Summary
Câmaras de fluxo microfluídicos gravados por fotolitografia e fabricada a partir de PDMS são aplicados para sondar os resultados funcionais associados com disfunção CE e inflamação. Numa experiência representativa, a capacidade de tensão de cisalhamento diferencial para modular a adesão celular monocítica a citocina activado CE monocamadas é demonstrada.
Abstract
A aterogênese é potencializado por anormalidades metabólicas que contribuem para um elevado estado de inflamação sistêmica, resultando em disfunção endotelial. No entanto, as primeiras alterações funcionais no endotélio que significam um nível individual de risco não estão diretamente avaliada clinicamente para ajudar a estratégia de guia terapêutico. Além disso, a regulação da inflamação por hemodinâmica local contribui para a distribuição não aleatória espacial da aterosclerose, mas os mecanismos são difíceis de delinear in vivo. Descrevemos uma abordagem lab-on-a-chip baseado quantitativamente perturbação metabólica ensaio de eventos inflamatórios em células endoteliais humanas (CE) e monócitos em condições de fluxo precisos. Métodos padrão de litografia suave são usados para microfabricate vasculares miméticos câmaras microfluídicos (VMMC), que são ligados directamente para monocamadas de cultura da CE. 1 Esses dispositivos têm a vantagem de utilizar pequenos volumes de reagentes enquantoproporcionando uma plataforma para imagiologia directamente os eventos inflamatórios na membrana de CE expostos a um campo de cisalhamento bem definida. Temos aplicado com sucesso estes dispositivos para investigar-citocina, 2 lípido-3, 4 e RAGE inflamação induzida por 5 em aorta humana CE (AHCE). Aqui temos documentar a utilização do VMMC para a célula monocítica ensaio (THP-1) de rolamento e parada em monocamadas HAEC que são condicionadas sob características diferenciais de cisalhamento e activado pela citoquina inflamatória TNF-α. Estudos como estes estão fornecendo uma visão mecanicista em atherosusceptibility sob fatores de risco metabólicos.
Protocol
1. Cultura de Células e Preparação do Substrato
- Cortar 3 polegadas substratos circulares de um prato 100 20 milímetros x cultura de tecido (BD Falcon), utilizando um torno. Esterilizar substratos por submersão em etanol a 70%. Colocar em uma placa de Petri e revestimento com 4 ml de colagénio tipo I (100 ug / ml) durante 1 h à temperatura ambiente, em seguida lavar com 4 ml de 1 x PBS.
- Suspender Humanos células endoteliais aórticas (AHCE, a passagem 4-6) em 5 6.5x10 células / ml e de sementes aplicando 1 ml directamente ao substrato. Colocar em um 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora e permitir que as células aderem ao substrato durante 1 hora.
- Adicionar 9 ml de crescimento endotelial Médio-2 (EGM-2) suplementado com 1x solução de antibiótico-antimicótico para as células. Alterar meios cada 2 dias até as células atingirem 90% de confluência.
- Manter células THP-1 em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS e solução 1x antibiótico-antimicótico. Células de passagem quando atingem uma densidade de 10 6 células / ml.
2. Protocolo Shearing celular
As células são condicionados numa personalizado dispositivo de corte de cone e prato-Cell (CSD). Detalhes do dispositivo e as especificações de concepção estão documentados na Tabela 1 e Figura 4.
- Prepare o CSD. Esterilizar a caixa de uma câmara com etanol e lavar com PBS estéril. Aquecer a carcaça para 37 ° C e nível para garantir que o cone é perpendicular à monocamada de células. Montar o substrato com as células a partir do fundo da caixa e definir o cone para a altura desejada.
- Use Leibovitz-15 (L-15) meio suplementado com BulletKit endotelial como o meio de corte para manter o pH apropriado na ausência de CO 2. Para estimular a inflamação, adicionar necrose tumoral-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) ao meio de corte e injectar 6 ml no dispositivo através de uma seringa ligada a um orifício de entrada, tendo o cuidado de não introduzir arbolhas no interior da câmara.
