Summary
Cámaras de flujo de microfluidos grabadas por fotolitografía y fabricada a partir de PDMS se aplican para investigar los resultados funcionales asociados con la disfunción CE y la inflamación. En un experimento representativo, la capacidad de esfuerzo cortante diferencial para modular la adhesión celular monocítica a citoquina activado monocapas CE se demuestra.
Abstract
La aterogénesis es potenciada por las alteraciones metabólicas que contribuyen a un estado de inflamación sistémica que resulta en la disfunción endotelial. Sin embargo, los primeros cambios funcionales en el endotelio que significan un nivel individual de riesgo no están directamente evaluados clínicamente para ayudar a guiar la estrategia terapéutica. Por otra parte, la regulación de la inflamación mediante la hemodinámica local contribuye a la distribución espacial no aleatoria de la aterosclerosis, pero los mecanismos son difíciles de delimitar en vivo. Se describe un enfoque basado en el laboratorio-en-un-chip a la perturbación determinar cuantitativamente metabólica de eventos inflamatorios en las células endoteliales (CE) y los monocitos bajo condiciones de flujo precisos. Los métodos estándar de la litografía blanda se utilizan para microfabricate vasculares cámaras miméticos de microfluidos (VMMC), que se enlazan directamente a los cultivos de monocapas de la CE. 1 Estos dispositivos tienen la ventaja de utilizar pequeñas cantidades de reactivos, mientras queproporcionar una plataforma para formación de imágenes directamente los sucesos inflamatorios en la membrana de CE expuesto a un campo de cizallamiento bien definido. Se han aplicado con éxito estos dispositivos para investigar citoquinas, 2 lípido-3, 4 y RAGE-5 inducida por la inflamación en humana CE aórtico (AHCE). Aquí se documenta el uso de la VMMC a la celda de ensayo de monocítica (THP-1) a la rodadura y la detención en monocapas AHCE que están condicionados en las características diferenciales de corte y se activa por la citoquina inflamatoria TNF-α. Estudios como estos son proporcionar una visión mecanicista en atherosusceptibility en caso de factores de riesgo metabólicos.
Protocol
1. Cultivo de células y Preparación del substrato
- Cortar 3-pulgadas sustratos circulares de un 100 x 20 mm plato de cultivo de tejidos (BD Falcon), utilizando un torno. Esterilizar sustratos por inmersión en etanol al 70%. Colocar en un plato de Petri y la capa con 4 ml de colágeno de tipo I (100 ug / ml) durante 1 hora a temperatura ambiente, luego enjuague con 4 ml de PBS 1 x.
- Suspender Humanos células endoteliales aórticas (AHCE, paso 4-6) en 6.5x10 5 células / ml y de las semillas mediante la aplicación de 1 ml directamente sobre el sustrato. Colocar en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora y permitir que las células se adhieren al sustrato durante 1 hora.
- Añadir 9 ml de medio de crecimiento endotelial-2 (MEG-2) suplementado con 1x antibiótico-antimicótico solución a las células. Cambiar los medios de comunicación cada 2 días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia.
- Mantener células THP-1 en medio RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% y solución 1x antibiótico-antimicótico. Pasaje de las células cuando llegan a una densidad de 10 6 células / ml.
2. Protocolo de la célula Shearing
Las células son acondicionados en una costumbre de cono y placa de dispositivo de cizallamiento de la célula (CSD). Detalles de dispositivos y especificaciones de diseño se documentan en la Tabla 1 y Figura 4.
- Preparar la CDS. Esterilizar la carcasa de una cámara con etanol y enjuagar con PBS estéril. Se calienta la vivienda a 37 ° C y nivel para asegurar que el cono es perpendicular a la monocapa de células. Montar el substrato con las células de la parte inferior de la carcasa y establecer el cono a la altura deseada.
