Summary
Fotolitografi tarafından kazınmış ve PDMS imal Mikroakışkan akışı odaları EC disfonksiyonu ve inflamasyon ile ilişkili fonksiyonel sonuçlarını araştırmak için uygulanır. Temsili bir deneyde, diferansiyel kayma gerilmesi yeteneği sitokin aktive AK monolayers için monositik hücre adezyon modüle gösterilmiştir.
Abstract
Aterogenezin endotelyal disfonksiyona yol açan sistemik enflamasyon artan devlet katkıda metabolik anormallikleri tarafından daha da güçlendirilmektedir. Ancak, risk bireyin düzeyi anlatıyor endotel erken fonksiyonel değişiklikler doğrudan kılavuzu tedavi stratejisi yardım klinik değerlendirilmemektedir. Diğer taraftan, yerel hemodinami ile inflamasyon düzenleme, ateroskleroz, tesadüfi olmayan bir uzaysal dağılımının katkıda bulunur, ama mekanizmalar, in vivo tarif etmek zordur. Biz hassas akış şartlarında insan endotel hücreleri (EC) ve monositler inflamatuar olayların kantitatif tayini metabolik pertürbasyon için bir laboratuvar-on-a-chip bazlı yaklaşım açıklanmaktadır. Yumuşak litografi standart yöntemlerle kültive EC mono tabakalara direkt olarak bağlı olan damar taklit eden microfluidic odaları (VMMC), microfabricate etmek için kullanılır. 1. Bu cihazlar, reaktiflerin küçük miktarlar ise kullanma avantajına sahiptiriyi tanımlanmış bir kesme alanına maruz AK membran inflamatuar olayların doğrudan görüntüleme için bir platform sağlar. Biz başarıyla insan aort EC (HAEC) sitokin-2 lipid-3, 4 ve RAGE indüklenen 5 inflamasyon araştırmak için bu cihazlar uyguladık. Burada tahlil monositik hücre (THP-1) haddeleme ve diferansiyel kayma özellikleri altında klimalıdır ve inflamatuar sitokin TNF-α tarafından aktive edilir HAEC mono tabakaları üzerinde durmasına VMMC kullanımı belgelemek. Bu gibi çalışmalar metabolik risk faktörleri altında atherosusceptibility içine mekanistik anlayış sağlıyor.
Protocol
1. Hücre Kültürü ve Yüzey Hazırlama
- Bir torna kullanarak 100 x 20 mm doku kültür kaplarına (BD Falcon) 3-inç dairesel yüzeylerde kesin. % 70 etanol içinde boğulma yolu ile yüzeyler sterilize edin. Oda sıcaklığında 1 saat için 4 ml tip I kollajen (100 ug / ml) içeren bir Petri kabı ve kat yeri, daha sonra 4 ml 1 x PBS ile yıkayın.
- Doğrudan malzeme 1 ml uygulayarak 6.5x10 5 hücre / ml ve tohum İnsan aort endotel hücreleri (HAEC, pasaj 4-6) Askıya. 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde yer ve hücreler 1 saat için alt-tabaka için uygun izin verir.
- Hücrelere 1x antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş Medium Endotel Büyüme-2 (EGM-2) 9 ml ilave edilir. Hücrelerin% 90 confluency ulaşıncaya kadar her 2 günde bir ortam değiştirin.
- % 10 FBS ve 1 x antibiyotik-antimikotik çözüm ile desteklenmiş RPMI 1640 ortamı içinde THP-1 hücreleri, koruyun. Onlar 1 bir yoğunluk ulaşmak Passage hücreleri0 6 hücre / ml.
2. Hücre Kesme Protokolü
Hücreler özel bir koni ve plaka Hücre Kesme Cihazı (CSD) olarak koşuluna bağlıdır. Aygıt bilgilerini ve tasarım özellikleri Tablo 1 ve Şekil 4'te belgelenmiştir.
- CSD hazırlayın. Etanol ile bölmeli gövde sterilize ve steril PBS ile yıkayın. ° C seviyesinde koni hücre mono tabakasında dik olmasını sağlamak için 37 ila konut ısıtın. Mahfazanın alt gelen hücreleri ile alt tabaka birleştirin ve istenen yüksekliğe koni ayarlayın.