- Células de cisalhamento com uma elevada tensão de corte magnitude constante (HSS, 15 dyne / cm 2) ou uma tensão de cisalhamento oscilatório (OSS, 0 ± 5 dines / cm 2, 1 Hz) durante 4 horas. A SS desejado é conseguido pela rotação do cone acima das células, o que é precisamente controlado com um motor de micro-stepping como descrito anteriormente 6 A SS parede na superfície (τ w) é aproximada por.:
onde μ é a viscosidade do meio, ω é a velocidade angular do cone, e α é o ângulo de cone (0,5 °). O alinhamento de cone com o substrato é ajustada para dentro 0,05 ° por meio de nivelamento de precisão e da altura lacuna fixado em 20 ± 10 mM usando um medidor de profundidade para minimizar a variação circunferencial e radial em τ w. O dispositivo foi validado para garantir características de fluxo laminar. Remova cells a partir do dispositivo e preparar para a análise de adesão de monócitos.
3. Fabricação de PDMS microfluídicos Câmara
- Obter molde mestre para o número do canal desejado microfluídicos e altura do canal, dependendo da aplicação. As características da concepção específica utilizada neste protocolo são detalhados na Tabela 1. O método para criar estes já está bem documentado na literatura. 1 Resumidamente, a rede de canais é concebido usando software de CAD (Autodesk Inventor) e impresso em 5000 dpi em uma transparência. Fotorresiste negativo (SU8) é fiado em uma pastilha de silício até uma espessura de 100 mm. A transparência é sobreposto e expostas à luz UV. Non-polimerizado material fotosensitivo é removida para gerar a réplica de mestre positivo.
- Para fazer a solução de PDMS base de silicone mistura com silicone agente de cura 10:01, em peso, de um barco pesar e agita-se com uma pipeta de 5 ml serológico. Tenha cuidado para não raspar as paredespesar do barco para evitar a adição de flocos de plástico para a solução.
- Coloque a bolacha mestre em uma placa de Petri 100x15mm e despeje a solução de PDMS para o prato.
- Cobrir o prato e colocá-lo dentro de um recipiente a vácuo durante 15 minutos para remover bolhas. Depois de 15 minutos tomar a placa de Petri para fora e remover as bolhas excesso suavemente soprando ar sobre a superfície.
- Colocar a placa de Petri num forno durante 1 hora a 70 ° C. Retire o prato e cortar as câmaras microfluídicos utilizando uma lâmina afiada.
4. Montagem do dispositivo em Microscópio
- Ligue fonte de luz para microscópio invertido e definir aquecedor para 37 ° C. Anexar tubagem para uma seringa de 10 ml e encher com água destilada de modo que não existem bolhas. Coloque a seringa na bomba de seringa ea taxa de fluxo conjunto para induzir uma parede de SS 1 dine / cm 2. A tensão de cisalhamento de parede (τ w) gerado ao longo da linha central do canal é aproximada utilizando o padrãoequação para uma câmara de fluxo de placas paralelas:
onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, e w é a largura do canal. Nota: uma vez que os canais são de largura finita a real τ w irá variar com w dependendo do canal relação de aspecto, e as medições são evitados a 25% mais próximo das paredes laterais. 1,7 - Coloque PDMS câmara em água e usar uma micropipeta 100 uL para remover o ar a partir dos canais individuais. Ligue o adaptador de câmara de vácuo para garantir que a válvula está definido para fora.
- Coloque placa de Petri com AHCE monocamada sobre o objetivo. Coloque a câmara de PDMS sobre a placa de Petri e cuidadosamente ajustado na monocamada AHCE enquanto assegurando que não existem bolhas de ar formam entre o dispositivo ea monocamada. Gire a válvula para que o vácuo é ligado ea câmara está bem encaixada. Cortar 19 agulhas de calibre sem corte tal que existe apenas 5 mm de lado esquerdo do metal. Encha o reservatório de plástico com tampão e colocar em PDMS entrada da câmara. Repetir para número apropriado de canais a serem utilizados. Anexar tubulação de bombas de seringa para saídas de PDMS canal.
5. Ensaio de adesão de monócitos Sob tensão de cisalhamento
- Suspender células THP-1 em 2x10 6 células / ml em HBSS + Ca 2 + / Mg + + 2 HSA a 0,1%. Activar células THP-1, por incubação com factor-1 derivado do estroma (SDF-1, 50 ug / ml) durante 15 min à temperatura ambiente.
- Ligue bomba de seringa para estabelecer o fluxo, em seguida, adicionar 50 ul de suspensão de células para o reservatório sem a introdução de bolhas de ar. Quando o fluxo é totalmente desenvolvido, comece a aquisição de dados.
