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Neuroscience

Substantia nigra और ventral Tegmental क्षेत्र के में Dopamine विनियमन के व्यापक रूपरेखा

Published: August 10, 2012 doi: 10.3791/4171
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmacology, Toxicology, & Neuroscience, Louisiana State University Health Sciences Center

Summary

यह dopamine साफ़ मध्यमस्तिष्क नाभिक, जो सेल शरीर और dopamine न्यूरॉन्स की dendrites के होते में नियंत्रित किया जाता है. यहाँ हम midbrain substantia nigra (एस एन) और कृन्तकों में उदर tegmental क्षेत्र (VTA) के नाभिक में dopamine के विनियमन पर एक विच्छेदन और नमूना से निपटने के लिए परिणामों को अधिकतम करने के दृष्टिकोण, और इस तरह के निष्कर्ष और अंतर्दृष्टि का वर्णन.

Protocol

1. विच्छेदन

  1. गीला बर्फ के एक बिस्तर पर, एक कृंतक मस्तिष्क मैट्रिक्स (राज्याभिषेक वर्गों 1 मिमी अलग अलग है), 5 छुरा युक्त एक पेट्री डिश, और # 11 स्केलपेल ठंडा. एक अलग कंटेनर में जगह सूखी बर्फ में 2 मिलीलीटर आकार microfuge के ट्यूबों लेबल.
  2. अन्वेषक इच्छामृत्यु की विधि का चयन करेंगे. हम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य isoflurane, आदर्श रूप में, vaporizer इस्तेमाल किया जाना चाहिए के साथ एक बहुत ही संक्षिप्त संज्ञाहरण आयोजित परिणाम है. हालांकि, अगर नहीं उपलब्ध है, हम एक बड़ी बैटरी एक मंच युक्त जार का उपयोग करें. बैटरी एक अनुमोदित ventilating हुड में स्थित जार के साथ, एक isoflurane संतृप्त मंच के नीचे धुंध पैड जगह और 3-5 मिनट प्रतीक्षा करने के लिए isoflurane बैटरी जार तर करने के लिए अनुमति देते हैं. अंदर चूहा प्लेस और शिरच्छेद के लिए हटाने के रूप में जल्द ही के रूप में चूहे होश खो दिया है. तेजी से (आदर्श रूप में दो मिनट के अंतर्गत) मस्तिष्क, ठंडे पानी में कुल्ला निकालने के लिए, और तुरंत ठंडा कृंतक मस्तिष्क मैट्रिक्स में जगह.
  3. स्थिति के बाद एक मिनटमैट्रिक्स में आईएनजी मस्तिष्क, ठंडा मस्तिष्क में ठंड रेज़र ब्लेड डालें, 2 ऑप्टिक chiasm के लिए विजय - स्तम्भ मिमी के आसपास शुरुआत है अगर striatum और नाभिक accumbens मध्यमस्तिष्क नाभिक के अलावा में विश्लेषण के लिए वांछित हैं. PONS के माध्यम से रास्ते के मध्य में पहुंचने तक प्रत्येक अनुभाग 1 मिमी के साथ ठंड रेज़र ब्लेड डालने, इतनी के रूप में प्रत्येक व्यक्ति के ब्लेड के आसान हटाने की सुविधा के लिए प्रत्येक बाद धार के स्थान लड़खड़ाहट जारी रखें.
  4. जब छुरा बाहर खींच, हिप्पोकैम्पस की शुरुआत के लिए देखो. जब यह पूरी तरह से मध्यमस्तिष्क चारों ओर लपेटा गया है, # 11 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर वर्गों लेने के लिए शुरू हो, के रूप में चित्रा 2 में सचित्र.
  5. तुरंत पूर्व ठंडा microfuge के ट्यूब में सूखी बर्फ पर विच्छेदित ऊतक जगह. चूहे में, एस.एन. और VTA दो राज्याभिषेक स्लाइस और तीन की एक अधिकतम की एक न्यूनतम से काटना करने के लिए सक्षम होने की उम्मीद है. -80 डिग्री सेल्सियस तक प्रसंस्करण के लिए तैयार स्टोर ऊतकों.