- Leibovitz-15 (L-15) CO 2 yokluğunda pH değerini korumak için kesme aracı olarak Endotelyal BulletKit ile takviye ortamı kullanın. , Enflamasyon teşvik kesme araç, tümör nekroz faktörü-α (TNF-α, 0.5 ng / ml) eklenir ve bir giriş portuna bağlanmış bir şırınga aracılığıyla aygıt içinde 6 ml enjekte edilir, hava getirmek için dikkat etmek içinodacığın içinde kabarcıklar.
- Yüksek bir büyüklük sabit kesme gerilmesi de makaslama hücreleri (HSS 15 dyne / cm 2) 4 saat için ya da bir salınan makaslama gerilmesi (OSS, 0 ± 5 din / cm 2, 1 Hz). İstenen SS tam daha önce açıklandığı gibi bir mikro-adımlama motoru ile kontrol edilen hücreler, yukarıda koni dönen elde edilir 6 yüzeyi duvar SS (τ w) ile tahmin edilir.:
μ ortamın viskozitesi olduğu durumlarda, ω koni açısal hız, ve α koni açısı (0.5 °) 'dir. Alt tabaka ile koni hizalama 0.05 hassas tesviye ve 20 ° olarak belirlenmiştir aralık yüksekliği ± 10 um τ w çember boyunca ve radyal varyasyonu en aza indirmek için bir derinlik ölçer kullanarak içinde ayarlanır. Cihaz laminer akış özelliklerini sağlamak için onaylanmıştır. C Kaldırcihazdan arşın ve monosit yapışma analizi için hazırlar.
3. PDMS mikroakışkan Odası Fabrikasyon
- Uygulamaya bağlı olarak istenilen mikroakışkan kanal numarası ve kanal yüksekliği için master kalıp elde edilir. Bu protokolde kullanılan özel tasarım özellikleri 5000 dpi 1 Kısaca kanalları ağı (Autodesk Inventor) CAD yazılımları kullanılarak dizayn edilmiştir. Şu oluşturmak için yöntem zaten literatürde iyi belgelenmiştir. Tablo 1'de ayrıntılı ve yazdırılır Bir şeffaflık. Negatif fotorezist (SU8) 100 mikron kalınlığında bir silikon yonga üzerine bükülmüş olan. Şeffaflık bindirilmiş ve UV ışınlarına maruz kalmaktadır. Sigara polimerize fotorezist olumlu çoğaltma ana oluşturmak için kaldırılır.
- Silikon bir tartın tekne ağırlık ajan 10:01 kür ile PDMS çözüm karışımı silikon bir üs yapmak ve 5 ml serolojik pipet yardımıyla karıştırın. Duvarlara kazımak için dikkatli olunçözüm için plastik pul eklemekten kaçının tekne tartın.
- Bir 100x15mm Petri kabındaki ana gofret yerleştirin ve yemeğin içine PDMS çözüm dökün.
- Çanak Kapak ve kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika süreyle vakum kabı içine yerleştirin. 15 dakika Petri kabı çıkarın ve hafifçe yüzey üzerinde hava üfleme herhangi bir aşırı kabarcıkları sonra.
- 70 de 1 saat için bir fırın içinde Petri kabı yerleştirin ° C. Çanak çıkarın ve keskin bir bıçak kullanarak mikroakışkan odaları kesip.
4. Mikroskop Aygıt Meclisi
- Inverted mikroskop ışık kaynağı açın ve 37 ısıtıcı set ° C 10 ml'lik şırınga hortumu takın ve hiçbir kabarcıklar vardır böyle distile su ile doldurun. 1 dyne / cm 2 lik bir duvar SS indüklemek için şırınga pompa ve ayar akış hızı şırınga yerleştirin. Kanalın merkez boyunca üretilen duvar kesme gerilmesi (τ w) standart yöntemi kullanılarak tahmin edilirBir paralel plakalı akış odası için denklem:
μ hacimsel akış oranı, Q orta, viskozite olduğu, h kanal yüksekliğini ve w kanal genişliği Not:. kanal genişliği sınırlı olmasından dolayı, asıl τ w w kanala bağlı olarak değişecektir boy oranı ve ölçüm yan duvarların en yakın% 25 olarak önlenir. 1.7 - Su PDMS odasına yerleştirin ve bireysel kanallardan havayı çıkarmak için 100μl mikropipet kullanın. Kamara off valve ayarlanmış olduğundan emin hale getirmek için vakum adaptörü takın.