- Utilizar Leibovitz-15 (L-15) medio suplementado con BulletKit endotelial como el medio de cizallamiento para mantener el pH apropiado en ausencia de CO 2. Para estimular la inflamación, añadir factor de necrosis tumoral α (TNF-α, 0,5 ng / ml) al medio de cizallamiento e inyectar 6 ml en el dispositivo a través de una jeringa conectada a un puerto de entrada, teniendo cuidado de no introducir aireburbujas en la cámara.
- Las células de corte en un esfuerzo de cizalla de magnitud constante (HSS, 15 dinas / cm 2) o un esfuerzo cortante oscilatorio (OSS, 0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz) durante 4 horas. La SS deseado se consigue mediante la rotación del cono por encima de las células, que se controla con precisión con un motor de micro-paso a paso como se describió anteriormente 6 La SS pared en la superficie (τ w) se aproxima por.:
donde μ es la viscosidad del medio, ω es la velocidad angular del cono, y α es el ángulo de cono (0,5 °). La alineación de cono con el substrato se ajusta dentro de 0,05 ° a través de nivelación de precisión y la altura hueco fijado en 20 ± 10 micras utilizando un medidor de profundidad para minimizar la variación circunferencial y radial en τ w. El dispositivo ha sido validada para garantizar las características de flujo laminar. Quite la canas desde el dispositivo y preparar un análisis de la adhesión de los monocitos.
3. Fabricación de PDMS de microfluidos Cámara
- Obtener el molde maestro para el número deseado y la altura de canal de microfluidos del canal dependiendo de la aplicación. Las características del diseño específico utilizado en este protocolo se detallan en la Tabla 1. El método para la creación de estos ya está bien documentado en la literatura. 1 Brevemente, la red de canales está diseñado utilizando software CAD (Autodesk Inventor) y se imprimen en 5000 dpi en una transparencia. Fotorresistencia negativa (SU8) se hace girar sobre una oblea de silicio a un espesor de 100 micras. La transparencia se superpone y se expone a luz ultravioleta. No polimerizado fotorresistente se elimina la generación de la maestra réplica positiva.
- Para preparar una solución de PDMS mezcla base de silicona con silicona agente de curado de 10:1 en peso en un barco de pesar y mezclar con una pipeta serológica de 5 ml. Tenga cuidado de no raspar las paredesdel pesaje barco para evitar la adición de escamas de plástico a la solución.
- Coloque las tabletas en un maestro de 100x15mm placa de Petri y se vierte la solución de PDMS en el plato.
- Cubra el recipiente y colóquelo en un recipiente al vacío durante 15 minutos para eliminar las burbujas. Después de 15 minutos tomar la placa de Petri y para quitar cualquier exceso de burbujas de aire que sopla suavemente sobre la superficie.
- Colocar la placa de Petri en un horno durante 1 hora a 70 ° C. Retirar el plato y cortar las cámaras de microfluidos con una cuchilla afilada.
4. Montaje del dispositivo en el microscopio
- Encienda la fuente de luz para microscopio invertido y el calentador de hasta 37 º C. Fije el tubo a una jeringa de 10 ml y llenar con agua destilada tal que no hay burbujas. Coloque la jeringa en la bomba de jeringa y caudal establecido para inducir una pared de SS 1 dinas / cm 2. La tensión de cizallamiento (τ w) generado a lo largo de la línea central del canal se aproxima utilizando el estándarecuación para una cámara de flujo de placas paralelas:
donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, y w es la anchura del canal. Nota: puesto que los canales son de anchura finita la real τ w variará con w en función del canal relación de aspecto, y las mediciones se evitan en el 25% más cercana de las paredes laterales. 1,7 - Coloque PDMS cámara en agua y utilizar una micropipeta 100μl para eliminar el aire de los canales individuales. Conecte el adaptador de vacío a la cámara de asegurarse de que la válvula está desactivado.