2. ऊतक विश्लेषण: HPLC चया Dopamine और चयापचयों

HPLC उपकरण और रखरखाव पर पूरी जानकारी के लिए, पांडुलिपि के अंत में HPLC विश्लेषण देखें.

  1. धीरे से सूखी बर्फ का उपयोग बर्फ ठंड 0.1 एम HClO 4 EDTA के समाधान (0.1 एम 4 HClO और 0.1 मिमी EDTA) 9, जो 20 एनजी / एमएल के रूप में कार्य करता है कि एकाग्रता में एन मिथाइल डोपामाइन के शामिल हैं से हटाने के तुरंत बाद ऊतक homogenize नमूना HPLC विश्लेषण के दौरान वसूली के लिए एक आंतरिक मानक. homogenizer का उपयोग हम Branson 150 Sonifier, सेटिंग के साथ पूर्ण शक्ति का 10% (1 10) है. निम्नलिखित sonication संस्करणों की सिफारिश कर रहे हैं:
    चूहे में, एस.एन. = μl 250 (एकतरफा विच्छेदन), 400 μl (द्विपक्षीय विच्छेदन), VTA = 200 μl (एकतरफा विच्छेदन), 400 μl (द्विपक्षीय विच्छेदन).
    माउस, (द्विपक्षीय केवल dissections), एस एन = 200 μl, VTA = 200 μl.
  2. Homogenization के बाद, सूखी बर्फ पर नमूने पकड़. नमूने तो हैं centrif12,000 RPM में uged (ड्यूपॉन्ट Sorvall Microspin 24s) तलछट के लिए प्रोटीन गोली पश्चिमी धब्बा निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए. supernatants सीधे HPLC में इंजेक्ट कर रहे हैं. निम्नलिखित इंजेक्शन की मात्रा में चूहे या माउस के सटीक विश्लेषण के लिए सिफारिश कर रहे हैं: (या तो प्रस्तुत करने से) एस.एन. = (या तो प्रस्तुत करने से) 150, VTA = 160 μl
  3. स्टॉक मानक 1 मिलीग्राम / एमएल monoamines और चयापचयों का उचित मात्रा में dopamine घटक के 0.1 एम perchloric एसिड 0.1 मिमी EDTA जोड़कर तैयार किया जाता है. प्रत्येक यौगिक की एकाग्रता 1 / tryptophan जो 5 मिलीग्राम / एमएल छोड़कर मिलीग्राम मिलीग्राम है. स्टॉक मानक 10 μl aliquots में विभाजित है और ultralow में संग्रहीत जब तक की जरूरत है.
    * सभी वजन यदि लागू हो तो परिसर के नमक के रूप के लिए सही कर रहे हैं.
    Perchloric एसिड समाधान की 100 मिलीलीटर में 10 स्टॉक मानक के अशेष भाजक μl गिराए द्वारा काम मानक तैयार करते हैं. काम कर मानक की एकाग्रता 0.1 tryptophan जो 0.5 मिलीग्राम / μg को छोड़कर μg / मिलीलीटर है. 50 की μlइस कार्य मानक HPLC में tryptophan जो 25 एनजी को छोड़कर प्रत्येक घटक के 5 एनजी की राशि पर स्तंभ के लिए अंतःक्षिप्त है.
  4. नमूना अशेष भाजक के भीतर dopamine वसूली का निर्धारण:
    वहाँ एक नमूना अशेष भाजक से dopamine वसूली निर्धारित शामिल कई कदम उठाए हैं.
  5. सबसे पहले, मानक के dopamine शिखर ऊंचाई से नमूने के dopamine शिखर ऊंचाई को विभाजित और dopamine की कुल राशि (एनजी) मानक में यह अनुपात बढ़. हमारे मानक डोपामाइन एकाग्रता 0.1 मानक के एनजी / μL और 50 μL assayed है. इस प्रकार, मानक में dopamine की मात्रा 5 एनजी है. इस प्रकार, नीचे समीकरण किसी नमूने में निर्धारित डोपामाइन वसूली के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
    (नमूना / dopamine मानक में शिखर ऊंचाई में Dopamine शिखर ऊंचाई) * 5 एनजी
  6. नमूना आंतरिक मानक डोपामाइन एन मिथाइल का उपयोग कर के नुकसान के लिए सही:
