Summary
Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.
Abstract
Atherogenese wordt versterkt door metabole afwijkingen die bijdragen aan een verhoogde staat van systemische ontsteking leidt tot disfunctioneren van het endotheel. Echter, begin van de functionele veranderingen in endotheel, dat betekent een individu niveau van het risico niet direct klinisch onderzocht naar de gids van therapeutische strategie te helpen. Bovendien, de regulering van ontsteking door lokale hemodynamica draagt de niet-random ruimtelijke verdeling van atherosclerose, maar de mechanismen moeilijk af te bakenen in vivo. We beschrijven een lab-on-a-chip gebaseerde benadering van kwantitatief onderzoek metabole verstoring van inflammatoire gebeurtenissen in de menselijke endotheelcellen (EC) en monocyten in een zeer nauwkeurige voorwaarden. Standaardmethoden van zachte lithografie worden vasculaire mimetische microfluïdische kamers (VMMC), die direct gebonden aan gekweekte EC monolagen microfabricate. Een deze inrichtingen hebben het voordeel van het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia terwijleen platform voor direct beeld van de ontstekingen in het membraan van EC blootgesteld aan een welbepaalde shear veld. We hebben succes toegepast deze apparaten cytokine, 2 lipide-3, 4 en RAGE-geïnduceerde 5 ontsteking in menselijke aorta EC (HAEC) onderzoeken. Hier aantonen hoe de VMMC voor het testen van monocyten cel (THP-1) wals en stilstand van HAEC monolagen die geconditioneerd onder differentiële afschuiving eigenschappen en geactiveerd door inflammatoire cytokine TNF-α. Studies zoals deze zijn het verstrekken van mechanistisch inzicht in atherosusceptibility onder metabolische risicofactoren.
Protocol
1. Cel Cultuur en Voorbereiding van de ondergrond
- Snijd 3-inch ronde substraten van een 100 x 20 mm weefselkweek schotel (BD Falcon) met behulp van een draaibank. Steriliseer substraten door onderdompeling in 70% ethanol. Plaats in een petrischaal en mantel met 4 ml type I collageen (100 ug / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel met 4 ml 1 x PBS.
- Hang Human Aorta endotheelcellen (HAEC, passage 4-6) op 6.5x10 5 cellen / ml en het zaad door het toepassen van 1 ml direct op substraat. Plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en laat cellen hechten aan het substraat gedurende 1 uur.
- Voeg 9 ml endotheliale groei Medium-2 (EGM-2) aangevuld met 1 x antibiotica antimycotische oplossing aan de cellen. Wijzig de media om de 2 dagen tot de cellen tot 90% confluentie.
- Handhaaf THP-1-cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica 1x antimycotische oplossing. Passage cellen wanneer zij een dichtheid van 1 bereiken0 6 cellen / ml.
2. Cell Shearing Protocol
De cellen worden geconditioneerd in een aangepaste kegel-plaat Cell Shearing Device (CSD). Apparaat details en specificaties van het ontwerp zijn aangegeven in tabel 1 en figuur 4.
- Bereid de CSD. Steriliseer de kamer behuizing met ethanol en spoel af met steriele PBS. Verwarm de behuizing 37 ° C en om te waarborgen dat de kegel loodrecht op de celmonolaag. Zet het substraat met de cellen van de bodem van het huis en zet de kegel op de gewenste hoogte.
- Gebruik Leibovitz-15 (L-15) medium aangevuld met Endothelial BulletKit de afschuiving medium juiste pH in afwezigheid van CO 2 te handhaven. Om ontsteking stimuleren toe tumor necrosis factor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) om de afschuifkrachten medium en injecteer 6 ml in de inrichting via een spuit verbonden met een inlaatpoort en zorg geen lucht te voerenbubbels in de kamer.
