Summary
Dopamin er tydelig regulert i midbrain kjerner, som inneholder cellen organer og dendritter av dopamin nerveceller. Her beskriver vi en disseksjon og prøvehåndtering tilnærming for å maksimere resultater, og dermed konklusjoner og innsikt, på dopamin regulering i midbrain kjerner av substantia nigra (SN) og ventral tegmentale området (VTA) i gnagere.
Abstract
Dopamin er en kraftig studert nevrotransmitter i CNS. Faktisk har sitt engasjement i locomotor aktivitet og belønning-relatert adferd fostret fem tiår med granskningen av molekylære manglene knyttet dopamin regulering. De fleste av disse forespørslene av dopamin regulering i hjernen fokus på det molekylære grunnlaget for sin regulering i de terminale feltet delene av nigrostriatal og mesoaccumbens stier, striatum og nucleus accumbens. Videre har slike studier konsentrert seg om analyse av dopamin vev innhold med normalisering å bare våt vev vekt. Undersøkelse av proteiner som regulerer dopamin, som tyrosin hydroksylase (TH) protein, TH fosforylering, dopamin transporter (DAT), og vesicula monoamine Transporter 2 (VMAT2) protein ofte ikke omfatte analyse av dopamin vev innhold på samme prøve. Evnen til å analysere både dopamin vev innhold og dens regulerende proteiner (inkludert post-translational modifikasjoner) ikke bare gir iboende kraft til å tolke forholdet mellom dopamin med protein nivå og funksjon av TH, DAT, eller VMAT2, men også strekker prøven økonomi. Dette oversettes til lavere kostnader, og likevel produserer innsikt i den molekylære reguleringen av dopamin i praktisk talt alle paradigme av etterforskerne valg.
Vi fokuserer analysene i midbrain. Selv om SN og VTA er vanligvis neglisjert i de fleste studier av dopamin regulering, er disse kjerner lett dissekert med praksis. En omfattende avlesning av dopamin vev innhold og TH, DAT, eller VMAT2 kan gjennomføres. Det er voksende litteratur om virkningen av dopamin funksjon i SN og VTA på atferd, og de impingements av eksogene stoffer eller sykdomsprosesser journalopplysninger 1-5. Videre forbindelser som for eksempel vekstfaktorer ha en dyp effekt på dopamin og dopamin-regulerende proteiner, til en forholdsvis større grad i SN eller VTA Vi vil illustrere disseksjon teknikk for å skille disse to kjerner og prøvebehandling av dissekert vev som produserer en profil avslørende molekylære mekanismer av dopamin regulering in vivo, spesifikke for hver kjerner (figur 1).
Protocol
1. Disseksjon
- På en seng av våt is, chill en gnager hjerne matrise (koronale deler segregert 1 mm fra hverandre), en petriskål inneholder 5 barberhøvler, og en 11 skalpell. I en egen beholder, merkes plass 2 ml størrelse microfuge rør inn tørris.
- Etterforskeren vil velge metode for aktiv dødshjelp. Vi har reproduserbare resultater gjennomfører en meget kort anestesi med isofluran, Ideelt sett bør en vaporizer brukes. Men hvis ikke er tilgjengelig, bruker vi et stort batteri krukke inneholder en plattform. Med batteriet glasset plassert i en godkjent ventilasjon panseret, plasserer en isofluran-mettet gaskompress under plattformen og vent 3-5 minutter, slik at isofluran å mette batteriet glasset. Plasser rotte inne og fjern for halshogging så snart rotta har mistet bevisstheten. Raskt fjerne hjernen (ideelt på under to minutter), skyll under kaldt vann og legg umiddelbart i kjølt gnager hjernen matrise.
- Ett minutt etter stillingIng hjernen inn i matrisen, setter kalde barberblader inn den avkjølte hjernen, som begynner rundt 2 mm rostral til optikken chiasm hvis striatum og nucleus accumbens er ønskelig for analyse i tillegg til midbrain kjerner. Fortsett sette kalde barberblader med hver 1 mm seksjon før ankomst midtveis pons, svimlende plassering av hver etterfølgende barberblad måte som letter lettere fjerning av hver enkelt blad.
- Når du trekker ut barberhøvler, se etter starten av hippocampus. Når det er helt pakket rundt midbrain, begynner å ta deler ved hjelp av # 11 skalpell blad, som illustrert i figur 2.