- Executar durante 5 min a taxa de fluxo adequado, adicionando tampão para o reservatório se a solução fica baixo. Continue fluindo tampão para os canais para lavar as células não ligadas na corrente de fluxo.
6. Aquisição de Dados e Análise
- Adquirir sequências de imagens digitais em 3 de imagens / s durante 2 min após o fluxo totalmente desenvolvida ao longo do eixo longitudinal do canal, 3 localizações no canal, tendo cuidado para não gravar imediatamente após a entrada ou antes ou aberturas de saída no 25% mais próximo do lado paredes.
- Contar o número de células presos por campo, identificando a sua aparência fase brilhante no mesmo plano focal como a monocamada.
- Prisão célula firme é definida pelo movimento <½ diâmetro da célula em 10 s. Média de dados com mais de 3 campos aleatórios / canal e quantificar usando software ImageJ.
7. Os resultados representativos
Embora o endotélio vascular é uniformemente expostas a agonistas que contribuem para a inflamação sistémica, a aterosclerose é uma doença focal que se desenvolve preferencialmente em locais de perturbação do fluxo nas artérias, implicando heterogeneidade espacial da função endotelial. 8 9, 10 TNF-α induz uma resposta bem caracterizados em CE que inclui up-regulation de moléculas de adesão celular (CAM ; por exemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) e quimiocinas que recrutam monócitos da circulação, uma característica da lesão aterosclerótica precoce 11 Hemodinâmica é um importante regulador do fenótipo inflamatório endotelial 12 tensão de cisalhamento alta magnitude (HSS..; por exemplo de 15 dines / cm 2) ou tensão de corte pulsátil (PSS; por exemplo, 15 ± 5 dinas / cm 2) associados com sítios de resistência à aterosclerose em artérias down-regulam TNF-α as respostas induzidas. Por outro lado, baixa tensão de cisalhamento magnitude (LSS, por exemplo, 2 dinas / cm 2) ou de cisalhamento oscilatório (OSS; por exemplo, 0 ± 5 dinas / cm 2), característico de locais suscetíveis in vivo, exacerbar cytokine inflamação induzida 13., 14 Nossos dispositivos microfluídicos de PDMS fornecer uma plataforma para a realização de estudos sobre os mecanismos para testar hipóteses relacionadas com a superposição de estresse metabólico com fatores hidrodinâmicos na regulação da função endotelial e patologia. A utilidade e versatilidade da abordagem é amplamente ilustrado através dos resultados representativos que se seguem.
Figura 1. Tensão de cisalhamento diferencialmente modula THP-1 de adesão celular para monocamadas inflamadas de TNF-a endoteliais. Estes dados foram adquiridos utilizando o protocolo detalhado acima descritos e documentados no vídeo. Monocamadas HAEC foram simultaneamente expostos a uma dose baixa da citoquina inflamatória TNF-α (0,5 ng / ml, ~ CE 50 para VCAM-1 up-regulation) e quer HSS (15 dines / cm 2) ou OSS (0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz), em um CSD personalizado para 4 hr como descricama no protocolo detalhado. THP-1 de detenção celular foi quantificada sob fluxo de cisalhamento em uma câmara de fluxo PDMS. Esta linha de células que imita o fenótipo de monócitos humanos foi escolhido pela sua reprodutibilidade e facilidade de utilização. HSS atenuou a resposta inflamatória em comparação com OSS, resultando numa redução de detenção célula THP-1. Os dados foram analisados pelo teste t de Student e estão representados como média ± EPM de 3 experimentos independentes. Adaptado com permissão de DeVerse et al. 5
Os dados a seguir demonstram a versatilidade da nossa abordagem usando exemplos do nosso trabalho publicado. Saídas a partir do protocolo acima são indicados onde for aplicável.
