נפח, h הוא גובה התעלה, w 1 היא הכניסה את רוחב הערוץ, ו-L הוא אורך הערוץ הכולל. Q נבחרה כדי ליצור שיפוע בסדר גודל SS מ 16 dynes / 2 ס"מ על כניסת עד 0 בנקודת קיפאון "" הפרוקסימלי רק כדי outleלא. B)-C) VCAM-1 הביטוי נמדד באתרו על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באמצעות נוגדנים מצומדות על נקודות קוונטיות והציג כמו עוצמת הקרינה אחוז החציוני (MFI) לחוק הפיקוח סטטי unstimulated. אס לא לווסת את רמת הבסיס של VCAM-1, שהוא נמוך HAEC unstimulated (משולשים אפורים). עם זאת, VCAM-1 ביטוי מוגבר יחסית TNF-α על הבהירויות LSS, לשיא ב ~ 2 dynes / 2 ס"מ ולחזור הבסיס TNF-α או מתחת בכל הבהירויות גזירה> dynes 5/2 ס"מ (ריבועים שחורים). ד) מונוציטים (10 6 / מ"ל) היו perfused ב 2 dynes / 2 ס"מ על 5 דקות בכל ערוצי הזרימה במקביל על monolayers preconditioned כמו). גיוס מונוציטים כדי האנדותל בקורלציה כמותית על גודל נתון מאמץ גזירה עם הביטוי VCAM-1. יש לציין, את היכולת לחקור VCAM-1 ביטוי וגיוס מונוציטים עם רזולוציה מרחבית קנס monolayeמחקר גילה שינויים משמעותיים על פני טווח צר גודל אס כי לא יהיה מוערך על ידי יישום רק כמה ערכים בדידים של גזירה בניסויים נפרדים. הנתונים נותחו על ידי ANOVA צעדים חזר והפרשי שהוערכו על ידי ניומן-Keuls posttest, * p <0.05 מ TNF-α בתנאים סטטיים. הנתונים הם ממוצע ± SEM מ 3-6 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור Tsou et al. 2
איור 3. הטריגליצרידים עתירי ליפופרוטאין (TGRL) לווסת ציטוקינים-Induced דלקת ביחס בסרום התורמות רמות טריגליצרידים ו VCAM-1 הביטוי. Monolayers HAEC היו מגורה עם TNF-α (0.3 ng / ml) עבור 4 שעות בו זמנית עם TGRL (10 מ"ג / ד"ל ApoB) מבודד בבני אדם לאחר הארוחה שומן גבוהה בתרבות סטטי.) VCAM-1 הביטוי נמדד בנפרד על ידי cytometry לזרום EC מושעהו הידבקות מונוציטים לכמת באמצעות VMMC כמתואר בפרוטוקול מפורט. הנתונים מוצגים כשינוי% מ TNF-α. מעצרו מונוציטים משתנה ביחס ישר ביטוי האנדותל VCAM-1, אשר הגדילו באופן ישיר מרמת טריגליצרידים בדם התורם. ב ') מעצרו של מונוציטים משנה של הפרו דלקתיים תורמים בוטל בנוכחות נוגדנים VCAM 1-חוסם. משמעות נקבע על ידי זיווג הסטודנטים של מבחן t, כלומר ± SEM מ 3-5 ניסויים בלתי תלויים. עיבוד באישור וואנג et al. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים את השימוש במכשירים microfluidic PDMS להערכה על שבב של הפנוטיפ דלקתי האנדותל באמצעות הדמיה בזמן אמת הביטוי CAM ו הידבקות מונוציטים. היתרון העיקרי של הגישה שלנו טמון ביכולת לכמת את התוצאות הקשורות בתפקוד האנדותל בתאים שנחשפו מתווכים דלקתיים כגון ציטוקינים שומנים תזונתיים בתנאים מוגדרים הידרודינמית ומשקפות מאמץ גזירה בכלי atherogenic. VMMC להקל על השימוש כמויות קטנות של חומרים כימיים או חומרים שעשויים להיות בהיצע מוגבל ויש להם את היתרונות נוסף של להיות זול, להתאמה אישית מקובל קצב העברת נתונים גבוה.
השימוש במכשירים microfluidic מהווה אלטרנטיבה לגישות macroscale שהיו בשימוש במשך עשרות שנים כדי לחקור את התגובה של EC תרבותי אל גזירה. אלה כוללים במקביל, צלחת לתאי זרימה, צינורות גליליים, ואת חרוט ו-צלחת viscometers, שכל אחד מהם הוא CApable להטיל יציב, למינרית תנאי Poiseuille זרימה (נבדקה ב 16). שינויים אלה יכולים לייצר מכשירים וריאציות בזמן או בחלל של מאמץ גזירה קיר או אפילו לשחזר את העורקים גל. 6 עם זאת, בדרך כלל מכשירים אלו דורשים כמות גדולה של התקשורת, הם יקרים לפברק, יכולת הסתגלות פחות, סובלים התפוקה נמוכה comparably.