- Umiddelbart plassere dissekert vevet inn i pre-avkjølte microfuge røret på tørris. I rotte, forventer å kunne dissekere SN og VTA fra minimum to koronale skiver og maksimalt tre. Oppbevar vev ved -80 ° C til den er klar for behandling.
2. Tissue Analyse: HPLC feller Dopamin og metabolitter
For fullstendig informasjon om HPLC utstyr og vedlikehold, se HPLC analyse på slutten av manuskriptet.
- Forsiktig homogenisere vev umiddelbart etter fjerning av tørr-is med iskald 0,1 M HClO 4-EDTA løsning (0,1 M HClO 4 & 0,1 mm EDTA) 9, som inneholder N-methyl dopamin ved en konsentrasjon på 20 ng / ml som fungerer som en intern standard for utvinning av prøven under HPLC analyse. Den homogenizer vi bruker er en Branson 150 Sonifier, med den innstillingen ved 10% av full kraft (1 av 10). Følgende sonikator volumene anbefales:
I rotte, SN = 250 mL (ensidig disseksjon), 400 mL (bilateral disseksjon), VTA = 200 mL (ensidig disseksjon), 400 mL (bilateral disseksjon).
I mus, (bilaterale disseksjoner bare), SN = 200 mL, VTA = 200 mL. - Etter homogenisering, hold prøver på tørris. Prøvene er så centrifuged (DuPont Sorvall Microspin 24S) på 12 000 RPM til sediment protein pellet som skal brukes for Western Blot bestemmelser. De supernatants blir injisert direkte inn i HPLC. Følgende injeksjonsvolumer anbefales for presis analyse i rotte eller mus: (. Enten fra prep) SN = 150 (. Fra enten prep), VTA = 160 mL
- Aksjen standard er forberedt på 1 mg / ml ved å tilsette riktig mengde monoamines og metabolitter * av dopamin komponent til 0,1 M perklorsyre 0,1 mM EDTA. Konsentrasjonen av enkelte sammensatte er 1 mg / ml, unntatt tryptofan som er 5 mg / ml. Aksjen standarden er delt inn i 10 mL alikvoter og lagret i ultralav inntil nødvendig.
* Alle vekter korrigert for salt form av det sammensatte hvis aktuelt.
Klargjør arbeider standarden ved å fortynne en 10 mL delmengde av lager standard til 100 ml av perklorsyre løsningen. Konsentrasjon av arbeidsmiljøet standard er 0,1 mikrogram / ml unntatt tryptofan som er 0,5 mikrogram / ml. 50 mL avdette arbeidet standarden er sprøytet inn i HPLC for en on-kolonne mengden 5 ng av hver komponent unntatt tryptofan som er 25 ng. - Bestemmelse av dopamin utvinning innenfor prøve delmengde:
Det er flere trinn involvert for å bestemme dopamin utvinningen fra et utvalg delmengde. - Først dele dopamin topphøyde på prøve av dopamin topphøyde av standarden og multiplisere dette forholdet med det totale beløp (ng) av dopamin i standarden. Vår standard dopamin konsentrasjonen er 0,1 ng / mL og 50 mL av standard er analysert. Dermed er den mengde av dopamin i standard 5 ng. Dermed kan ligningen nedenfor brukes til bestemmes dopamin utvinning i en gitt prøve:
(Dopamin topphøyde i utvalget / dopamin topphøyde i standard) * 5 ng - Korrigering for tap av prøven ved hjelp av intern standard N-metyl dopamin:
Selve utvinningen av N-metyl dopamin beregnes på samme måte som dopamin ved å dividere N-methyl DOPamin topphøyde i utvalget av N-metyl dopamin topphøyde av standarden og multiplisere dette forholdet med det totale beløp (ng) av N-metyl dopamin i standarden. Som dopamin, er vår standard N-metyl dopamin konsentrasjonen 0,1 ng / mL. 50 mL av standarden er analysert. Dermed er mengden av N-metyl dopamin i standard 5 ng. Dermed kan ligningen nedenfor brukes til å bestemme N-metyl dopamin utvinning i en gitt prøve:
(N-metyl dopamin topphøyde i utvalget / N-metyl dopamin topphøyde i standard) * 5ng