Figura 2. Modulação da expressão de VCAM-1 induzida por citocina e recrutamento de monócitos em um gradiente de tensão de cisalhamento. A) monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h sob flow em uma VMMC desenhado com base Hele-Shaw teoria de fluxo. 15 Uma diminuição linear em magnitude SS ao longo da linha central do canal foi conseguida através da concepção de as paredes laterais da câmara de modo a coincidir com a simplifica de um fluxo de estagnação bidimensional e moldando o fim do canal para coincidir com as linhas de iso-potenciais. A tensão de cisalhamento de parede (τ w) gerado ao longo da linha central deste canal a uma distância axial a partir da entrada (x) é dada por:
onde μ é a viscosidade do meio, Q é o caudal volumétrico, h é a altura do canal, w 1 é a largura do canal de entrada, e L é o comprimento total do canal. Q foi escolhido para gerar um gradiente em magnitude SS a partir de 16 dines/cm2 na entrada a 0 no ponto de estagnação "a" apenas proximal ao outlet. B)-C) VCAM-1 expressão foi medida in situ por microscopia de imunofluorescência utilizando anticorpos conjugados com pontos quânticos e apresentados como percentagem de intensidade de fluorescência média (IFM) de não estimulada controlo estático. SS não modular o nível basal da expressão de VCAM-1, que é baixa em AHCE não estimulada (triângulos cinza). No entanto, a VCAM-1 em relação à expressão aumentada de TNF-α em magnitudes de LSS, atingindo um máximo de ~ 2 dines / cm 2 e retornando à linha de base de TNF-α ou abaixo em magnitudes de cisalhamento> 5 dinas / cm 2 (quadrados pretos). D) Os monócitos (10 6 / ml) foram perfundidos menos 2 dines / cm 2 por 5 min, em canais de fluxo paralelos sobre monocamadas pré-condicionadas como em A). Recrutamento de monócitos ao endotélio quantitativamente correlacionada com a expressão VCAM-1 com uma grandeza dada cisalhamento. Notavelmente, a capacidade para sondar VCAM-1 e expressão recrutamento de monócitos com resolução espacial muito bem em um monolayer revelou alterações significativas ao longo de um intervalo estreito em magnitude SS que não seria apreciada através da aplicação de apenas alguns valores discretos de cisalhamento em experiências separadas. Os dados foram analisados por ANOVA repetidas medidas e as diferenças avaliadas por pós-teste de Newman-Keuls, * P <0,05 a partir de TNF-α, em condições estáticas. Os dados são média ± EPM de 3-6 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Tsou et al. 2
Figura 3. Triglicéridos ricos em lipoproteínas (TGRL) modulam citocina induzida por inflamação em proporção aos níveis séricos de doadores de triglicéridos e VCAM-1 de expressão. Monocamadas HAEC foram estimuladas com TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 horas em simultâneo com TGRL (10 mg / dl ApoB) isolado a partir de sujeitos humanos após uma refeição com elevado de gordura em cultura estática. A) VCAM-1 expressão foi medida separadamente em CE suspenso por citometria de fluxoe adesão de monócitos quantificados utilizando um VMMC como descrito no protocolo detalhado. Os dados são apresentados como% de mudança de TNF-α. Prisão de monócitos variaram em proporção directa com endotelial VCAM-1 expressão, o que aumentou directamente com o nível de triglicéridos no soro dador. B) detenção de monócitos para um subconjunto de pró-inflamatórias dadores foi abolida na presença de um VCAM-1 anticorpo bloqueador. A significância foi determinada pelo emparelhado teste t de Student, médias ± SEM de 3-5 experimentos independentes. Adaptado com permissão de Wang et al. 4
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Discussion
Descrevemos a utilização de dispositivos microfluídicos PDMS para a avaliação no chip do fenótipo inflamatória endotelial através da imagem em tempo real da CAM expressão e adesão de monócitos. Uma grande vantagem da nossa abordagem reside na capacidade para quantificar resultados associados com a disfunção endotelial em células expostas a mediadores inflamatórios, tais como lípidos da dieta e citocinas, sob condições hidrodinâmicas definidos que espelham tensão de cisalhamento em vasos aterogênicas. O VMMC facilitar a utilização de pequenas quantidades de reagentes ou materiais que podem ser em quantidade limitada e têm as vantagens de ser barato, customizável e passível de alto rendimento.
A utilização de dispositivos microfluídicos representa uma alternativa às abordagens macroescala que têm sido utilizados há décadas para investigar a resposta de CE cultivadas a cisalhamento. Estes incluem câmaras de placas paralelas de fluxo, tubos cilíndricos, e cone e placa-viscosímetros, cada um dos quais é capable de impor estável, condições de fluxo laminar de Poiseuille (revisado em 16). Modificações para estes dispositivos podem produzir variações temporais ou espaciais na parede tensão de cisalhamento ou até mesmo recapitular arterial formas de onda. 6 No entanto, em geral, estes dispositivos requerem uma grande quantidade de meios de comunicação, são caros para fabricar, menos adaptável, e sofrem de rendimento mais baixo.