- Colocar placa de Petri con monocapa AHCE sobre el objetivo. Coloque la cámara de PDMS sobre la placa de Petri y con cuidado lo establecido en la monocapa AHCE tiempo que se garantiza que no se formen burbujas de aire entre el dispositivo y la monocapa. Gire la válvula de modo que el vacío está activado y la cámara está bien sujeto. Cortar 19 agujas de calibre romos tal que hay sólo 5 mm de izquierda de metal. Llene el depósito de plástico con amortiguador y poner en PDMS entrada de la cámara. Repetir para el número adecuado de canales a ser utilizados. Conecte el tubo de las bombas de jeringa para que las salidas de los canales de PDMS.
5. Ensayo de adhesión de los monocitos bajo una tensión cortante
- Suspender células THP-1 a 2x10 6 células / ml en HBSS + Ca 2 + / Mg 2 + HSA + 0,1%. Activar células THP-1 por incubación con factor-1 de derivados del estroma (SDF-1, 50 mg / ml) durante 15 min a temperatura ambiente.
- Encienda bomba de jeringa para establecer el flujo, a continuación, añadir 50 l de suspensión de células al depósito sin introducir burbujas de aire. Una vez que el flujo está totalmente desarrollado, comienzan la adquisición de datos.
- Ejecutar durante 5 minutos a velocidad de flujo apropiado, la adición de tampón para el depósito si la solución está baja. Continúa fluyendo de búfer en los canales para vaciar las células no consolidados en la corriente de flujo.
6. Adquisición de Datos y Análisis
- Adquirir secuencias digitales de imagen en 3 fotogramas por segundo para 2 minutos después de flujo completamente desarrollado a lo largo del eje longitudinal del canal en 3 sitios en el canal, teniendo cuidado de no grabar inmediatamente después de la entrada o antes de los puertos de salida o en el 25% más cercana al lado paredes.
- Cuente el número de células detenidas por campo mediante la identificación de su fase brillante aparición en el mismo plano focal que la monocapa.
- Detención Firma célula se define por el movimiento <diámetro ½ celular en 10 s. Datos promedio de más de 3 campos al azar por canal y cuantificar el uso de software ImageJ.
7. Los resultados representativos
Aunque el endotelio vascular está expuesta de manera uniforme a los agonistas que contribuyen a la inflamación sistémica, la aterosclerosis es una enfermedad focal que se desarrolla preferentemente en los lugares de la perturbación del flujo en las arterias, lo que implica la heterogeneidad espacial de la función endotelial. 8 9, 10 de TNF-α induce una respuesta bien caracterizado en la CE, que incluye la regulación de las moléculas de adhesión celular (CAM , por ejemplo, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina) y quimiocinas que reclutan a los monocitos de la circulación, un sello distintivo de la lesión aterosclerótica temprana 11 Hemodinámica es un importante regulador de fenotipo inflamatorio endotelial 12 de alta tensión cortante de magnitud (HSS..; por ejemplo, 15 dinas / cm 2) o el estrés de corte pulsátil (PSS, por ejemplo, 15 ± 5 dinas / cm 2) asociados con los sitios de la resistencia a la aterosclerosis en las arterias descendente de TNF-α regulan las respuestas inducidas. Por el contrario, baja magnitud esfuerzo cortante (LSS, por ejemplo, 2 dinas / cm 2) o de corte oscilatorio (OSS, por ejemplo, 0 ± 5 dinas / cm 2), características de los sitios susceptibles en vivo, exacerban citocinasne inducida por la inflamación. 13, 14 dispositivos de microfluidos Nuestros PDMS proporcionar una plataforma para la realización de estudios sobre el mecanismo para poner a prueba hipótesis relacionadas con la superposición de estrés metabólico con factores hidrodinámicos en la regulación de la función endotelial y de la patología. La utilidad y versatilidad del método está ampliamente ilustrado a través de los siguientes resultados representativos.