Men fordi N metyl dopamin i hver prøve kommer ikke fra prøven i seg selv, men fra HPLC buffer, er mengden av N-metyl dopamin forventes i hver prøve beregnes. N-metyl dopamin konsentrasjonen i HPLC buffer er 20 ng / ml eller 0,02 ng / mL, så forventet mengden av N-metyl dopamin i hver prøve er funnet ved å multiplisere N-metyl dopamin konsentrasjonen av HPLC buffer ved delmengde volum av hver prøve som brukes for HPLS analyse. Dette er demonstrert i ligningen nedenfor:
(0,02 ng / mL) * (delmengde volum av prøven brukes til HPLC analyse) - Forskjellen mellom forventet og gjenvunnet N-metyl dopamin kan deretter brukes til å korrigere for mengden av dopamin gjenvunnet ved å justere for eventuelle prøve tap. Bare ta forholdet mellom forventet N-metyl dopamin / gjenvunnet N-metyl dopamin og multiplisere dette med mengden av dopamin gjenvunnet. Dermed er den samlede ligningen for mengden av dopamin i en prøve delmengde gitt nedenfor:
(Dopamin topphøyde i utvalget / dopamin topphøyde i standard) * (N-metyl dopamin topphøyde i standard / N-metyl dopamin topphøyde i utvalget) * (0,02 ng / mL) * (delmengde volum av prøven brukes til HPLC analyse ) - Totalt dopamin utvinnes fra et utvalg:
Verdien av dopamin utvinnes fra et utvalg delmengde blir så brukt til å ekstrapolere den totale mengden av dopamin i en gitt prøve. Dette gjøres ved å dele den gjenopprettede beløp (ng) of DA ved delmengde volum og multiplisere denne verdien av det totale volumet av HPLC buffer at prøven ble sonicated i. Dette er gitt ved ligningen nedenfor:
(Beløp (ng) av dopamin i utvalget delmengde / volum av prøven delmengde) * (Totalt volum av HPLC buffer der prøven ble sonicated).
Leseren henvises til følgende studier 2,4,10 for en omfattende presentasjon av vurderingen av dopamin og metabolitter i forbindelse med avlesninger fra dopamin-regulere proteiner i ikke bare SN og VTA, men striatum og nucleus accumbens også.
3. Tissue Analyse: Total Protein og Final Normalisering av TH og DAT Resultater
- Plasser utfelte protein pellets (avledet fra HPLC buffer behandling) inn i våt is for å opprettholde 4 ° C. Sørg for at all buffer har blitt fjernet og arkivert (hvis bekreftende analyse er nødvendig). Dersom SN eller VTA skal behandles bilateralt (rotte bare), tilsett 300 mL (SN) eller 200 mL (VTA) på 1% SDS inneholder 5 mM Tris (pH 8,3) og 1 mM EDTA til pellets og sonicate. Tilsett 150 mL av SDS løsningen SN pellets eller 100 mL til VTA pellets om behandling vev fra ensidige disseksjoner.
- Plasser prøvene i nærheten kokende vann i ~ 5 minutter å fullføre protein denaturering og la avkjøles til romtemperatur. Sikre caps er sikkert holdt på dette trinnet.
- Bestem protein konsentrasjon i prøvene ved hjelp av BCA analysen, inkludert et protein standard kurve (albumin standard) utvalg av 2-40 mikrogram protein. Assay 5 mL volum av prøven i tre eksemplarer og bruke medianverdien for å bestemme protein mengde mot standardkurve. Dividere ved analysen volum for protein konsentrasjon. Merk dette er den første av to skritt for å normalisere total TH, DAT, og VMAT2 resultater til total protein utvinning.
- Forbered prøvene med sample buffer (som inneholder ditiotreitol) for å redusere SDS-elektroforese på 10% akrylamid gEls. Ideelt sett bør den endelige totale protein konsentrasjon være ~ 2 mikrogram / mL. Grunnen til denne konsentrasjonen valget er å redusere prøvevolum er nødvendig for den ultimate bestemmelse av TH fosforylering, som ~ 100 mikrogram total protein vil være nødvendig for lasting til nøyaktig kvantifisere ser31 og ser40 TH fosforylering. Hvis gul farge er sett i prøven etter at prøven buffer, er utvalget for syrlig. Tilsett 1 M Tris (pH 8,2) i 10 mL trinn til blå farge er gjenopprettet.