- Objektiv HAEC monolayer ile Petri kabı yerleştirin. Petri kabı üzerinde PDMS odasına yerleştirin ve hiçbir hava kabarcığı cihaz ve tek tabaka arasında oluşması temin ederken dikkatli HAEC monolayer üzerinde ayarlayın. Vakum üzerinde ve oda sıkıca bağlı olduğu, böylece valf döndürün. 19 gauge iğne metal sol sadece 5 mm olduğu bu tür blunt kesin. Tamponu ile plastik haznesini doldurun ve PDMS odasının girişine koymak. Kullanılacak uygun sayıda kanal için tekrarlayın. Şırınga pompaları PDMS kanalı çıkar tüp takın.
5. Kesme Gerilmesi altında Monosit Yapışma Testi
- 2x10-6 hücre / HBSS + Ca2 + / Mg + 2 +% 0.1 ml HSA içinde THP-1 hücreleri, askıya alma. Oda sıcaklığında 15 dakika için stromal türetilmiş factor-1 (SDF-1, 50 mg / ml) ile kuluçkaya alarak etkinleştirme THP-1 hücreleri.
- Akış kurmak için şırınga pompası açın, sonra hava kabarcıkları tanıtan olmadan rezervuar hücre süspansiyonu 50 ul ekleyin. Bir kez akışı tamamen geliştirilirse, veri toplama başlar.
- Çözüm düşük alırsa rezervuara tampon ekleyerek, uygun akış hızında 5 dakika çalıştırın. Akış bilgisi bağlanmamış hücreleri yıkayın kanal içine tampon akan devam edin.
6. Veri Toplama ve Analizi
- Yan yakın hemen girişinde sonra veya çıkış portları önce veya% 25 kaydetmek özen, kanal 3 noktada kanalın uzunlamasına ekseni boyunca tam gelişmiş akış takiben 2 dakika süreyle 3 kare / s sayısal görüntü dizilerinin Edinme duvarlar.
- Monolayer aynı odak düzlemi kendi faz-parlak görünüm tanımlayarak alan başına tutuklanan hücrelerin sayısını sayın.
- Sabit hücre durması hareketi ile tanımlanır <10 sn içinde yarım hücre çapı. 3 rasgele alanları / kanal ve üzeri ortalama veri ImageJ yazılımı kullanarak ölçmek.
7. Temsilcisi Sonuçlar
Damar endoteli tekdüze sistemik inflamasyona katkıda agonistleri maruz olmasına rağmen, ateroskleroz endotel fonksiyonu mekansal heterojenlik karıştığı, arter akımlarında rahatsızlık sitelerinde tercihen gelişen fokal bir hastalıktır. 8 9, 10 TNF-α hücre adezyon moleküllerinin up-regülasyonu (CAM'lar içerir EC iyi karakterize yanıtı indükler edilir ; örneğin VCAM-1, ICAM-1, E-selektin) ve dolaşım, erken aterosklerotik lezyon damgasını gelen işe monositler 11 Hemodinami endotel enflamatuar fenotipe önemli bir düzenleyicisi olduğu 12 Yüksek büyüklüğünü kayma gerilmesi kemokinlerin (HSS..; örneğin 15 dynes / cm 2) veya pulsatil kayma gerilmesi (PSS; örneğin 15 ± 5 dynes / cm 2) arterlerde TNF-α ile indüklenen yanıtları düşürmesine ateroskleroz direnç siteleri ile ilgili. Tersine, düşük büyüklüğünü kayma gerilmesi (LSS; örneğin 2 dynes / cm 2) ya da salınımlı kesme; in vivo duyarlı sitelerin karakteristik (ÖSS örn. 0 ± 5 dynes / cm 2), cytoki alevlendirebilirne bağlı inflamasyon. 13, 14 Bizim mikroakışkan PDMS cihazlar endotel fonksiyonu ve patoloji düzenlenmesinde hidrodinamik faktörleri ile metabolik stres süperpozisyon ile ilgili hipotezleri test etmek için mekanik çalışmalar yürütmek için bir platform sağlar. Yaklaşımın yarar ve çok yönlülük geniş Aşağıdaki temsili sonuçları ile gösterilmiştir.