Figura 1. El esfuerzo cortante diferente THP-1 modula la adhesión celular a TNF-alfa monocapas endoteliales inflamadas. Estos datos fueron adquiridos utilizando el protocolo descrito anteriormente detallada y documentada en el video. Monocapas AHCE fueron expuestas simultáneamente a una dosis baja de la citoquina inflamatoria TNF-α (0,5 ng / ml, ~ 50 CE para la VCAM-1 sobre regulación) y, o bien HSS (15 dinas / cm 2) o OSS (0 ± 5 dinas / cm 2, 1 Hz) en un CSD personalizada durante 4 horas de la forma descritacama en el protocolo detallado. THP-1 detención celular se cuantificó bajo flujo cortante en una cámara de flujo de PDMS. Esta línea celular que imita el fenotipo de los monocitos humanos fue elegido por su reproducibilidad y facilidad de uso. HSS atenuada la respuesta inflamatoria en comparación con el software libre, lo que resulta en el arresto de disminución de células THP-1. Los datos fueron analizados mediante la t de Student-test y se representan como media ± SEM de 3 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de DeVerse et al. 5
Los siguientes datos demuestran la versatilidad de nuestro enfoque, usando ejemplos de nuestro trabajo publicado. Salidas desde el protocolo anterior se indican en su caso.
Figura 2. La modulación de citoquinas inducida por la expresión de VCAM-1 y el reclutamiento de monocitos en un gradiente de esfuerzo cortante. A) monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h bajo flow en un VMMC diseñado en base a la teoría de flujo de Hele-Shaw. 15 Una disminución lineal en magnitud SS a lo largo de la línea central del canal se logra mediante el diseño de las paredes laterales de la cámara para coincidir con las líneas de corriente de un flujo de estancamiento de dos dimensiones y la configuración del extremo del canal para que coincida con las líneas de iso-potenciales. La tensión de cizallamiento (τ w) generado a lo largo de la línea central de este canal a una distancia axial de la entrada (x) viene dada por:
donde μ es la viscosidad del medio, Q es el caudal volumétrico, h es la altura del canal, w 1 es la anchura del canal de entrada, y L es la longitud total del canal. Q fue elegido para generar un gradiente en magnitud SS de 16 dinas / cm 2 en la entrada a 0 en el punto de estancamiento ", un" justo proximal a la outlet. B)-C) VCAM-1 de expresión se midió in situ por microscopía de inmunofluorescencia utilizando anticuerpos conjugados con los puntos cuánticos y presentada como la intensidad de fluorescencia porcentaje mediana (MFI) de control de unstimulated estática. SS no modular el nivel basal de VCAM-1, que es baja en AHCE no estimulada (triángulos de color gris). Sin embargo, la expresión de VCAM-1 aumentó en relación con el TNF-α en magnitudes LSS, alcanzando un máximo de ~ 2 dinas / cm 2 y volver a la línea de base de TNF-α o por debajo de las magnitudes de corte> 5 dinas / cm 2 (cuadrados negros). D) Los monocitos (10 6 / ml) fueron perfundidos menos 2 dinas / cm 2 durante 5 min en los canales de flujo paralelo sobre monocapas acondicionan previamente como en A). Reclutamiento de monocitos al endotelio cuantitativamente correlacionada con la VCAM-1 de expresión, de una magnitud dada esfuerzo cortante. En particular, la capacidad para sondear la VCAM-1 de expresión y el reclutamiento de monocitos con buena resolución espacial en una monolayeR reveló cambios significativos en un rango estrecho en magnitud SS que no se apreciará por la aplicación de sólo unos pocos valores discretos de cizallamiento en experimentos separados. Los datos fueron analizados por ANOVA de medidas repetidas y las diferencias evaluadas por Newman-Keuls post-test, * P <0,05 TNF-α en condiciones estáticas. Los datos son la media ± SEM de 3-6 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Zou et al. 2