- Forbered prøvene som følger for følgende bestemmelse av dopamin-regulerende proteiner:
- TH: Mot en kalibrert standard for TH protein (som ng), konsentrasjonen av TH (som per ng TH per total mikrogram protein) i SN forventes å variere fra ~ 0.05 til 0,27 ng TH per mikrogram total protein 2,4, 7,10,11. Mot en lineær TH standard kurve, alt 0,5 til 5,0 ng TH og bruke primære antistoff til TH (Millipore katt # AB152, 1:1000 fortynning i PVP T-20 Blokkering løsning) som produserer en lineær standardkurve, bør den optimale belastningen av total protein fra SN være ~ 10 mikrogram. Konsentrasjonen av TH i VTA spenner fra ~ 0,4 til 1,0 ng TH per mikrogram protein 4,11. Derfor bør total protein belastning for VTA være ~ 5 mikrogram.
- DAT: De relative mengdene DAT i SN eller VTA er betydelig mindre enn i de beslektet terminal feltet regioner i striatum og nucleus accumbens 4. Den relative uttrykk for DAT som normalisert til gjenvunnet TH protein er også betydelig lavere i SN og VTA. Følgelig protein belastninger for kvantifisering av DAT protein i SN eller VTA må være mye større enn å prøve masse av terminalen feltet regionene. Minst 30 mikrogram av totalt protein er nødvendig for presisjon i DAT vurdering i VTA og en nominell last på 50 mikrogram total protein er behov for vurdering i SN. Den primære antistoffet brukes er i Santa Cruz, katt # sc-1433.
- VMAT2: Uttrykket av VMAT2, Som normalisert til total protein, er større i mesoaccumbens enn nigrostriatal regioner. Men i forhold til TH uttrykk, er VMAT2 uttrykk størst i SN og minst i striatum 4. Bruke Santa Cruz katt # sc-15314, en nominell total protein belastning av ~ 40 mikrogram for å være best for kvantifisering av VMAT2.
- Kjør riktig mengde av total protein ved hjelp av SDS-PAGE på 10% akrylamid gel. Bio-Rad Protean II elektroforese enhet brukes for de bestemmelser, som er en stor gel format. Overfør proteiner på 0,45 mikrometer porestørrelse nitrocellulose. For overføring, en Hoeffer tank satt til minst 27 volt gjør at overføringen skal skje over natten.
- La blotter tørke i minst 30 minutter og deretter flekken med Ponceau S løsning (1% Ponceau S i 5% iseddik) for ~ 5 minutter. De-flekk kraftig med 0,2% HCl løsning inntil individuelle protein band klart å løse, og bakgrunnen farging er fjernet. Skaffe et bilde av Ponceau S flekkening ved hjelp av Image J til videre kvantifisere relative protein last i hvert kjørefelt og normalisere TH, DAT, eller VMAT2 resultater (figur 3).
4. Tissue Analyse: stedsspesifikk TH fosforylering
Fosforylering av TH kl ser31 eller ser40 kan øke L-DOPA biosyntesen i catecholaminergic celler 12. Selv om mengden av fosforylering på hvert sted nødvendig å øke L-DOPA biosyntesen i dopaminerge områder av hjernen som SN og VTA er ikke etablert, det er dokumentert at ser31 fosforylering spiller en betydelig rolle i å regulere L-DOPA biosyntese 10 og co-varierer med DA vev innholdet blant striatum, nucleus accumbens, SN, og to VTA, 10. Likevel, inkludering av ser40 bestemmelser er nødvendige, som mange studier viser det kan påvirke TH aktivitet, spesielt hvis en terskel for fosforylering er nådd 12.
Mens ser19 phosphorylatipå påvirker ikke TH aktivitet alene 13,14, kan det betraktes som en sentinel for Ca 2 +-avhengige signalering i DA nervecellen, gitt at ekstracellulær Ca 2 + er nødvendig å øke ser19 fosforylering henhold depolariserende forhold 12. Videre er det en signifikant positiv korrelasjon av ser19 fosforylering med ser31 fosforylering bare i SN og VTA 10, som betyr at ser19 fosforylering status kan påvirke ser31 fosforylering, og dermed indirekte L-DOPA biosyntesen.
Smak last hensyn til optimal kvantifisering av stedsspesifikk TH fosforylering støkiometri: Nedenfor er de hensyn som kreves for nøyaktige og presise bestemmelser av stedsspesifikk TH fosforylering i dissekert vev presentert. Når det er mulig, bør en kalibrert TH fosforylering standard skal inngå i vurderingen av prøven TH fosforylering. Prøven last må ta hensyn account iboende støkiometri på hvert fosforylering nettstedet slik at analysen kvantifiserer fosforylering innenfor dynamiske rekkevidden av antistoff som brukes. Som et siste notat, bør den iboende total protein kommer inn i analysen for hver prøve skal også legges i standardkurve baner. Dette er enkelt å oppnå med en transportør protein (slik som rotteleveren) som uttrykker ikke TH.