Şekil 1. Kayma gerilmesi ayirt TNF-α iltihaplı endotel monolayers için THP-1 hücre adezyonu modüle. Bu veriler yukarıda ve video belgelenen açıklanan ayrıntılı protokolü kullanılarak elde edildi. HAEC monolayers eşzamanlı inflamatuvar sitokin TNF-α (0.5 ng / ml, VCAM-1 up-regülasyonu için ~ AK 50) ve HSS (15 dynes / cm 2) veya ÖSS (0 ± 5 dynes ya düşük dozda maruz bırakıldı anlatıldığı şekilde 4 saat boyunca özel bir CSD içinde / cm 2, 1 Hz)ayrıntılı bir protokol yatak. THP-1 hücre tutuklanması PDMS akışı odasında kayma akışı altında ölçüldü. Insan monosit fenotip taklit Bu hücre hattı kendi tekrarlanabilirlik ve kullanım kolaylığı için seçildi. HSS zayıflatılmış inflamatuvar yanıt azalmıştır THP-1 hücre tutuklanmasıyla sonuçlanan, ÖSS ile karşılaştırıldığında. Veriler Student t-testi ile analiz edildi ve ortalama ± 3 bağımsız deneyler SEM olarak temsil edilmektedir. DeVerse ark izniyle uyarlanmıştır. 5
Aşağıdaki bilgiler yayınlanmış çalışmalarından örnekler kullanarak bizim yaklaşımın yönlülüğü göstermektedir. Eğer varsa, yukarıdaki protokol sapmalar gösterilir.
Şekil 2. Sitokin indüklenen VCAM-1 ekspresyonu ve kayma gerilmesi degrade monosit alımı Modülasyonu. A) HAEC mono tabakalar flo altında 4 saat süre ile, TNF-α (0.3 ng / ml) ile uyarıldıHele-Shaw akış teorisine göre tasarlanmış bir VMMC içinde w. 15 kanalın merkez boyunca SS büyüklük olarak doğrusal bir azalma iki boyutlu bir durgunluk akışının düzene denk odasının yan duvarları tasarımı ve son şekillendirilmesi ile sağlanmıştır Kanalın iso-olası hatları eşleştirmek için. Giriş (x) bir eksenel mesafede bu kanalın merkez hattı boyunca üretilen duvar kesme gerilmesi (τ w) aşağıdaki gibi verilir:
μ hacimsel akış oranı, Q orta, viskozite olduğu, h kanal yüksekliğini, w 1 kanal giriş genişliği, ve L toplam kanal uzunluğu. Q 16 dan SS büyüklükte bir gradyan oluşturmak için seçildi outle için dynes / durgunluk noktada 0 girişinde cm 2 "" sadece proksimalt. B)-C) VCAM-1 ekspresyonu kuantum noktaları için konjuge ve uyarılmamış statik kontrol yüzdesi ortalama floresan yoğunluğu (MFI) olarak sunuldu antikor kullanarak immünofloresan mikroskopi ile in situ ölçüldü. SS uyarılmamış HAEC (gri üçgenler) de düşük VCAM-1 bazal seviyesi, modüle değildi. Ancak, VCAM-1 ekspresyonu) ~ 2 dynes / cm 2 peaking ve kayma büyüklükleri> 5 dynes / cm 2 (siyah kareler). D TNF-α bazal dönen veya aşağıda, LSS büyüklükleri de TNF-α göreli artış Monositler (10 6 / ml) A) 'da olduğu gibi koşullanan mono tabakalar üzerinde paralel akış kanalları içinde 5 dakika için 2 dynes / cm 2 perfüze edildi. Endotele Monosit işe kantitatif verilen kayma gerilmesi genlikte VCAM-1 ekspresyonu ile ilişkilidir. Özellikle, bir monolaye ince uzaysal çözünürlüğü