Figura 3. Lipoproteínas ricas en triglicéridos (TGRL) modulan la inflamación inducida por citoquinas en proporción a los niveles de triglicéridos en suero de donantes y la expresión de VCAM-1. Monocapas AHCE fueron estimuladas con TNF-α (0,3 ng / ml) durante 4 h simultáneamente con TGRL (10 mg / dl ApoB) aisladas de seres humanos después de una comida alta en grasas en la cultura estática. A) la expresión de VCAM-1 se midió por separado en suspensión CE, por citometría de flujoy adhesión de los monocitos cuantificaron utilizando un VMMC como se describe en el protocolo detallado. Los datos se presentan como% de cambio del TNF-α. Detención monocitos varió en proporción directa a endotelial VCAM-1 de expresión, que aumentó directamente con el nivel de triglicéridos en suero de donantes. B) Monocitos detención para un subconjunto de pro-inflamatorias donantes se derogó en la presencia de un VCAM-1 anticuerpo bloqueante. La significancia fue determinado por la t de Student pareado de la prueba, media ± SEM de 3-5 experimentos independientes. Adaptado con el permiso de Wang et al. 4
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Discussion
Se describe la utilización de dispositivos de microfluidos PDMS para la evaluación en el chip del fenotipo inflamatorio endotelial a través de la formación de imágenes en tiempo real de expresión CAM y adhesión de los monocitos. Una gran ventaja de nuestro enfoque reside en la capacidad de cuantificar los resultados asociados con la disfunción endotelial en las células expuestas a los mediadores inflamatorios como citocinas y lípidos de la dieta bajo condiciones hidrodinámicas definidos que reflejan la tensión de cizallamiento en los vasos aterogénicas. El VMMC facilitar el uso de pequeñas cantidades de reactivos o materiales que pueden ser en cantidades limitadas y tienen las ventajas añadidas de ser barato, personalizable y susceptibles de alto rendimiento.
El uso de dispositivos de microfluidos, representa una alternativa a los enfoques macro-escala que se han utilizado durante décadas para investigar la respuesta de la CE a los cultos de corte. Estos incluyen placas paralelas cámaras de flujo, tubos cilíndricos, y viscosímetros de cono y placa, cada uno de los cuales es caces de la imposición de condiciones estables, laminar flujo de Poiseuille (revisado en 16). Las modificaciones de estos dispositivos puede producir variaciones temporales o espaciales de la tensión cortante en la pared o incluso una recapitulación de onda arterial. 6 Sin embargo, en general, estos dispositivos requieren una gran cantidad de medios de comunicación, son caros de fabricar, menos adaptables, y sufren de rendimiento comparativamente bajo.
También existen limitaciones con el uso de los VMMCs. Estos dispositivos están diseñados sobre la base de la teoría del flujo de placas paralelas, lo que supone anchura infinita. Esta es una suposición razonable para los dispositivos de macroescala donde el ancho es mucho mayor que la altura. Sin embargo, la anchura finita de los canales de microfluidos requiere que los estudios se realizaron a lo largo del centro del eje longitudinal del canal para eliminar los efectos de pared lateral, como el real τ w variará con w en función de la relación de aspecto de canal. 1, 7 De manera similar , las medidas no se toman cerca de to la entrada y salida de los canales para evitar los efectos de la entrada. Hemos descartado cualquier importantes efectos paracrinos de señalización o la inflamación inducida por lesión o daño a CE causada por sellar el dispositivo a la monocapa de contribuir a nuestras respuestas observadas. PDMS tiene una alta afinidad para las moléculas hidrófobas, lo que podría conducir a la absorción de quimiocinas secretadas y las interacciones no específicas entre los leucocitos y la VMMC. Sin embargo, no hemos encontrado que esto es un problema para la duración de nuestros estudios. 2
El uso de dispositivos de flujo con cultivos de células constituye un enfoque reduccionista que facilite estudios sobre el mecanismo y la demostración de causa y efecto con respecto al esfuerzo cortante. Sin embargo, una limitación de cualquier enfoque in vitro es el supuesto de que adecuadamente recapitular la complejidad del medio ambiente en las arterias nativas. In vivo, las células endoteliales están crónicamente adaptado a los patrones de flujo y complejosestán sujetos a las interacciones con otras células, la matriz, y los mediadores humorales que regulan su comportamiento.