- . ser19 Av de tre fosforylering nettstedene, ser19 fosforylering støkiometri nivåer er størst i SN og VTA, alt 0,15 til 0,25 2,10,11. Det andre hensynet er at vår påvisningsmetoden, er ser19 ps tallfestes i lineær mellom 0,5 og 5,0 ng fosfor ser19 10. Gitt disse hensyn, en total TH protein belastning mellom 5 og 10 ng (og dermed gi en estimert 0,75 til 2,5 ng fosfor ser19 fra prøven) ville gi en pålitelig mål på ser19 TH fosforylering. Vi bruker Phosphosolutions primær (Kat. # P1580-19) på 1:1000 fortynning.
- . ser31 ser31 fosforylering støkiometri nivåer er relativt mindre i SN og VTA forhold til sine beslektet terminal feltet regioner, fra ~ 0,04 til 0,10 2,4,10,11. Ved vår påvisningsmetoden, er ser31 ps oppdaget i lineær mellom 0,5 og 7,0 ng fosfor ser31 10. Gitt disse hensyn, en total TH protein belastning mellom 10 og 30 ng (og dermed gi en estimert 0,50 til 3,0 ng fosfor ser31 fra prøven) ville gi en pålitelig mål på ser31TH fosforylering. Se Figur 4A for et eksempel på ser31 kvantifisering. Vårt primære antistoff er en in-house affinitet-renset antistoff som ble produsert av 21. århundre Biochemicals, (Boston, MA), og validert for spesifisitet i fosfor-epitop bruke våre egne standarder 2.
- ser40 ser40 fosforylering støkiometri nivåer i SN og VTA spenner fra ~ 0.02 -. 0.06 2,4,10,11. Ved vår påvisningsmetoden, ser40 ps er oppdaget i lineær området mellom 0,2 og 2,0 ng fosfor ser40 10. Gitt disse hensyn, en total TH protein belastning mellom 10 og 30 ng (og dermed gi en estimert 0,20 til 1,8 ng fosfor ser40 fra prøven) ville gi en pålitelig mål på ser40TH fosforylering. Se figur 4B for et eksempel på ser40 kvantifisering. Vi bruker Phosphosolutions primær (Kat. # P1580-40) på 1:1000 fortynning.
5. Representative Resultater
- Dopamin i SN vs VTA Det er tre avlesninger av dopamin (eller metabolitter) som kan tas i kvantitativ analyse;. Som per total restituert fra disseksjon, per protein, og per TH protein (vist for striatum, SN, nucleus accumbens, og VTA i tabell 1 nedenfor). Totalt dopamin restitusjon mellom SN og VTA er ganske sammenlignbar, og varierer mellom 6-9 ng for to til tre koronale slice disseksjoner 2. Normalisering dopamin bedring til total protein vil vise that, basert på disseksjonen Metoden som benyttes, at VTA vil ha større dopamin per total protein, i snitt 6-8 ng / mg protein i SN og 9-10 ng / mg protein i to VTA, 4. Til slutt bør normalisering av dopamin til total TH utvinnes også avsløre en forskjell mellom SN og VTA, er større i VTA 10, og varierer mellom 0,2 og 0,8 ng dopamin per ng TH protein mellom de to regionene 2,10.
DA region Total DA gjenvunnet DA per mg protein DA per ng TH striatum 214 ± 16 165 ± 13 0.56 ± 0.11 SN 8.4 ± 0.8 6.1 ± 0.5 0.18 ± 0.03 Nucleus accumbens 60 ± 6 75 ± 4 0.77 ± 0.03 VTA 6.0 ± 1.0 9.2 ± 1.4 0.22 ± 0.03 - Totalt proteiner: TH, DAT, VMAT2 Bruke kalibrert TH protein standard for kvantifisering, er mer TH gjenfunnet i SN enn VTA fra disseksjonen (60 ng i SN og 26 ng i VTA 2). Men når normalisert til protein, reverserer dette forholdet, med TH per total protein i VTA er ~ 3 - til 5 ganger større enn i SN, (~ 0,32 ng / mg protein i VTA og ~ 0,09 i SN) 4, 10.