olan VCAM-1 ekspresyonu ve monosit işe soruşturma yeteneğir ayrı deneylerde kayma sadece bir kaç ayrık değerler uygulayarak takdir etmem SS büyüklükte dar bir aralık üzerinde önemli değişiklikler saptandı. Veri TNF-α dan * p <0.05 statik koşullarda, tekrarlanan ölçümler ANOVA ve Newman-Keuls sontest ile değerlendirilen farklılıklar analiz edildi. Veriler, ortalama ± SEM edilir 3-6 bağımsız deneyler. Tsou ark. 2 izniyle uyarlanmıştır
Şekil 3,. Trigliserid-zengin lipoproteinler (TGRL) donör serum trigliserid düzeyleri ve VCAM-1 ekspresyonu ile orantılı olarak sitokin indüklenen inflamasyonu modüle. HAEC monolayers TGRL (10 mg / dl ile eşzamanlı olarak 4 saat süreyle TNF-α (0.3 ng / ml) ile uyarıldı ApoB) Statik kültürde yüksek yağlı bir yemekten sonra insan denekler izole. A) VCAM-1 ekspresyonu akım sitometri ile askıya AK ayrı ölçüldüve monosit yapışma ayrıntılı protokolde tarif edildiği gibi bir VMMC kullanılarak belirlenebilir. Veriler, TNF-α% değişim olarak gösterilmektedir. Monosit tutuklama donör serum trigliserit düzeyi ile doğrudan artmıştır. B) pro-inflamatuar donörler bir altkümesi için Monosit tutuklanması VCAM-1 engelleme antikor varlığında yürürlükten kaldırılmıştır endotel VCAM-1 ekspresyonu, doğru orantılı olarak değişmektedir. Anlamlılık eşleştirilmiş Student t-testi ile belirlendi, 3-5 bağımsız deneyler ± SEM demektir. Wang ve ark izniyle uyarlanmıştır. 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Biz CAM ifade ve monosit adezyon gerçek zamanlı görüntüleme yoluyla endotelyal inflamatuvar fenotip on-chip değerlendirme için mikroakışkan PDMS cihazların kullanımını açıklar. Bizim yaklaşımın önemli bir avantajı gibi aterojenik damarlarda makaslama stresi ayna tanımlanan hidrodinamik koşullar altında diyet lipid ve sitokinler gibi inflamatuvar mediatörlerin maruz hücrelerde endotel disfonksiyonu ile ilişkili sonuçları sayısal yeteneği yatıyor. VMMC reaktifler veya sınırlı kaynağı olabilir malzemelerin küçük miktarlarda kullanımını kolaylaştırmak ve ucuz, özelleştirilebilir ve yüksek verimlilik için mükellef olmak ekledi avantajları var.
Mikroakışkan cihazların kullanımı kesme kültürlü AK cevabı araştırmak için yıllardır kullanılmaktadır makro ölçekli yaklaşımlara bir alternatif temsil eder. Bunlar, Ca, her biri paralel-plaka akış odası, silindirik tüpler, ve koni ve plakalı viskometre içerirsabit, laminer Poiseuille akış şartlarında (16 yorum) empoze palpe edilebilir. Bu cihazlar üzerinde değişiklik duvar kayma gerilmesi temporal ya da mekansal varyasyon üretmek hatta arteriyel dalga recapitulate. 6 Ancak, genel olarak bu cihazlar medya büyük miktarda gerektiren, daha az uyarlanabilir imal etmek pahalı ve nispeten düşük akış muzdarip olabilir.