- Shear-cellen met een hoge mate stabiele shear stress (HSS, 15 dyne / cm 2) of een oscillerende shear stress (OSS, 0 ± 5 dyne / cm 2, 1 Hz) voor 4 uur. De gewenste SS wordt bereikt door aan de kegel boven de cellen die juist wordt met een micro-stappenmotor als eerder beschreven 6 wand SS aan het oppervlak (τ w) wordt benaderd door.:
waarbij μ is de viscositeit van het medium, ω de hoeksnelheid van de kegel en α de kegelhoek (0,5 °). De kegel aanpassing aan het substraat is aangepast om binnen 0,05 ° door nauwkeurige nivellering en de kloof hoogte vastgesteld op 20 ± 10 urn met behulp van een dieptemeter om omtrek en radiale variatie in τ w minimum te beperken. Het apparaat is gevalideerd voor laminaire stroming kenmerken te garanderen. Verwijder cel van het apparaat en voor te bereiden op de analyse van monocyten hechting.
3. Fabricage van PDMS Microfluïdische Kamer
- Haal meester mal voor gewenste microfluïdische kanaalnummer en de kanaalnaam hoogte afhankelijk van de toepassing. De kenmerken van het specifieke ontwerp wordt gebruikt in dit protocol zijn weergegeven in tabel 1. De methode voor het creëren van deze is al goed gedocumenteerd in de literatuur. Een kort, het netwerk van kanalen wordt ontworpen met behulp van CAD-software (Autodesk Inventor) en gedrukt bij 5000 dpi op een transparant. Negatieve fotoresist (SU8) wordt gesponnen op een siliciumplak met een dikte van 100 pm. De transparantie is bedekt en blootgesteld aan UV-licht. Niet-gepolymeriseerde fotolak verwijderd met de positieve replica meester genereren.
- Om PDMS oplossing te mengen basis van siliconen te maken met siliconen verharder 10:01, berekend op een gewicht van boot en roer met een 5 ml serologische pipet. Zorg ervoor dat u de muren te schrapenvan de wegen boot om te voorkomen dat het toevoegen van plastic vlokken aan de oplossing.
- Plaats de master wafer in een 100x15mm petrischaal en giet het PDMS oplossing in de schotel.
- Dek de schaal af en plaats deze in een vacuüm verpakking gedurende 15 minuten om bellen te verwijderen. Na 15 minuten de petrischaal uit en verwijdert het overtollige luchtbellen door voorzichtig te blazen lucht over het oppervlak.
- Plaats Petri schaal in een oven gedurende 1 uur bij 70 ° C. Verwijder de schaal en knip de microfluïdische kamers met een scherp mes.
4. Vergadering van Device op Microscoop
- Zet lichtbron omgekeerde microscoop en zet verwarming op 37 ° C. Bevestig de slang aan een 10 ml spuit en vul met gedestilleerd water zodanig dat er geen luchtbellen. Plaats de spuit in de spuit pomp en de ingestelde stroom aan een wand SS van 1 dyne / cm 2 induceren. De afschuifspanning (τ w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal wordt benaderd met de standaardvergelijking voor een parallelle plaat flow chamber:
waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte en w de kanaalbreedte. Opmerking: aangezien de kanalen van eindige breedte van de werkelijke τ w varieert met w afhankelijk van het kanaal beeldverhouding en metingen vermeden 25% dichtst bij de zijwanden. 1,7 - Plaats PDMS kamer in het water en gebruik een 100 ul micropipet om lucht te verwijderen uit de individuele kanalen. Bevestig vacuüm adapter aan op kamer ervoor te zorgen dat de klep is uitgeschakeld.
- Plaats petrischaal met HAEC monolaag op het streven. Plaats de PDMS kamer over de petrischaal en zorgvuldig in te stellen op de HAEC monolaag tegelijkertijd te verzekeren dat er geen luchtbellen vormen tussen het apparaat en de monolaag. Draai de klep zodat het vacuüm is ingeschakeld en de kamer wordt stevig bevestigd. Snij 19 gauge naald bot zodanig dat slechts 5 mm metaal links. Vul de plastic reservoir met buffer en in PDMS kamer ingang. Herhaal passend aantal kanalen worden gebruikt. Bevestig de slang van de spuit pompen PDMS kanaal uitgangen.