    एन मिथाइल dopamine के वास्तविक वसूली dopamine के रूप में एक ही रास्ते में एन मिथाइल मदिरा के विभाजित करके गणना की हैamine के मानक के dopamine एन मिथाइल शिखर ऊंचाई के द्वारा और एन मिथाइल डोपामाइन की कुल राशि (एनजी) मानक में इस अनुपात गुणा नमूने में शिखर ऊंचाई. डोपामाइन की तरह, हमारे मानक डोपामाइन एन मिथाइल एकाग्रता के 0.1 एनजी / μL है. मानक के 50 μL assayed है. इस प्रकार, एन मिथाइल dopamine के मानक में राशि 5 एनजी है. इस प्रकार, नीचे समीकरण किसी नमूने में एन मिथाइल डोपामाइन वसूली का निर्धारण किया जा सकता है:
    (नमूने में डोपामाइन एन मिथाइल शिखर ऊंचाई / मानक में dopamine एन मिथाइल शिखर ऊंचाई) * 5ng
    हालांकि, क्योंकि प्रत्येक नमूने में dopamine एन मिथाइल नमूना खुद से नहीं है, लेकिन HPLC बफर से आता है, एन मिथाइल डोपामाइन की राशि प्रत्येक नमूने में उम्मीद की गणना है. एन मिथाइल HPLC बफर में डोपामाइन एकाग्रता 20 एनजी / एमएल या 0.02 एनजी / μL, इसलिए उम्मीद की राशि प्रत्येक नमूने में एन मिथाइल डोपामाइन के अशेष भाजक मात्रा द्वारा एन मिथाइल HPLC बफर की dopamine एकाग्रता गुणा करके पाया जाता है प्रत्येक एच के लिए इस्तेमाल किया नमूनापीएलसी विश्लेषण. यह नीचे समीकरण में प्रदर्शन किया है:
    (0.02 एनजी / μL) * (नमूना की अशेष भाजक मात्रा HPLC विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया)
  7. उम्मीद है और बरामद डोपामाइन एन मिथाइल के बीच अंतर तो किसी भी नमूना नुकसान के लिए समायोजन करके बरामद dopamine की राशि के लिए सही करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. बस उम्मीद dopamine एन मिथाइल का अनुपात ले / डोपामाइन एन मिथाइल बरामद और dopamine की राशि बरामद द्वारा यह गुणा. इस प्रकार, एक नमूना अशेष भाजक में dopamine की राशि के लिए समग्र समीकरण नीचे दिया जाता है:
    (/ नमूना dopamine के मानक में शिखर ऊंचाई में Dopamine शिखर ऊंचाई) * (एन मिथाइल नमूने में dopamine मानक / एन मिथाइल शिखर ऊंचाई में dopamine शिखर ऊंचाई) (0.02 एनजी / μL) * (नमूना अशेष भाजक मात्रा HPLC विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया )
  8. कुल dopamine एक नमूना से बरामद:
    एक नमूना अशेष भाजक से बरामद dopamine के मूल्य तो किसी नमूने में डोपामाइन की कुल राशि एक्सट्रपलेशन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. बरामद राशि ओ (एनजी) विभाजित करके किया जाता हैच अशेष भाजक मात्रा और HPLC बफर की कुल मात्रा कि नमूना अंदर sonicated की थी द्वारा इस मूल्य गुणा यह नीचे समीकरण द्वारा दिया जाता है महंगाई भत्ते:
    (Dopamine का नमूना में राशि (एनजी) अशेष भाजक / नमूना अशेष भाजक की मात्रा) * (HPLC बफर की कुल मात्रा में नमूना sonicated किया गया था).
    पाठक dopamine का विनियमन न केवल एस.एन. और VTA में प्रोटीन, लेकिन striatum और नाभिक accumbens रूप में अच्छी तरह से readouts के साथ संयोजन के रूप में dopamine और चयापचयों का मूल्यांकन के लिए एक व्यापक प्रस्तुति के लिए निम्नलिखित 2,4,10 के अध्ययन के लिए भेजा है.