Es de notar que todos los resultados presentados anteriormente son en modelos a corto plazo y como tal no puede ser invariantes en el tiempo. Sin embargo, son representativas de los experimentos que comúnmente llevan a cabo para investigar los mecanismos en virtud de un desafío inflamatorio agudo. Una estrategia relevante para nuestros estudios es examinar la evolución de una línea de base inflamatoria de dosis bajas de TNF-α estimulación, por lo que 4 horas representa el pico aproximado en la expresión de VCAM-1. Hemos documentado en varios estudios que los cambios en la expresión superficial de VCAM-1 se correlacionan con el reclutamiento de monocitos mejorada bajo estas condiciones. 2-4, 17
Además, la elección de SS forma de onda puede evocar respuestas diferenciales endoteliales. En nuestro protocolo de representante que documentar el uso de la VMMC para cuantificar eventos de adhesión en monocitos AHCE acondicionado en soye tensiones elegidos como muestra representativa de los lugares de relativa resistencia (HSS) y la susceptibilidad (OSS) a la aterogénesis en las arterias en un dispositivo de cizalla personalizado. De acuerdo con los hallazgos previos en los cultivos de la CE, HSS atenuadas en la respuesta a la activación de citoquinas en relación con el OSS. 12, 13 Los resultados son consistentes con una mayor permisividad a la activación inflamatoria de la CE en los sitios de la perturbación del flujo en vivo. Mientras que estas condiciones se utilizan comúnmente para representar el flujo no perturbado y alterado, respectivamente, no completamente recapitular la complejidad de flujo en las arterias. Sin embargo, una gran cantidad de literatura apoya su uso como aproximaciones simples que reproducen adecuadamente las características de flujo más destacados. 14
En particular, nuestro cono y placa basada en la CDS es capaz de generar formas de onda más compleja y las células acondicionado durante períodos más largos, como se informó anteriormente. 6 De este modo, la vinculación de la VMMC con el CSD se describe en el protocol imparte un grado máximo de flexibilidad. Un examen de este enfoque radica en la orientación de la VMMC con respecto a la dirección de acondicionamiento de cizallamiento en la CDS, en el que el flujo AHCE experiencia en la dirección circunferencial. En la práctica, la VMMC está orientado de modo que los canales son paralelas con el campo de flujo de entrada y la corriente arriba de las células acondicionado medida de lo posible. Los canales son lo suficientemente pequeños que esto representa una aproximación razonable. Sin embargo, también se demuestra en un estudio anterior que los monocitos que fluyen paralelas o perpendiculares a la dirección de acondicionamiento de cizallamiento en la VMMC no afectó a los resultados mostrados en la Figura 2. 2
Consideraciones adicionales asociados con las técnicas in vitro incluyen la variabilidad inducida por la deriva fenotípica asociada con pases de serie de la CE en la cultura y la heterogeneidad en la aislada CE o monocitos. AHCE normalmente debe ser utilizado por el paso 6 y el lote de cadacaracterizado por una respuesta inflamatoria consistente a TNF-α. El uso de una línea de células tales como THP-1 puede reducir la variabilidad asociada con el uso de los monocitos, los cuales varían en actividad por donante y se activa fácilmente por su aislamiento. A fin de garantizar lecturas funcionales reproducibles y precisa, la preparación de células y los tiempos de transferencia debe ser minimizado. La cuidadosa selección de los controles es necesario interpretar de manera significativa los resultados. Dependiendo del experimento, éstas podrían incluir las células no tratadas o estática cultivadas-, el tratamiento de TNF-α y no activados células THP-1, el uso de anticuerpos bloqueantes, siRNAs o inhibidores farmacológicos y otros.