5. Monocyten Hechting Assay Onder Afschuifspanning
- Suspendeer THP-1 cellen 2x10 6 cellen / ml in HBSS + Ca2 + / Mg2 + + 0,1% HSA. Activeer THP-1 cellen door incubatie met stroma afgeleid factor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
- Zet spuitpomp te stromen vast te stellen, voeg dan 50 pi van celsuspensie naar het reservoir zonder dat er luchtbellen. Zodra stroom volledig is ontwikkeld, begint data-acquisitie.
- Gedurende 5 minuten bij toepassing debiet buffer toe te voegen aan het reservoir indien de oplossing laag wordt. Ga verder stroomt buffer in de kanalen te wassen uit een ongebonden cellen in de stroom stroom.
6. Data-acquisitie en-analyse
- Verwerven digitale beeld reeksen 3 frames / s gedurende 2 min na volle stroming langs de lengteas van het kanaal 3 locaties in het kanaal zorg niet onmiddellijk na binnenkomst of voor uitgangspoorten of 25% opnemen dichtst bij de zijkant wanden.
- Tel het aantal gearresteerde cellen per veld door het identificeren van hun fase-heldere verschijning in dezelfde focal plane als de monolaag.
- Firm cel arrestatie wordt gedefinieerd door beweging <½ cel diameter in 10 s. Gemiddelde data over 3 willekeurige velden / kanaal en te kwantificeren met behulp van ImageJ software.
7. Representatieve resultaten
Hoewel het vasculair endotheel is gelijkmatig blootgesteld aan agonisten die bijdragen aan systemische ontsteking, atherosclerose is een ziekte die centraal bij voorkeur ontwikkelt op plaatsen van stroom storing in de slagaders, wat impliceert ruimtelijke heterogeniteit in endotheelfunctie. 8 9, 10 TNF-α leidt tot een goed gekarakteriseerde reactie in EG, dat up-regulatie van cel adhesie moleculen (CAM's bevat , bijvoorbeeld VCAM-1, ICAM-1, E-selectine) en chemokines die personeel werven monocyten uit de circulatie, een kenmerk van de vroege atherosclerose 11 Hemodynamica is een belangrijke regulator van endotheliale inflammatoire fenotype 12 High magnitude shear stress (HSS..; bijv. 15 dynes / cm 2) of pulsatiele shear stress (PSS, bijv. 15 ± 5 dynes / cm 2) bij sites van de weerstand tegen atherosclerose in de slagaders TNF-α-geïnduceerde responsen down-reguleren. Omgekeerd, lage magnitude shear stress (LSS, bijv. 2 dynes / cm 2) of oscillerende shear (OSS; bijv. 0 ± 5 dynes / cm 2), kenmerk van gevoelige locaties in vivo, verergeren cytokine-geïnduceerde ontsteking. 13, 14 Onze microfluïdische PDMS-apparaten bieden een platform voor het uitvoeren van mechanistische studies om hypothesen met betrekking tot de superpositie van metabole stress met hydrodynamische factoren in de regulering van de endotheliale functie en pathologie te testen. Het nut en de veelzijdigheid van de aanpak wordt breed geïllustreerd door de volgende representatieve resultaten.