3. ऊतक विश्लेषण: वें और DAT के परिणाम की कुल प्रोटीन और अंतिम सामान्य

  1. गीला बर्फ में उपजी प्रोटीन छर्रों (HPLC बफर उपचार से प्राप्त) प्लेस डिग्री सेल्सियस 4 बनाए रखने सुनिश्चित करें कि सभी बफर हटा दिया गया है और संग्रहीत (अगर पुष्टि विश्लेषण की आवश्यकता है). यदि एस.एन. या VTA द्विपक्षीय संसाधित किया जा (केवल चूहा) है, 300 (एस एन) μL या 2 जोड़ें00% 1 एसडीएस 5 मिमी (8.3 पीएच) Tris और 1 मिमी EDTA के लिए गोली और sonicate युक्त μL (VTA). एस.एन. छर्रों या 100 μl VTA छर्रों एसडीएस समाधान के 150 μL अगर एकतरफा dissections से ऊतक प्रसंस्करण जोड़ें.
  2. पास उबलते पानी में ~ 5 मिनट प्रोटीन विकृतीकरण को पूरा करने के लिए और कमरे के तापमान शांत करने के लिए अनुमति देते हैं के लिए नमूने रखें. सुनिश्चित करें टोपी सुरक्षित रूप से इस कदम पर आयोजित की जाती हैं.
  3. 40 μg प्रोटीन - बीसीए परख का उपयोग कर एक प्रोटीन मानक (albumin मानक) वक्र 2 की सीमा सहित, नमूने में प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. परख तीन प्रतियों में नमूने के 5 μl मात्रा और औसत मूल्य का उपयोग करने के लिए मानक वक्र के खिलाफ प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण. प्रोटीन एकाग्रता के लिए परख मात्रा से विभाजित करते हैं. नोट: इस दो कुल वें, Dat, और VMAT2 परिणाम कुल प्रोटीन वसूली के लिए सामान्य करने के लिए उठाए गए कदमों का पहला है.
  4. 10% acrylamide जी पर एसडीएस वैद्युतकणसंचलन को कम करने के लिए नमूना बफर के साथ नमूने (dithiothreitol युक्त) तैयारएल्स. आदर्श रूप में, अंतिम कुल प्रोटीन एकाग्रता ~ μg μl / 2 होना चाहिए. इस एकाग्रता चयन के लिए कारण नमूना वें phosphorylation की अंतिम निर्धारण के लिए आवश्यक मात्रा को कम करने के लिए, के रूप में कुल प्रोटीन ~ 100 μg ठीक ser31 और ser40 वें phosphorylation यों लोड करने के लिए आवश्यक हो जाएगा है. यदि पीला रंग नमूने में नमूना बफर जोड़ने के बाद देखा जाता है, नमूना भी अम्लीय है. 10 μl वेतन वृद्धि में एम 1 Tris (8.2 पीएच) जोड़ें जब तक नीले रंग पुनर्स्थापित किया जाता है.
  5. नमूने तैयार के रूप में dopamine का विनियमन प्रोटीन के निम्नलिखित निर्धारण के लिए इस प्रकार है:
  6. वें प्रोटीन के लिए एक calibrated मानक (एनजी के रूप में), वें के (कुल μg प्रोटीन के प्रति एनजी प्रति वें के रूप में) एस.एन. में एकाग्रता के खिलाफ वें: ~ 0.05-0.27 μg कुल 2,4 प्रोटीन के प्रति एनजी वें लेकर उम्मीद है, 7,10,11. 5.0 एनजी वें और वें के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी (Millipore बिल्ली AB152, PVP टी में 1:1000 कमजोर पड़ने का उपयोग कर - एक रेखीय वें मानक वक्र, 0.5 से लेकर के खिलाफ-20 अवरुद्ध) समाधान है जो एक रेखीय मानक वक्र उत्पादन, एस.एन. से कुल प्रोटीन का इष्टतम लोड ~ 10 μg होना चाहिए. VTA में वें की एकाग्रता से 0.4 ~ 1.0 μg प्रोटीन 4,11 प्रति एनजी वें पर्वतमाला. इस प्रकार, VTA के लिए कुल प्रोटीन लोड ~ 5 μg होना चाहिए.