Den forventede gjenvinning av DAT i SN og VTA er lik, med litt mer utvinning i VTA som per total protein eller som per total TH restituert fire. Spesielt er DAT protein mye mindre rik i disse regionene sammenlignet med beslektet terminal feltet regionene 4 VMAT2 utvinning som per total protein er større i VTA versus SN 4. Men når normalisert til TH protein, det er litt større bedring i SN 4. - Stedsspesifikk TH fosforylering Fra en rekke studier har det vært konsistente resultater i ser19, ser31, og ser40 fosforylering kvantum i SN og VTA, og også i forhold til beslektet terminal feltet regioner. Ser19 fosforylering er særlig større i SN og VTA (~ 0,2 til 0,3) i forhold til striatum og nucleus accumbens (~ 0,05 til 0,15) 2,4,7,10,11. Ser31 fosforylering er betydelig mindre i SN og VTA forhold til sine beslektet terminal felt regioner, er ~ 0,06 til 0,10 mellom disse somatodendritic regionene 2,4,7,10,11. Under hemming av aromatisk syre decarboxylase med NSD-1015, det er en 2-fold økning i ser31 fosforylering i VTA bare 10. Ser40 fosforylering varierer mellom 0,02 og 0,05 i SN ogVTA og generelt dette støkiometri ikke avviker vesentlig fra de beslektet terminal feltet regioner 2,4,7,10,11.
Figur 1. Dopaminerge avlesninger fra en vev disseksjon.
Figur 2. Dissection Teknikk for å isolere midbrain dopaminerg neuropil. Teknikk for å dissekere substantia nigra (SN) fra ventrale tegmentale området (VTA). 1. Fjern overliggende cortex og hippocampus (disse strukturene har allerede blitt fjernet i bilde over). 2. Lag et vertikalt snitt skiller det pigmenterte området av SN fra VTA. 3. Lag en horisontal kutt ved eller nær midtlinjen like ovenfor dorsal og laterale meste av SN. 4. Erte SN vekk fra resten av hjernestammen. Når SN har blitt fjernet, likeledes erte VTA unnaResten av midbrain. Merk: Denne delen er vanligvis observert på koordinater, i forhold til Bregma, på AP 5,7.
Figur 3. Andre (og siste) normalisering av total protein load-Ponceau S farging for Bilde J analyse. Ponceau S protein farging av en total TH bestemmelse i rotte substantia nigra prøver. De første fem baner danne venstre er standard total TH kurve, som 28 mikrogram protein fra rotteleveren homogenat ble lagt til speile protein lasten fra substantia nigra prøvene. Den neste kjørefelt inneholder molekylvekt (MW) markører. De resterende baner inneholde ~ 28μg protein fra rotte substantia nigra prøver. De protein lastene er basert på protein konsentrasjonen av hver prøve som bestemmes av BCA metoden. Men til tross for hva som bør være like belastninger, er det variasjoner i mørke Ponceau S flekker mellom prøvene indikerer en svakvariasjon i protein konsentrasjoner, som er korrigert for ved normalisering bruke ImageJ analyse for å analysere mengden Ponceau S farging for hver prøve.
Figur 4. Representative TH fosforylering resultater fra kontroller og behandlinger. Representant ser31 fosforylert tyrosin hydroksylase (PTH) og ser40 PTH vestlige blotter fra saltvann og metamfetamin behandlede Wistar rotter fra en tidligere studie 4. A. ser 31 PTH i rotte substantia nigra prøver. den kalibrerte tjenes 31 PTH standardkurve varierer mellom 0,3 ng til 2,0 ng og er innenfor lineær rekke deteksjon. Basert på tidligere Western blot analyse av totalt TH nivåer, ble 6 ng av total TH lastet for hver prøve. B. ser40 PTH i rotte ventrale tegmentale prøver. den kalibrerte ser40 PTH standardkurve varierer fra 0,2 ng til 1,5 ng og er innenfor lineær rekke deteksjon. Basert på tidligere Western blot analyse av totalt TH nivåer, ble ni ng av total TH lastet for hver prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som beskrevet i figur 1, bør metodene beskrevet ovenfor gi flere avlesninger av dopamin og dens regulere proteiner TH, DAT, og VMAT2 fra en prøve av SN eller VTA hentet fra enten rotte eller mus. Igjen, fordelene ved å gjennomføre denne protokollen er at undersøkeren kan få operasjonelt-matchede analysering av hvordan dopamin er regulert in vivo etter nesten alle eksperimentelle paradigmet, og dermed spare betydelige eksperimentelle ressurser ved å redusere antall dyr som kreves i noen eksperiment.