Sınırlamalar, aynı zamanda VMMCs kullanımı ile mevcuttur. Bu cihazlar sonsuz genişliği varsayar paralel plakalı akış teorisi, esas olarak tasarlanmıştır. Bu genişliği yüksekliği daha fazladır makro ölçekli cihazlar için makul bir varsayımdır. Bununla birlikte, mikroakışkan kanal genişliği sınırlı gerçek τ w w kanal oranına bağlı olarak değişecektir gibi çalışmalar, yan duvar etkileri ortadan kaldırmak için, kanalın uzunlamasına ekseni boyunca yapılan orta zorunlu kılmaktadır. 1, 7 Benzer şekilde , ölçümler yakın t alınmazGiriş etkileri önlemek için kanal giriş ve çıkış o. Biz yaralanma veya gözlenen tepkiler katkı olarak tek tabaka için cihaz mühürleme nedeniyle AK hasara yol açtığı herhangi bir önemli parakrin sinyal etkisi veya inflamasyon dışladı var. PDMS salgılanan kemokinler ve lökositler ve VMMC arasındaki spesifik olmayan etkileşimleri emme yol açabilecek hidrofobik molekül için yüksek afiniteye sahiptir. Ancak, biz bu bizim çalışmaların süresi için bir sorun olmaya bulamadık. 2
Kültür hücreleri ile akış cihazların kullanımı kayma gerilmesi ile ilgili mekanik çalışmalar ve neden ve etkisi gösteri kolaylaştıran bir indirgemeci bir yaklaşım oluşturmaktadır. Ancak, in vitro yaklaşımlarda herhangi bir sınırlama yeterince yerli arterlerde ortamının karmaşıklığı özetlemek olacağı varsayımıdır. İn vivo olarak, endotel hücreleri kronik karmaşık akış şekilleri adapte edilirdiğer hücreler, matris ve davranışlarını düzenleyen hümoral mediatörler ile etkileşimleri tabidir.
Yukarıda sunulan sonuçlar, her kısa süreli bir model ve bu gibi olduğu dikkat çekicidir, değişmez zaman olmayabilir. Ancak, onlar da genellikle akut inflamatuar bir meydan okuma mekanizması altında araştırmak gerçekleştirmek deneyler temsilcisi vardır. Çalışmalarımızda için ilgili strateji 4 saat VCAM-1 ekspresyonu yaklaşık tepe temsil eden düşük doz TNF-α stimülasyon, iltihabi bir başlangıca değişiklikleri izlemektir. Bu VCAM-1 ifadesini yüzey değişiklikleri bu şartlar altında geliştirilmiş bir monosit alımı ile ilişkili olduğunu çeşitli çalışmalarda ortaya çıkarmıştır. 2-4, 17,
Ayrıca, SS dalga seçimi diferansiyel endotel tepkiler uyandırabilir. Bizim temsilcisi protokol biz ler altında şartına HAEC monosit adezyon olayları ölçmek VMMC kullanımı belgelemekrelatif direnç (HSS) ve özelleştirilmiş bir hücre kesme cihaz arterlerde ateroskleroz yatkınlık (OSS) sitelerin temsilcisi olarak seçilmiştir gerilmeler duydum. Kültürlü EC önceki bulguları, HSS zayıflatılmış ÖSS göreli sitokin aktivasyonu için tepki ile tutarlı. 12, 13 sonuçları in vivo akım bozulma bölgelerinde AT inflamatuar aktivasyonu için büyük bir serbestlik ile tutarlıdır. Bu koşullar genellikle sırasıyla bozulmamış ve bozulmuş akışını temsil etmek için kullanılır, onlar tamamen arter akımlarında karmaşıklığı recapitulate yok. Ancak, bir edebiyat zenginliği yeterince belirgin akış özellikleri yeniden basit yaklaşımlar olarak kullanımını desteklemektedir. 14.