Também existem limitações com a utilização dos VMMCs. Estes dispositivos são projetados com base na teoria de placas paralelas de fluxo, que assume largura infinita. Esta é uma suposição razoável para dispositivos macroescala, onde a largura é muito maior que a altura. No entanto, a largura finita dos canais microfluídicos exige que os estudos ser conduzido ao longo do centro do eixo longitudinal do canal para eliminar os efeitos de parede laterais, como o real τ w irá variar com w dependendo da razão de aspecto de canal. 1, 7 Similarmente , as medições não forem tomadas t estreitao A entrada e saída de canais para evitar efeitos de entrada. Temos descartou qualquer significativas parácrinos efeitos de sinalização ou inflamação induzida por lesão ou danos causados por CE selando o dispositivo para a monocamada como contribuindo para as nossas respostas observadas. PDMS tem uma elevada afinidade para moléculas hidrofóbicas, o que poderia levar à absorção de quimiocinas secretadas e interacções não específicas entre os leucócitos e os VMMC. No entanto, não têm encontrado que este seja um problema para a duração de nossos estudos. 2
O uso de dispositivos de fluxo com células cultivadas constitui uma abordagem reducionista que facilita os estudos mecanicistas ea demonstração de causa e efeito com relação a tensão de cisalhamento. No entanto, uma limitação de qualquer abordagem in vitro é a suposição de que ele irá adequadamente recapitular a complexidade do ambiente em artérias nativas. In vivo, as células endoteliais são cronicamente adaptado para padrões de fluxo de complexos eestão sujeitos a interacções com outras células, da matriz, e mediadores humorais que regulam o seu comportamento.
É digno de nota que todos os resultados apresentados acima são de curto prazo modelos e como tal pode não ser invariantes no tempo. No entanto, eles são representativos de experiências que normalmente executa para investigar mecanismo sob um desafio inflamatória aguda. Uma estratégia relevante para os nossos estudos é monitorizar as alterações de uma linha de base inflamatória de baixa dose de estimulação de TNF-α, para o qual 4 hr representa o pico aproximado em expressão de VCAM-1. Temos documentado em vários estudos que as alterações na expressão de superfície de VCAM-1 correlacionam-se com o recrutamento de monócitos reforçada sob estas condições. 2-4, 17
Além disso, a escolha da forma de onda SS pode evocar diferenciais respostas endoteliais. No nosso protocolo representativa que documentar a utilização do VMMC para quantificar os eventos de adesão de monócitos em AHCE condicionadas sob souvir tensões escolhido para ser representante dos sítios de resistência relativa (HSS) e suscetibilidade (OSS) para a aterogênese em artérias em um dispositivo personalizado célula de corte. Consistente com os achados anteriores em CE cultivadas, HSS atenuou a resposta à ativação de citocinas em relação ao OSS. 12, 13 Os resultados são consistentes com uma maior permissividade para a ativação inflamatória da CE em locais de distúrbio do fluxo in vivo. Embora essas condições são comumente usados para representar o fluxo não perturbada e perturbados, respectivamente, estes não totalmente recapitular a complexidade do fluxo nas artérias. No entanto, a riqueza da literatura suporta a sua utilização como simples aproximações que reproduzem de forma adequada as características de fluxo salientes 14.
Notavelmente, a nossa cone e prato-baseado CSD é capaz de gerar formas de onda mais complexa e células condicionado por períodos mais longos como anteriormente relatados. 6 Assim, o emparelhamento VMMC com o CSD na pr descritootocol confere um grau máximo de flexibilidade. Uma consideração desta abordagem reside no orientação do VMMC com respeito à direcção de condicionamento de cisalhamento na CSD, em que o fluxo de AHCE experiência na direcção circunferencial. Na prática, o VMMC é orientada de modo que os canais são paralelas com o campo de fluxo e na entrada a montante de células condicionado tanto quanto possível. Os canais são pequenos o suficiente para que isso representa uma aproximação razoável. No entanto, também demonstrado em um estudo anterior que os monócitos que fluem paralelas ou perpendiculares à direcção de condicionamento de cisalhamento na VMMC não afectou os resultados mostrados na Figura 2. 2
Considerações adicionais associados com técnicas in vitro incluem a variabilidade induzida pelo desvio fenotípica associada passaging série do CE na cultura e heterogeneidade na CE isolado ou monócitos. AHCE deve tipicamente ser usado por passagem 6 e cada lotecaracterizada por uma resposta consistente inflamatória a TNF-α. A utilização de uma linha de células, tais como THP-1 pode reduzir a variabilidade associados com o uso de monócitos, que variam em actividade de dador e são facilmente activado por seu isolamento. A fim de assegurar reprodutíveis e precisas leituras funcionais, a preparação de células e os tempos de transferência deve ser minimizada. A selecção cuidadosa dos controlos é necessário significativamente interpretar os resultados. Dependendo do experimento, estes podem incluir células não tratadas ou estático-cultivadas, TNF-α de tratamento, unactivated células THP-1, o uso de anticorpos de bloqueio, siRNAs ou inibidores farmacológicos, e outros.