Como prueba de la versatilidad del enfoque, hemos aplicado estos dispositivos para investigar las citoquinas, 2 de lípidos-3, 4 y RAGE-5 inducida por la inflamación en AHCE. Nuestros estudios han incluido la medición del potencial inflamatorio de las partículas de lípidos en suero derivados del s humanaubjects sobre las células endoteliales 3, 4 y monocitos. 17 En una estrategia alternativa, los monocitos se pueden presentar con sustratos derivatizados con moléculas inmovilizadas tales como VCAM-1 para examinar los mecanismos de adhesión. Con este enfoque, que ya se ha demostrado un papel funcional de la molécula de adhesión CD11c, que coopera con el antígeno muy tardío (VLA) -4 en la adhesión de los monocitos a la VCAM-1 durante la dislipidemia en los seres humanos y los ratones 17. 18 Dado que los monocitos pueden ser fácilmente activadas por su aislamiento, también desarrollado un ensayo de sangre entera para su uso con nuestro laboratorio-chip de dispositivo para permitir la detección más sensible y reproducible. 17
En última instancia, además de proporcionar visión de los primeros eventos inflamatorios que subyacen a la aterosclerosis, prevemos que este desarrollo de la tecnología dará lugar a fieles enfoques ex vivo para evaluar el riesgo de un individuo de la inflamación mediada por enfermedades cardiovasculares, la pavimentación de la way para el desarrollo de diagnósticos personalizados que informan sobre la activación de los monocitos y la CE.
| Cono-Placa de la célula y dispositivo de cizallamiento | ||
| Cono Radio | 0,06985 | m |
| Cono de ángulo | 0.00877 (0,5 °) | rad (grados) |
| Brecha de Altura | 20 ± 10 | m |
| Max Angular Velocity (para los experimentos se describe aquí) | 18,85 | rad / s |
| Viscosidad Cinemática | 0,00077 | m 2 / s |
| Max R número (para los experimentos se describe aquí) | 0.000758 | adimensional |
| Especificaciones VMMC | ||
| Canal Largo | 8.0 | mm |
| Canal Altura | 60 | m |
| Ancho de canal | 2 | mm |
| Número de Reynolds | 1,67 | adimensional |
Tabla 1. Especificaciones CSD y VMMC.
Figura 4. Vista transversal del dispositivo de cono y placa de cizalla (CDS). La CDS consiste en un cono de acero inoxidable cilíndrico que gira sobre un sustrato de cultivo celular estacionaria. El ángulo de cono hueco y la altura son parámetros críticos que definen la naturaleza del campo de cizallamiento producido en presencia de medio de cultivo. Un número de Reynolds modificado que muestra la relación de centrífuga a las fuerzas viscosas está dada por:
<br />
donde r es el radio del cono, ω es la velocidad angular, α es el ángulo de cono, y ν es la velocidad cinemática del fluido. Cuando R es << 1 fuerzas centrífugas son bajos, el flujo es laminar y azimutal puramente, y el esfuerzo cortante inducido es constante a lo largo de la monocapa. 19 En nuestra CDS, el sustrato con células cultivadas se carga desde la parte inferior en la cámara que alberga el cono. El medio se añade a la cámara y se utiliza como fluido de corte. El cono está montado con cojinetes de precisión pre-cargados y la rotación accionado por un motor de micro-paso a paso. Un sistema de nivelación de precisión mantiene una alineación perpendicular al sustrato celular. La altura brecha (definida por la distancia desde el vértice del cono al sustrato celular) se establece con un medidor de profundidad de alta precisión. Una grasa de la captura y los medios de comunicación el sello están en su lugar para asegurarse de que la carcasa de una cámara que las células se mantengan limpios y libres de aceite y escombros.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el NIH / NHLBI subvención R01 HL082689 a Scott I. Simon y Anthony G. Passerini.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
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