  7. DAT: एस.एन. या VTA में DAT के रिश्तेदार मात्रा काफी striatum और नाभिक 4 accumbens की आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र के क्षेत्रों में हैं कि कम से कम. DAT के रिश्तेदार की अभिव्यक्ति के रूप में बरामद वें प्रोटीन सामान्य भी काफी एस.एन. और VTA में कम है. तदनुसार, प्रोटीन में एस.एन. या VTA में DAT प्रोटीन बढ़ाता के लिए लोड करने के लिए बहुत नमूना लोड करने के लिए टर्मिनल क्षेत्र क्षेत्रों की तुलना में अधिक से अधिक की जरूरत है. कुल प्रोटीन का 30 μg की एक न्यूनतम VTA में DAT मूल्यांकन में परिशुद्धता के लिए आवश्यक है और 50 μg कुल प्रोटीन का एक नाममात्र लोड एस.एन. में मूल्यांकन के लिए की जरूरत है. प्राथमिक इस्तेमाल किया एंटीबॉडी सांताक्रूज, बिल्ली # सुप्रीम कोर्ट के 1433 है.
  8. VMAT2: VMAT2 की अभिव्यक्ति, के रूप में कुल प्रोटीन सामान्यीकृत, nigrostriatal क्षेत्रों से mesoaccumbens में अधिक से अधिक है. हालांकि, वें अभिव्यक्ति के सापेक्ष, VMAT2 अभिव्यक्ति एस.एन. और 4 striatum में कम से कम में सबसे बड़ा है. सांता क्रूज़ बिल्ली सुप्रीम कोर्ट के 15,314 # नाममात्र ~ की कुल प्रोटीन लोड 40 μg VMAT2 की मात्रा का ठहराव के लिए सबसे अच्छा होगा का उपयोग करना.
  9. कुल प्रोटीन की उचित मात्रा एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर 10% acrylamide जैल पर चलाएँ. जैव रेड बहुरूपिया द्वितीय वैद्युतकणसंचलन इकाई निर्धारण, जो एक बड़ी जेल स्वरूप है के लिए प्रयोग किया जाता है. 0.45 माइक्रोन रोमकूप आकार nitrocellulose पर प्रोटीन हस्तांतरण. हस्तांतरण के लिए एक Hoeffer टैंक कम से कम 27 वोल्ट के लिए सेट हस्तांतरण रात पर जगह लेने के लिए अनुमति देता है.
  10. Blots का कम से कम 30 मिनट के लिए सूखी करने के लिए और फिर काकरेज़ी रंग एस समाधान ~ 5 मिनट के लिए (5% ग्लेशियल एसिटिक एसिड में 1% काकरेज़ी रंग एस) के साथ दाग की अनुमति दें. 0.2% एचसीएल समाधान के साथ सख्ती de-दाग़ जब तक व्यक्ति प्रोटीन बैंड स्पष्ट रूप से हल करने और पृष्ठभूमि धुंधला हटा दिया जाता है. काकरेज़ी रंग दाग की एक छवि प्राप्त करेंआईएनजी छवि जम्मू का उपयोग करने के लिए आगे प्रत्येक लेन में रिश्तेदार प्रोटीन भार यों और वें, Dat, या VMAT2 परिणाम (चित्रा 3) सामान्य.