Figuur 1. Afschuifspanning moduleert verschillend THP-1-cel adhesie aan TNF-α ontstoken endotheliale monolagen. Deze gegevens werden verkregen met behulp van de gedetailleerde protocol hierboven beschreven en gedocumenteerd in de video. HAEC monolagen werden gelijktijdig blootgesteld aan een lage dosis van het inflammatoire cytokine TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC50 voor VCAM-1 tot-regulering) en ofwel HSS (15 dynes / cm 2) of OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) in een aangepaste CSD voor 4 uur aan zoalsbed in de gedetailleerde protocol. THP-1-cel arrestatie werd gekwantificeerd onder afschuiving stroming in een PDMS flow chamber. Deze cellijn dat het fenotype van humane monocyten bootst werd gekozen vanwege zijn reproduceerbaarheid en gebruiksgemak. HSS verzwakt de ontstekingsreactie in vergelijking met OSS, wat resulteert in een vermindering van THP-1-cel arrestatie. De gegevens werden geanalyseerd door Student's t-test en worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van DeVerse et al. 5.
De volgende gegevens tonen de veelzijdigheid van onze aanpak met behulp van voorbeelden uit onze gepubliceerde werk. Afwijkingen van de bovenstaande protocol worden aangegeven waar van toepassing.
Figuur 2. Modulatie van cytokine-geïnduceerde VCAM-1 expressie en monocyt werving in een shear stress gradiënt. A) HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur onder flow in VMMC ontworpen gebaseerd op Hele-Shaw stromingsleer 15. een lineaire afname SS grootte langs de hartlijn van het kanaal is bereikt door de zijwanden van de kamer te laten samenvallen met de stroomlijnen van een tweedimensionale stagnatie stromen en vormen het einde van het kanaal naar de iso-potentieel lijnen overeenkomen. De afschuifspanning (τ w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal op een axiale afstand van de ingang (x) wordt gegeven door:
waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte, w 1 het kanaal doorgangsbreedte, en L de totale kanaallengte. Q is gekozen om een gradiënt in SS grootte genereren van 16 dynes / cm 2 bij de inlaat van 0 in de stagnatie "a" net proximaal de outlet. B)-C) VCAM-1 expressie werd gemeten in situ door immunofluorescentie microscopie met behulp van antilichamen geconjugeerd met quantum dots en weergegeven als een percentage mediane fluorescentie-intensiteit (MFI's) van de niet-gestimuleerde statische controle. SS niet moduleren het basale niveau van VCAM-1, die laag in ongestimuleerde HAEC (grijs driehoeken). Echter, VCAM-1 expressie gestegen ten opzichte van TNF-α bij LSS grootheden, met een piek van ~ 2 dynes / cm 2 en terug te keren naar de TNF-α basislijn of lager dan op afschuiving grootheden> 5 dynes / cm 2 (zwarte vierkantjes). D) Monocyten (10 6 / ml) werden bij 2 geperfundeerd dynes / cm 2 5 min parallel stromingskanalen via monolagen geconditioneerd als in A). Monocyten instroom endotheel kwantitatief gecorreleerd met de VCAM-1 expressie op een bepaalde schuifspanning grootte. Met name de mogelijkheid VCAM-1 expressie en monocyt rekrutering sonde met fijne ruimtelijke resolutie in monolayer significante veranderingen bleek een smal bereik in SS grootte die niet gewaardeerd door slechts enkele discrete waarden van afschuiving in afzonderlijke experimenten. De gegevens werden geanalyseerd door herhaalde metingen ANOVA en verschillen beoordeeld door Newman-Keuls nameting, * P <0,05 van TNF-α onder statische omstandigheden. De gegevens worden gemiddelde ± SEM drie tot zes onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Tsou et al.. 2