כמו כן, קיימות מגבלות לשימוש VMMCs את. מכשירים אלה נועדו על פי תורת הקבלה, זרימת צלחת, המניחה רוחב אינסופי. זו הנחה סבירה עבור התקנים macroscale שבו רוחב גדול הרבה יותר מכפי גובה. עם זאת, רוחב סופי של ערוצי microfluidic מחייבת כי מחקרים להתנהל יחד במרכז ציר האורך של ערוץ לחסל קיר תופעות לוואי, כמו בפועל τ W תשתנה בהתאם W בהתאם יחס הממדים הערוץ. 1, 7 באופן דומה , מדידות לא נלקחים לא קרובהו את הכניסה והיציאה של ערוצים כדי למנוע תופעות הכניסה. יש לנו לשלול תופעות משמעותיות איתות paracrine או דלקת הנגרמת על ידי פגיעה או נזק שנגרם על ידי EC איטום המכשיר monolayer כתורמים התגובות שנצפו שלנו. PDMS יש זיקה גבוהה של מולקולות הידרופוביות, אשר עלולה להוביל לספיגת כמוקינים המופרשים שאינם ספציפיים אינטראקציות בין leukocytes ו VMMC. עם זאת, לא מצאנו את זה כדי להיות בעיה למשך הלימודים שלנו. 2
השימוש במכשירים לזרום עם תאים בתרבית מהווה הגישה הרדוקציוניסטית המאפשרת מחקרים מכניסטית הפגנה של סיבה ותוצאה ביחס מאמץ גזירה. עם זאת, הגבלה של כל גישה חוץ גופית היא ההנחה כי היא מספקת לשחזר את המורכבות של הסביבה בעורקים מקומיים. בחי לתאי אנדותל מותאמים באופן כרוני על תבניות זרימה מורכביםכפופים אינטראקציות עם תאים אחרים, מטריקס, ומתווכים הלחות המסדירים את התנהגותם.
ראוי לציין כי כל התוצאות שהוצגו לעיל הם לטווח קצר מודלים וככזה לא יכול להיות זמן קבוע. עם זאת, הם מייצגים של ניסויים אשר אנו בדרך כלל מבצעים לחקור מנגנון תחת האתגר דלקתית חריפה. האסטרטגיה רלוונטי ללימודים שלנו היא לעקוב אחר שינויים מנקודת ההתחלה דלקתית של גירוי TNF-α במינון נמוך, אשר 4 שעות מייצג את שיא משוער בביטוי-1 VCAM. יש לנו תיעוד במחקרים מספר שינויים בביטוי את פני השטח של VCAM-1 לתאם עם גיוס מונוציטים משופרת בתנאים אלה. 2-4, 17
יתר על כן, הבחירה של אס waveform יכול לעורר תגובות אנדותל דיפרנציאלי. בפרוטוקול נציג שלנו לתעד את השימוש VMMC לכמת אירועים הדבקה מונוציטים ב HAEC המותנות לפי סעיףלשמוע מדגיש שנבחרו להיות נציג של אתרים של התנגדות יחסית (HSS) ורגישות (OSS) ל atherogenesis בעורקים של המכשיר הסלולרי אישית הגז. בקנה אחד עם ממצאים קודמים EC תרבותי, HSS נחלש התגובה הפעלת ציטוקינים ביחס OSS. 12, 13 התוצאות עולות בקנה אחד עם המתירנות גדולה יותר הפעלה דלקתית של EC באתרים של הפרעה בזרימת in vivo. למרות תנאים אלה משמשים בדרך כלל לייצג זרם ללא הפרעה ו מופרע בהתאמה, הם לא לגמרי לשחזר את המורכבות של הזרימה בעורקים. עם זאת, שפע של ספרות תומך בשימוש שלהם קירובים פשוטים כראוי לשחזר את תכונות הזרימה הבולטים. 14
יש לציין, CSD חרוט ו-צלחת מבוסס שלנו היא מסוגלת לייצר צורות גל מורכבות יותר תאים מיזוג לתקופות ארוכות יותר כפי שדווח בעבר. 6 לפיכך, זיווג VMMC עם CSD ב PR תיארotocol מקנה מידה מקסימלית של גמישות. השיקול של גישה זו טמון בכיוון של VMMC ביחס לכיוון של מיזוג גזירה ב CSD, שבה זרימת HAEC ניסיון בכיוון ההיקפי. בפועל, VMMC מכוונת כך ערוצים מקבילים עם שדה זרימה כניסת הזרם של תאים ממוזגים ככל האפשר. הערוצים הם קטנים מספיק, כי זה מהווה קירוב סביר. עם זאת, יש לנו גם הוכחה בניסוי הקודם, מונוציטים הזורמים במקביל או בניצב לכיוון של מיזוג גזירה ב VMMC לא השפיע על התוצאות המוצגות באיור 2. 2
שיקולים נוספים הקשורים בטכניקות שונות חוץ גופית כוללים המושרה על ידי סחיפה פנוטיפי קשור passaging הסידורי של EC בתרבות ההטרוגניות של EC מבודד או מונוציטים. HAEC צריך בדרך כלל לשמש את המעבר 6 וכל הרבהמאופיין לתגובה דלקתית עקבית TNF-α. השימוש בקו התא כגון THP-1 יכולים להפחית את השתנות הקשורים לשימוש של מונוציטים, המשתנים בפעילות ידי התורם מופעלים בקלות על ידי בידודם. על מנת להבטיח readouts תפקודית לשחזור מדויק, הכנת תא וזמני העברה צריך להיות ממוזער. בחירה זהירה של פקדים יש צורך לפרש את התוצאות בצורה משמעותית. בהתאם הניסוי, אלה עשויים לכלול תאים שלא טופלו או סטטי תרבותי, TNF-α טיפול, לא ממושכת THP-1 תאים, שימוש בנוגדנים, siRNAs חסימה או מעכבי תרופתי ועוד.