Özellikle, bizim koni ve plaka bazlı CSD önce bildirildiği gibi uzun süreler için daha karmaşık dalga şekilleri ve klima hücre üretme yeteneğine sahiptir. Böylece 6, tarif pr CSD ile VMMC eşleştirmeotocol maksimum esneklik derecesi verir. Bu yaklaşımın bir göz CSD makaslama havalandırma yönüne göre VMMC yönünü de yer alır, çevresel yönde olan HAEC tecrübe akış. Bu kanallar şimdiye kadar mümkün olduğu kadar akış yukarı şartlı hücrelerinin akış alan ve giriş ile paralel olacak şekilde uygulamada, VMMC yöneliktir. Kanallar bu makul bir yaklaşım temsil ettiği kadar küçük. Bununla birlikte, aynı zamanda VMMC makaslama havalandırma yönüne dik veya paralel olarak akan monositler Şekil 2 'de gösterilen sonuçlar etkisi olmadığı bir önceki çalışmada gösterilmiştir. 2
In vitro teknikleri ile ilişkili Ek hususlar seri izole EC veya monositlerde kültür ve heterojenite AT pasajı ile ilişkili fenotipik sürüklenme tarafından indüklenen değişkenliği vardır. HAEC tipik olarak geçit 6 ve her parti bir tarafından kullanılması gerekirTNF-α ile tutarlı bir inflamatuar yanıt için karakterize edilmektedir. Bu tür THP-1 gibi hücre hattının kullanılması verici tarafından etkinlik değişir ve kolay bir şekilde izolasyon ile aktive monositler, kullanımı ile ilişkili değişkenlik azaltabilir. Tekrarlanabilir ve doğru işlevsel okuma, hücre hazırlama ve transfer sürelerini minimize edilmelidir sağlamak için. Kontrollerin dikkatli seçimi anlamlı sonuçlar yorumlamak için gereklidir. Deney bağlı olarak, bu tedavi edilmemiş ya da statik kültürlü hücreler, TNF-α tedavi Aktif Edilmemiş THP-1 hücreleri, bloke edici antikorlar, siRNA'lar veya farmakolojik inhibitörlerinin kullanımı, ve diğerleri içerebilir.
Yaklaşımın çok yönlülük vasiyeti olarak, HAEC sitokin-2 lipid-3, 4 ve RAGE indüklenen 5 inflamasyon araştırmak için bu cihazlar uyguladık. Tüm çalışmalar insan serum sn 'den türetilmiş lipid parçacıklarının enflamatuar potansiyelinin ölçümü ekledikendotel hücreleri 3, 4 ve monositler üzerinde ubjects. 17 alternatif bir strateji olarak, monositler yapışma mekanizması incelemek için VCAM-1 gibi hareketsiz molekülleri ile türevlendirilmiş substratlar ile sunulabilir. Bu yaklaşımı kullanarak, daha önce insanlar 17 ve farelerde dislipidemi sırasında VCAM-1 monosit adezyon -4 çok geç antijen (VLA) ile işbirliği adezyon molekülü CD11c için işlevsel bir rolü göstermiştir. 18. monositler tarafından kolaylıkla aktive edilebilir yana onların izolasyon, biz de daha hassas ve tekrarlanabilir tespiti için izin vermek bizim laboratuvar-çip cihazla birlikte kullanım için tam kan testi geliştirdi. 17.
Sonuçta, ateroskleroz altında yatan erken enflamatuvar durumların fikir sağlamanın yanı sıra, bu w serme, bu teknoloji gelişmesi-aracılıklı iltihaplanma, kardiyovasküler hastalık, bir bireyin riskini değerlendirmek için güvenilir ex vivo yaklaşımlar yol açacağı tasavvurmonosit ve EC aktivasyon rapor kişiselleştirilmiş teşhis gelişmesi için ay.
| Koni-ve-Levha Hücre Kesme Cihazı | ||
| Koni Yarıçap | 0.06985 | m |
| Koni Açısı | 0,00877 (0.5 °) | rad (derece) |
| Gap Yükseklik | 20 ± 10 | um |
| Maksimum Açısal Hız (deneyler için burada özetlenen) | 18.85 | rad / s |
| Kinematik Viskozite | 0.00077 | m 2 / s |
| Max R numarası (deneyler için burada özetlenen) | 0.000758 | boyutsuz |
| VMMC Özellikler | ||
| Kanal Uzunluğu | 8 | mm |
| Kanal Yüksekliği | 60 | um |
| Kanal Genişliği | 2 | mm |
| Reynolds sayısı | 1.67 | boyutsuz |
Tablo 1. CSD ve VMMC Özellikler.