Det er helt avgjørende at etterforskeren observere temperatur krav som stilles under disseksjon (4 ° C), lagring av vev (minst -70 ° C), vev sonikator (umiddelbar sonikator etter fjerning av lagringstemperatur) i iskaldt HPLC buffer og påfølgende pellet formasjon og behandling. Når pellets er sonicated og kokt i SDS-løsning, kan prøvene fortsatt være FurthER behandlet ved romtemperatur. Lagring av arkiverte HPLC analysert prøven og prøve buffer preparerte prøver for protein analyse bør være ved -80 ° C.
Igjen er den store fordelen av protokollen det medfødte tilnærming til operativt-kampresultatene knyttet til dopamin regulering in vivo. Videre normalisering dopamin vev lettleselig til markører for dopaminerg neuropil (TH, DAT) gir en stor grad av sikkerhet for at undersøkeren er dissekere SN eller VTA med konsistens og nøyaktighet. Gitt involvering av dopamin i avhengighet, psykisk lidelse, og bevegelige arenaer, kan dette protokollen benyttes i mange eksperimenter. En viktig begrensning er at tolkningen av TH fosforylering resultatene bør være konservativ, da det ikke er kjent på dette tidspunktet i hvilken grad en økning i fosforylering ved ser31 eller ser40 kreves in vivo for å øke L-DOPA biosyntesen. Men som nevnt, det er EVidence som ser31 fosforylering synes å regulere L-DOPA biosyntese og har en rolle i å regulere totalt dopamin vev innhold i CNS 2,10. På denne tiden standarder for TH protein og TH fosforylering er ikke kommersielt tilgjengelig. Imidlertid har dette laboratoriet opprettholdt og utvidet slike standarder basert på de som brukes når den første artikkel om TH fosforylering regulering in vivo ble publisert 11. Likevel er det mulig å normalisere dopamin vev innhold til gjenfunnet TH protein i disse diskrete regioner ved hjelp av denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Midler til dette arbeidet, og som sitert 2,10, ble gitt, delvis ved et forskningsstipend tildelinger til MF Salvatore fra American Federation for Aging Research, The Edward P. Stiles Trust Fund og Biomedical Research Foundation of Northwest Louisiana, og til BS Pruett fra Ike Muslow Predoctoral Fellowship, LSU Health Sciences Center-Shreveport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
HPLC system: |
|||
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system. |
|||
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run. |
|||
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data. |
|||
Pump: Shimadzu LC-10AD |
|||
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | J.T. Baker | 4095-02 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| Trizma HCl | Sigma | T3253-1KG | |
| Glycerol | Sigma | G8773-500 mL | |
| PVP-40 | Sigma | PVP40-1KG | |
| dPBS | Gibco | 21600-069 | |
| Tween20 | Sigma | P1379-500 mL | |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| Ponceau S | Fluka | 81460 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026-5G | |
| Dithiothreitol | Sigma | D-9163 | |
| Protein Standard 2 mg BSA | Sigma | P5619-25VL | |
| Pierce BCA Protein Assay Reagent A | Thermo-Fisher Scientific | 23223 | |
| Precision Plus Protein Standard | Bio Rad | 161-0373 | |
| [125I]-protein A, specific activity | Perkin-Elmer | ||
Table 2. Specific reagents. |
|||
| 10% SDS | 10 g SDS, 100 mL DI H20 | ||
| 1% SDS (pH to 8.2) | 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20 | ||
| Copper II Sulfate Solution | 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20 | ||
| 3X Sample Buffer | Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample. | ||
| 1X Sample Buffer | Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20 | ||
| 10X Running Buffer (Makes 4 L) | Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g | ||
| 10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) | Glycine 360 g Trizma Base 96 g | ||
| Ponceau | Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL | ||
| .2% HCl Solution | 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20 | ||
| PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) | PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL | ||
| 10X Blot Buffer (Makes 4 L) | Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g | ||
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas. |
|||
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11. |
|||
References
- Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
- Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
- Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
- Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
- Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
- Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
- Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
- Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
- Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
- Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
- Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
- Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
- Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).