Figuur 3. Triglyceriden-rijke lipoproteïnen (TGRL) moduleren cytokine-geïnduceerde ontsteking in verhouding tot donor serum triglyceride niveaus en VCAM-1 expressie. HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur gelijktijdig met TGRL (10 mg / dl ApoB) geïsoleerd uit menselijke proefpersonen na een vetrijke maaltijd in statische cultuur. A) VCAM-1 expressie werd apart gemeten in zwevend EG door middel van flowcytometrieen monocyt hechting gekwantificeerd met een VMMC zoals beschreven in de gedetailleerde protocol. De gegevens worden voorgesteld als% verandering van TNF-α. Monocyten arrestatie gevarieerd in verhouding tot endothelial VCAM-1 expressie, die direct vermeerderd met de hoogte van donor serum triglyceriden. B) Monocyt arrest een subset van pro-inflammatoire donoren ingetrokken in aanwezigheid van een VCAM-1 blokkerend antilichaam. Significantie werd bepaald door gepaarde Student's t-test, betekent ± SEM 3-5 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Wang et al.. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We beschrijven het gebruik van microfluïdische PDMS apparaten voor de on-chip beoordeling van de endotheliale inflammatoire fenotype door de real-time beeldvorming van CAM expressie en monocyten hechting. Een groot voordeel van onze aanpak ligt in het vermogen om de resultaten in verband met disfunctioneren van het endotheel in de cellen blootgesteld aan ontstekingsmediatoren zoals dieet lipiden en cytokines onder gedefinieerde hydrodynamische omstandigheden die shear stress een afspiegeling van de atherogene schepen te kwantificeren. De VMMC vergemakkelijken van het gebruik van kleine hoeveelheden van de reagentia of materialen die kunnen worden in beperkte aanbod en het extra voordeel dat het goedkoop, aanpasbare en vatbaar voor high throughput.
Het gebruik van microfluïdische apparaten is een alternatief voor de macroschaal benaderingen die zijn gebruikt voor de komende decennia de reactie van gekweekte EG tot en met shear te onderzoeken. Deze omvatten parallelle plaat stromingskamers, cilindrische buizen, en de kegel-plaat viscometers, die elk ongeveerPablo van het opleggen van stabiele, laminaire Poiseuille stroming (overzicht in 16). Wijzigingen in deze apparaten kunnen produceren tijdelijke of ruimtelijke variaties in wandschuifspanning of zelfs herhalen arteriële golfvormen. 6 Echter, in het algemeen zijn deze apparaten vereisen een grote hoeveelheid media, zijn duur om te fabriceren, minder flexibel, en last hebben van relatief geringe capaciteit.
Beperkingen bestaan ook met behulp van de VMMCs. Deze apparaten zijn ontworpen op basis van parallelle plaat flow-theorie dat zij een oneindige breedte op zich neemt. Dit is een redelijke aanname voor macroschaal apparaten waar de breedte is veel groter dan de hoogte. De eindige breedte van de kanalen microfluïdische noodzakelijk dat studies worden geleid langs het midden van de langsas van het kanaal zijwand effect te elimineren, het feitelijke τ w varieert met w afhankelijk van het kanaal aspect ratio. 1, 7 Evenzo , worden de metingen niet gedaan afsluiten to de in-en uitgang van de kanalen naar de ingang te vermijden. We hebben uitgesloten significante paracriene signalering effecten of een ontsteking veroorzaakt door letsel of schade aan de EG-veroorzaakt door het afdichten van het apparaat op de monolaag als een bijdrage aan onze waargenomen reacties. PDMS een hoge affiniteit voor hydrofobe moleculen die kunnen leiden tot de opname van uitgescheiden chemokinen en niet-specifieke interacties tussen leukocyten en VMMC. We hebben echter niet gevonden dat dit een probleem zijn voor de duur van onze studies. 2
Het gebruik van stroom apparaten met gekweekte cellen is een reductionistische benadering die mechanistische studies en de demonstratie van oorzaak en gevolg maakt met betrekking tot de shear stress. Echter, een beperking van een in-vitro benadering is de veronderstelling dat het voldoende zal de complexiteit van het milieu in de eigen bloedvaten samen te vatten. In vivo, endotheelcellen chronisch zijn aangepast aan de complexe stromingspatronen enonderworpen zijn aan interacties met andere cellen, matrix, en humorale bemiddelaars die hun gedrag te reguleren.