Como prova da versatilidade da abordagem, temos aplicado esses dispositivos para investigar citocinas, 2 de lipídios-3, 4 e RAGE inflamação induzida por 5 em AHCE. Os nossos estudos têm incluído a medição do potencial inflamatório de partículas de soro derivadas de lípidos a partir s humanoubjects sobre as células endoteliais 3, 4 e monócitos. 17 Em uma estratégia alternativa, os monócitos podem ser apresentados com substratos derivatizados com moléculas imobilizadas, tais como a VCAM-1 para examinar os mecanismos de adesão. Utilizando esta abordagem, foi previamente demonstrado um papel funcional para a molécula de adesão CD11c, que coopera com o antigénio muito tarde (VLA) -4 na adesão de monócitos para VCAM-1 em seres humanos durante a dislipidemia 17 e ratinhos. 18 Uma vez que os monócitos pode ser facilmente activado por o seu isolamento, também desenvolveu um ensaio de sangue total para utilização com o nosso dispositivo de laboratório-chip para permitir uma detecção mais sensível e reprodutível. 17
Em última análise, além de fornecer insights sobre os primeiros eventos inflamatórios subjacentes aterosclerose, prevemos que este desenvolvimento da tecnologia vai levar a abordagens in vivo ex fiéis para avaliar o risco individual de doença mediada por inflamação cardiovascular, abrindo o way para o desenvolvimento de diagnósticos personalizados que informam sobre a ativação de monócitos e CE.
| Cone e Placa-dispositivo de corte celular | ||
| Raio Cone | 0,06985 | m |
| Ângulo do cone | 0,00877 (0,5 °) | rad (graus) |
| Altura Gap | 20 ± 10 | mM |
| Max Velocidade Angular (para experiências descritas aqui) | 18,85 | rad / s |
| Viscosidade cinemática | 0,00077 | m 2 / s |
| O número máximo R (para experiências descritas aqui) | 0.000758 | adimensional |
| Especificações VMMC | ||
| Comprimento do canal | 8 | milímetro |
| Altura Canal | 60 | mM |
| Largura de canal | 2 | milímetro |
| Número de Reynolds | 1,67 | adimensional |
Tabela 1. Especificações CSD e VMMC.
Figura 4. Vista em corte transversal de cone e prato-dispositivo de corte de célula (CSD). A CSD é constituído por um cone de aço inoxidável cilíndrico que gira acima de um substrato estacionário de cultura de células. O ângulo de cone e altura lacuna são parâmetros críticos que definem a natureza do campo de cisalhamento produzidas na presença de meio de cultura. Uma modificação do número de Reynolds mostrando a relação da centrífuga para forças viscosas é dada por:
<br />
em que r é o raio do cone, ω é a velocidade angular, α é ângulo do cone, e ν é a velocidade cinemática do fluido. Quando R é um << forças centrífugas são baixos, o fluxo é laminar e puramente azimutal, ea tensão de cisalhamento induzida é constante ao longo da monocamada. 19 No nosso CSD, o substrato com células de cultura é carregado a partir do fundo para a câmara de que abriga o cone. O meio é adicionado à câmara e usado como fluido de cisalhamento. O cone é montado com rolamentos de pré-carregadas de precisão e à rotação accionada por um motor de micro-intensificação. Um sistema de nivelamento de precisão mantém perpendicular alinhamento com o substrato da célula. A altura gap (definida pela distância a partir do vértice do cone com o substrato da célula) é ajustado com um medidor de profundidade de alta precisão. A graxa pegar e mídia selo estão no local para garantir que o caixa de uma câmara das células é mantido limpo e livre de óleo e detritos.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi suportado pelo R01 concessão de NIH / NHLBI HL082689 para Scott I. Simon e Anthony G. Passerini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