Şekil 4. Koni ve plaka hücre kesme cihazı (MDA) enine kesit görünüşüdür. CSD, sabit bir hücre kültür substrat üzerinde döner bir paslanmaz çelik silindir koni oluşur. Koni açısı ve aralık yüksekliği kültür vasatı varlığında üretilen kesme alanının yapısını tanımlayacak kritik parametrelerdir. Viskoz santrifüj kuvvetleri ile ilişkisini gösteren modifiye edilmiş bir Reynolds sayısı ile ifade edilir:
<br />
r yarıçapı koni olduğu, ω açısal hız olup, α koni açısı olup, ν sıvı kinematik hızıdır. R << 1 merkezkaç kuvvetleri düşük olduğunda, akış laminer ve tamamen azimutal ve bağlı kayma gerilmesi monolayer boyunca sabittir. Bizim CSD yılında 19, kültür hücreleri ile yüzey evler odasına alttan yüklenir koni. Orta bölme eklendi ve kesme sıvı olarak kullanılmaktadır. Koni önceden yüklenmiş hassas rulmanlar ve bir mikro-step motor ile tahrik rotasyon ile monte edilir. Bir hassas tesviye sistemi hücre substrata uyum dik tutar. Boşluk yüksekliği (hücre substrat koni apeksinden mesafe tarafından tanımlanan) bir yüksek hassasiyetli derinlik ölçer ile ayarlanır. Bir gres yakalamak ve medya salmastra odası konut hücreleri temiz ve yağ ve enkaz serbest tutulmasını sağlamak için sırada yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Scott I. Simon ve Anthony G. Passerini NIH / NHLBI hibe R01 HL082689 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 x 20mm Petri Dishes | BD Falcon | 353003 | |
| Ethanol 95% | EMD Chemicals | EX0290-1 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Type I Rat Tail Derived Collagen | Gibco | A10483-01 | |
| Human Aortic Endothelial Cells | Genlantis | PH30405A | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Invitrogen | 15240-062 | |
| Endothelial BulletKit | Lonza | CC-4176 | |
| Endothelial Basal Media-2 | Lonza | CC-3156 | |
| 10 ml Syringes | BD Falcon | 309604 | |
| Polyurethane tubing | Tygon | ABW0001 | |
| Leibovitz-15 Media | Gibco | 11415-069 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 184 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Curing Agent | Dow Corning | 184 | |
| SU8 Photoresist Master Wafer | UC Davis Pan Lab | N/A | |
| Eclipse TE200 Inverted Microscope | Nikon | Eclipse TE200 | |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | PHD2000 | |
| 19 gauge hypodermic needle | Kendall | 8881 | |
| THP-1 Monocytic Cell Line | ATCC | TIB-202 | |
| HBSS (Hanks Buffered Saline Solution) with Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14025-092 | |
| Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α) | R&D Systems | 210-TA-010 | |
| Stromal Derived Factor - 1 (SDF-1) | R&D Systems | 350-NS-010 | |
| RPMI 1640 | Cellgro | 10-040-CV | |
| Human Serum Albumin (HSA) | ZLB Behring | NDC 0053-7680-32 | |
Table 2. Specific reagents and equipment. |
|||
References
- Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response. Lab Chip. 7, 448-456 (2007).
- Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress. Microcirculation. 15, 311-323 (2008).
- Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha. Circ. Res. 100, 381-390 (2007).
- Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).
- Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).
- Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).
- Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels. Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).
- Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo. Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).
- Burdge, G. C., Calder, P. C. Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease. Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).
- Hotamisligil, G. S. Inflammation and metabolic disorders. Nature. 444, 860-867 (2006).
- Libby, P. Inflammation in atherosclerosis. Nature. 420, 868-874 (2002).
- Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity. Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).
- Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).
- Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).
- Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. Design and construction of a linear shear stress flow chamber. Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).
- Helmke, B. P. Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces. Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).
- Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).
- Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia. Circulation. 119, 2708-2717 (2009).
- Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress. The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).