Het is opmerkelijk dat alle van de resultaten hierboven, zijn op korte termijn modellen en als zodanig wellicht niet de tijd invariant. Ze zijn echter representatief voor experimenten die vaak we uit te voeren om te onderzoeken mechanisme op grond van een acute inflammatoire uitdaging. Een relevante strategie voor onze studie is het monitoren van veranderingen ten opzichte van een ontsteking basislijn van een lage dosis TNF-α stimulatie, waarvoor 4 uur vertegenwoordigt de geschatte piek in VCAM-1 expressie. We hebben beschreven in diverse onderzoeken dat veranderingen in de oppervlakte-expressie van VCAM-1 correleren met verbeterde monocyten rekrutering onder deze omstandigheden. 2-4, 17
Bovendien kan de keuze van SS golfvorm oproepen differentiële endotheliale reacties. In onze representatieve protocol waarin we documenteren het gebruik van de VMMC om monocyten hechting gebeurtenissen in HAEC onder de voorwaarde onder s kwantificerenhoren spanningen gekozen om representatief zijn voor sites van de relatieve weerstand (HSS) en gevoeligheid (OSS) tot de atherogenese in de slagaders in een aangepaste cel scheren apparaat. In overeenstemming met eerdere bevindingen in gekweekte EG, HSS verzwakt de respons op cytokine activatie ten opzichte van OSS. 12, 13 De resultaten zijn in overeenstemming met een grotere tolerantie voor inflammatoire activering van EG op plaatsen van stroom storing in vivo. Hoewel deze voorwaarden wordt vaak gebruikt om ongestoord en verstoorde doorstroming respectievelijk vertegenwoordigen, hebben ze niet volledig herhalen de complexiteit van de stroming in de slagaders. Echter, een schat aan literatuur ondersteunt het gebruik ervan zo simpel benaderingen die op adequate wijze te reproduceren de meest opvallende stroom functies. 14
Met name onze conus-plaat gebaseerde CSD kan genereren meer complexe golfvormen en conditionering cellen langer als eerder beschreven. 6 Zo koppelen van de VMMC de CSD in de beschreven protocol zorgt voor een maximale mate van flexibiliteit. Een onderzoek van deze aanpak is de oriëntatie van de VMMC ten opzichte van de richting van afschuiving conditionering in de CSD, waarin HAEC ervaring stromen in omtreksrichting. In de praktijk VMMC is georiënteerd zodat kanalen evenwijdig aan het stroming en de inlaat stroomopwaarts van geconditioneerde cellen zoveel mogelijk. De kanalen zijn klein genoeg dat dit een redelijke benadering is. Maar ook aangetoond in een eerdere studie stromen monocyten evenwijdig aan of loodrecht op de richting van afschuiving conditionering in de VMMC niet de resultaten weergegeven in figuur 2 beïnvloeden. 2
Aanvullende overwegingen in verband met in-vitro-technieken zijn variabiliteit veroorzaakt door fenotypische drift in verband met seriële passage van de EG in de cultuur en de heterogeniteit in geïsoleerde EG of monocyten. HAEC moet over het algemeen gebruikt worden door de passage 6 en elke partijgekenmerkt een consistente inflammatoire respons op TNF-α. Het gebruik van een cellijn, zoals THP-1 kan de variabiliteit van het gebruik van monocyten, die variëren van de activiteit van donor en gemakkelijk geactiveerd door de isolatie. Om reproduceerbare en nauwkeurige functionele uitlezingen celpreparaat en overstaptijden worden geminimaliseerd. De zorgvuldige selectie van de controles is noodzakelijk om zinvolle interpretatie van de resultaten. Afhankelijk van de experiment kan deze omvatten onbehandeld of statische-gekweekte cellen, TNF-α behandeling, niet-geactiveerde THP-1-cellen, het gebruik van blokkerende antilichamen, siRNA of farmacologische remmers, en anderen.