4. ऊतक विश्लेषण: साइट - विशिष्ट वें phosphorylation

ser31 या ser40 वें की phosphorylation catecholaminergic कोशिकाओं 12 में एल DOPA जैवसंश्लेषण बढ़ा सकते हैं. हालांकि प्रत्येक एस.एन. और VTA स्थापित नहीं किया है की तरह डोपामिनर्जिक मस्तिष्क क्षेत्रों में एल DOPA जैवसंश्लेषण वृद्धि के लिए आवश्यक साइट पर phosphorylation की राशि, वहाँ सबूत है कि ser31 phosphorylation के एल DOPA 10 जैवसंश्लेषण को विनियमित करने और महंगाई भत्ते के साथ सह - भिन्न होता है में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है striatum बीच ऊतक सामग्री, नाभिक accumbens, एस.एन., और VTA 2, 10. बहरहाल, ser40 निर्धारण के शामिल किए जाने आवश्यक हैं, के रूप में कई अध्ययनों से पता चलता वें गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं, विशेष रूप से अगर phosphorylation की एक सीमा से 12 तक पहुँच जाता है.

जबकि ser19 phosphorylatiपर वें गतिविधि अकेले नहीं 13,14 प्रभावित करता है, यह 2 + निर्भर डीए न्यूरॉन में संकेतन Ca के लिए एक प्रहरी माना जा सकता है दिया, कि बाह्य 2 Ca शर्तों के 12 depolarizing तहत ser19 की phosphorylation बढ़ाने के लिए आवश्यक है. इसके अलावा, वहाँ एस.एन. और VTA 10 में केवल ser31 की phosphorylation के साथ ser19 की phosphorylation की एक महत्वपूर्ण सकारात्मक संबंध है, वाचक है कि ser19 की phosphorylation स्थिति ser31 की phosphorylation को प्रभावित कर सकता है, और इस तरह परोक्ष रूप से एल DOPA बायोसिन्थेसिस के.

नमूना साइट विशेष वें phosphorylation के stoichiometry का इष्टतम मात्रा का ठहराव के लिए लोड विचार: नीचे, साइट विच्छेदित ऊतकों में विशिष्ट वें phosphorylation की सही और सटीक निर्धारण के लिए आवश्यक विचार प्रस्तुत किया है. जब संभव हो, एक calibrated वें phosphorylation मानक नमूना वें phosphorylation के मूल्यांकन में शामिल किया जाना चाहिए. नमूना लोड एसीसी में रखना चाहिएount प्रत्येक की phosphorylation साइट पर निहित stoichiometry ताकि परख इस्तेमाल किया जा रहा है एंटीबॉडी के गतिशील सीमा के भीतर काम phosphorylation quantifies के. एक अंतिम ध्यान दें के रूप में, प्रत्येक नमूना के लिए परख में निहित कुल प्रोटीन भी मानक वक्र गलियों में लोड किया जाना चाहिए. यह आसानी से एक वाहक प्रोटीन है जो वें व्यक्त नहीं करता है (जैसे चूहा जिगर के रूप में) के साथ हासिल की है.