כפי עדות צדדיות של גישה, יש לנו ליישם את התקנים לחקור ציטוקינים-2, שומנים בדם 3, 4 ו - 5 RAGE-Induced דלקת HAEC. המחקרים שלנו כללו מדידת פוטנציאל דלקתית של סרום חלקיקים שמקורם מן השומנים של האדםubjects על תאים אנדותל 3, 4 ומונוציטים. 17 אסטרטגיה חלופית, מונוציטים יכולה להיות מוצגת עם מצעים derivatized עם מולקולות חסרי יכולת תנועה כגון VCAM-1 לבחון מנגנונים הידבקות. שימוש בגישה זו, אנו קודם לכן הפגינו תפקיד פונקציונלי עבור מולקולה הידבקות CD11c, אשר משתפת פעולה עם אנטיגן מאוחר מאוד (VLA) ב -4 הידבקות מונוציטים כדי VCAM-1 אצל בני אדם במהלך דיסליפידמיה 17 ועכברים. 18 מאז מונוציטים ניתן להפעיל בקלות על ידי הבידוד שלהם, יש לנו גם פיתחה assay דם מלא לשימוש עם המכשיר שלנו במעבדה שבב, כדי לאפשר זיהוי רגיש יותר לשחזור. 17
בסופו של דבר, בנוסף לספק תובנות לגבי האירועים דלקתיות הראשונים שבבסיס טרשת עורקים, אנו רואים כי פיתוח הטכנולוגיה יוביל גישות ב vivo נאמנים לשעבר להערכת הסיכון של אדם למחלות לב וכלי דם, דלקת מתווכת, סלילת Wאיי עבור פיתוח של כלי אבחון אישיות המדווחים על הפעלת מונוציטים ו-EC.
| קון-and-Plate הגז התקן נייד | ||
| קון רדיוס | 0.06985 | מ ' |
| קון זווית | 0.00877 (0.5 מעלות) | רד (מעלות) |
| הפער גובה | 20 ± 10 | מיקרומטר |
| מקס מהירות זוויתית (לניסויים שתוארו כאן) | 18.85 | rad / s |
| צמיגות קינמטית | 0.00077 | 2 מ '/ ש' |
| מקס מספר R (לניסויים שתוארו כאן) | 0.000758 | מימדים |
| VMMC מפרט | ||
| ערוץ אורך | 8.0 | מ"מ |
| ערוץ גובה | 60 | מיקרומטר |
| ערוץ רוחב | 2 | מ"מ |
| מספר ריינולדס | 1.67 | מימדים |
טבלה 1. מפרט CSD ו VMMC.
באיור 4. חתך מבט של המכשיר חרוט ו-צלחת תא הגז (CSD). CSD מורכב קונוס נירוסטה גלילי שמסתובבת מעל המצע תא נייח התרבות. זווית קונוס וגובה הפער הם פרמטרים קריטיים שמגדירים את האופי של שדה גזירה המיוצר במעמד בינוני התרבות. מספר ריינולדס שונה מראה את הקשר של צנטריפוגלי לכוחות צמיגה ניתנת על ידי:
<br />
כאשר r רדיוס קונוס, ω היא המהירות הזוויתית, α היא זווית קונוס, ו ν הוא מהירות kinematic של נוזל. כאשר R הוא << 1 כוחות צנטריפוגליים נמוכים, זרימת היא למינרית ו azimuthal בלבד, ואת מאמץ גזירה המושרה הוא קבוע לאורך monolayer. 19 ב CSD שלנו, המצע עם תאים בתרבית נטען מלמטה החדרה כי הבתים קונוס. בינוני מתווסף חדר ושימש נוזל הגז. קונוס הוא רכוב עם טעונה מראש מסבים דיוק הסיבוב מונע על ידי מנוע מיקרו דורך. המערכת שומרת על דיוק פילוס בניצב יישור המצע תא. בגובה הפער (שהוגדר על ידי המרחק לשיא של חרוט המצע תא) מוגדר עם מד דיוק גבוהה עומק. משמנים לתפוס התקשורת חותם נמצאים במקום על מנת להבטיח כי הדיור חדר תאים נשמר נקי ללא שמן ופסולת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי NIH / NHLBI מענק R01 HL082689 לסקוט א סיימון אנתוני ג Passerini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