Als bewijs van de veelzijdigheid van de aanpak, hebben we toegepast deze apparaten op cytokine-, 2 lipide-3, 4 en RAGE-geïnduceerde 5 ontsteking te onderzoeken in HAEC. Onze studies hebben opgenomen het meten van de inflammatoire potentieel van serum-afgeleide lipide deeltjes uit de menselijke subjects op endotheelcellen 3, 4 en monocyten. 17 In een andere strategie kan monocyten worden gepresenteerd substraten gederivatiseerd met geïmmobiliseerd moleculen zoals VCAM-1 tot hechtingsmechanismen onderzoeken. Met deze methode wij eerder vertoonde een functionele rol voor het adhesiemolecuul CD11c, die met zeer laat antigeen (VLA) -4 in monocyten adhesie aan VCAM-1 samenwerkt tijdens dyslipidemie bij mensen 17 en muizen. Monocyten 18 Aangezien gemakkelijk worden geactiveerd door hun isolement, hebben we ook een volbloed test voor gebruik met onze lab-chip apparaat zorgen voor meer gevoelige en reproduceerbare detectie. 17
Uiteindelijk, naast het verstrekken van inzicht in de vroege inflammatoire gebeurtenissen ten grondslag liggen aan atherosclerose, zien wij dat deze technologie ontwikkeling zal naar trouwe ex vivo benaderingen leiden voor de beoordeling van een individuele risico van een ontsteking-gemedieerde hart-en vaatziekten, bestrating de way voor de ontwikkeling van gepersonaliseerde diagnostiek die verslag uitbrengen over de monocyten en de EG-activering.
| Cone-en-Plate Cell Shearing Device | ||
| Cone in een straal van | 0,06985 | m |
| Cone Hoek | 0,00877 (0,5 °) | rad (graden) |
| Gap Hoogte | 20 ± 10 | um |
| Max Angular Velocity (voor experimenten hier beschreven) | 18,85 | rad / s |
| Kinematische viscositeit | 0,00077 | m 2 / s |
| Max R-nummer (voor experimenten hier beschreven) | 0.000758 | dimensieloze |
| VMMC Specificaties | ||
| Kanaal Lengte | 8,0 | mm |
| Kanaal Hoogte | 60 | um |
| Kanaalbreedte | 2 | mm |
| Getal van Reynolds | 1,67 | dimensieloze |
Tabel 1. CSD en VMMC specificaties.
Figuur 4. Dwarsdoorsnede van de kegel-plaat cel scheren apparaat (CSD). De CSD bestaat uit een roestvrij stalen cilindrische kegel die ronddraait boven een stationaire celkweek substraat. De kegelhoek en spleethoogte zijn kritische parameters dat de aard van de schaar veld in de aanwezigheid van kweekmedium definiëren. Een gewijzigde Reynolds getal dat de verhouding van centrifugale krachten viskeuze wordt gegeven door:
<br />
waarbij r kegel straal ω is hoeksnelheid α is kegelhoek en ν de kinematische snelheid van de vloeistof. Wanneer R << 1 centrifugaalkrachten laag, stroming laminair en zuiver azimuthale en de geïnduceerde schuifspanning constant over de monolaag. Onze 19 CSD, wordt het substraat met gekweekte cellen geladen vanaf de onderkant in de kamer die de huizen kegel. Medium wordt toegevoegd aan de kamer en als de afschuiving vloeistof. De kegel wordt gemonteerd met vooraf geladen lagers en de rotatie aangedreven door een micro-stappenmotor. Een precisie leveling systeem houdt uitlijning loodrecht op de cel substraat. De spleethoogte (bepaald door de afstand van het laagste punt van de cel substraat) is een zeer nauwkeurige dieptemeter. Een vet te vangen en media afdichting zijn om ervoor te zorgen dat de kamer waarin de cellen is schoon en vrij van olie en vuil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH / NHLBI subsidie R01 HL082689 van Scott I. Simon en Anthony G. Passerini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