  1. . ser19 तीन की phosphorylation साइटों की ser19 phosphorylation के stoichiometry स्तर एस.एन. और VTA में सबसे बड़ी हैं, 0.15 से लेकर 0.25 2,10,11. अन्य विचार है कि हमारी पहचान पद्धति द्वारा, ser19 पुनश्च रेखीय श्रृंखला में 0.5 और 5.0 एनजी 10 phospho - ser19 के बीच मात्रा है. यह देखते हुए ser19 वें phosphorylation की एक विश्वसनीय उपाय प्रदान करेगा इन विचारों, 5 और 10 एनजी (2.5 एनजी नमूना से ser19 phospho इस प्रकार एक अनुमान के अनुसार 0.75 दे रही है) के बीच कुल वें प्रोटीन लोड. हम Phosphosolutions प्राथमिक हैं 1:1000 कमजोर पड़ने पर (Cat. # p1580 19) का उपयोग करें.
  2. 2,4,10,11 0.10 ser31 ser31 phosphorylation के stoichiometry स्तर एस.एन. और VTA में अपेक्षाकृत कम उनके आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र क्षेत्रों ~ 0.04 से लेकर के लिए तुलना कर रहे हैं. हमारे पता लगाने के विधि द्वारा, ser31 पुनश्च रेखीय श्रृंखला में 0.5 और 7.0 एनजी phospho - ser31 10 के बीच पता चला है. इन विचारों, 10 और 30 एनजी के बीच कुल वें प्रोटीन लोड (इस प्रकार एक अनुमान के अनुसार 0.50 दे रही है - 3.0 एनजी नमूना से phospho ser31) को देखते हुए ser31TH की phosphorylation की एक विश्वसनीय उपाय प्रदान करेगा. चित्रा 4A ser31 मात्रा का ठहराव के एक उदाहरण के लिए देखें. हमारे प्राथमिक एंटीबॉडी एक घर में एंटीबॉडी आत्मीयता शुद्ध है कि 21 वीं सदी बायोकेमिकल्स (बोस्टन, एम ए) द्वारा निर्मित किया गया था, और विशिष्टता के लिए मान्य phospho का मिलान हमारे घर में 2 मानकों का उपयोग है.
  3. ser40 एस.एन. और ~ 0.02 से VTA रेंज में ser40 की phosphorylation stoichiometry स्तर - 2,4,10,11 .06. हमारी पहचान पद्धति द्वाराer40 पी एस के बीच 0.2 और 2.0 एनजी 10 phospho - ser40 रेखीय श्रृंखला में पता चला है. इन विचारों, 10 और 30 एनजी के बीच कुल वें प्रोटीन लोड (इस प्रकार एक अनुमान के अनुसार 0.20 दे नमूना से 1.8 एनजी phospho - ser40 के) को देखते हुए ser40TH की phosphorylation की एक विश्वसनीय उपाय प्रदान करेगा. देखें आंकड़ा 4B ser40 मात्रा का ठहराव के एक उदाहरण के लिए. हम Phosphosolutions प्राथमिक (1:1000 कमजोर पड़ने पर Cat. # p1580 40) का उपयोग करें.

5. प्रतिनिधि परिणाम

  1. एस.एन. बनाम VTA में dopamine dopamine के तीन readouts चयापचयों (या) कि मात्रात्मक विश्लेषण में लिया जा सकता हैं, कुल प्रति के रूप में विच्छेदन से बरामद, प्रति, और प्रोटीन और वें प्रोटीन (striatum, एस.एन., नाभिक accumbens के लिए प्रदर्शन किया, के प्रति. नीचे एक टेबल में VTA). एस.एन. और VTA बीच में कुल डोपामाइन वसूली काफी तुलनीय है, 02:58 राज्याभिषेक टुकड़ा 2 dissections के लिए 6-9 एनजी के बीच लेकर. कुल प्रोटीन को dopamine वसूली सामान्य था दिखाएगाटी, विच्छेदन विधि पर आधारित कार्यरत, कि VTA कुल प्रोटीन के प्रति अधिक से अधिक डोपामाइन, 6-8 एस.एन. में एनजी / मिलीग्राम प्रोटीन और 9-10 एनजी / VTA 2, 4 मिलीग्राम प्रोटीन औसत. अंत में, कुल बरामद वें dopamine के सामान्य भी एस.एन. और VTA के बीच एक अंतर प्रकट करना चाहिए, 10 VTA में अधिक से अधिक किया जा रहा है, और 0.2 और 0.8 के बीच लेकर डोपामाइन दो 2,10 क्षेत्रों के बीच प्रति एनजी वें प्रोटीन एनजी.
    डीए क्षेत्र कुल डीए बरामद महंगाई भत्ते प्रति मिलीग्राम प्रोटीन महंगाई भत्ते प्रति एनजी वें
    striatum 214 ± 16 165 ± 13 0.56 ± 0.11
    एस.एन. 8.4 ± 0.8 6.1 ± 0.5 0.18 ± 0.03
    नाभिक एसीcumbens 60 ± 6 75 ± 4 0.77 ± 0.03
    VTA 6.0 ± 1.0 9.2 ± 1.4 0.22 ± 0.03
  2. कुल प्रोटीन: गु, Dat, VMAT2 कैलिब्रेटेड वें प्रोटीन मानक मात्रा का ठहराव के लिए, अधिक वें एस.एन. में विच्छेदन (60 एस.एन. में एनजी और 2 VTA में 26 एनजी) से VTA से बरामद किया है. हालांकि, जब प्रोटीन के लिए सामान्य में, इस संबंध VTA 3 ~ होने में कुल प्रोटीन प्रति वें के साथ पराजयों, 5 गुना एस.एन. में अधिक से अधिक करने के लिए, (VTA और एस.एन. में 0.09 ~ ~ प्रोटीन में 0.32 एनजी / μg) 4, 10.
    एस.एन. और VTA में DAT की उम्मीद वसूली समान VTA में थोड़ा अधिक वसूली के रूप में कुल प्रोटीन प्रति या कुल वें के अनुसार 4 बरामद साथ है. विशेष रूप से, DAT प्रोटीन के आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र के चार क्षेत्रों की तुलना में बहुत कम इन क्षेत्रों में प्रचुर मात्रा में है कुल प्रोटीन के अनुसार VMAT2 वसूली VTA बनाम 4 एस.एन. में अधिक है. हालांकि, जब वें प्रोटीन को सामान्य, 4 एस.एन. में थोड़ा अधिक से अधिक वसूली की है.
  3. साइट विशिष्ट अध्ययन का एक नंबर से वें phosphorylation, वहाँ अनुरूप परिणाम ser31 ser19 में किया गया है, और एस.एन. और VTA में ser40 की phosphorylation मात्रा, और भी आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र क्षेत्रों के संबंध में. Ser19 की phosphorylation striatum और नाभिक accumbens (0.05-0.15 ~) 2,4,7,10,11 की तुलना में विशेषकर एस.एन. और VTA (.2-0.3 ~) में अधिक से अधिक है. Phosphorylation ser31 उनके आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र क्षेत्रों के लिए एस.एन. और VTA में की तुलना में काफी कम है, जा रहा है ~ 0.06 - 0.10 इन somatodendritic 2,4,7,10,11 क्षेत्रों के बीच है. एनएसडी 1015 के साथ सुरभित एसिड decarboxylase के निषेध के दौरान, वहाँ केवल 10 VTA में एक 2 गुना ser31 की phosphorylation में वृद्धि हुई है. Ser40 0.02 और 0.05 एस.एन. में और के बीच की phosphorylation पर्वतमालाVTA और आम तौर पर इस stoichiometry काफी आत्मीय टर्मिनल क्षेत्र 2,4,7,10,11 क्षेत्रों में से अलग नहीं करता है.

चित्रा 1
चित्रा 1 एक ऊतक विच्छेदन से डोपामिनर्जिक readouts.

चित्रा 2
चित्रा 2 midbrain डोपामिनर्जिक neuropil अलग करने के लिए विच्छेदन तकनीक. Substantia nigra, उदर tegmental (VTA) क्षेत्र से (एस एन) विदारक के लिए तकनीक. 1. Overlying प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस (ऊपर छवि में इन संरचनाओं को पहले से ही हटा दिया गया है) निकालें. 2. VTA से एक ऊर्ध्वाधर एस.एन. की pigmented क्षेत्र को अलग कटौती. 3. पृष्ठीय और पार्श्व एस.एन. के अधिकांश भाग के ऊपर midline पर या निकट एक क्षैतिज कटौती करें. 4. एस.एन. brainstem के बाकी हिस्सों से दूर छेड़ो. एक बार एस.एन. हटा दिया गया है, इसी तरह VTA से दूर तंगmidbrain के बाकी. नोट: इस खंड के निर्देशांक, 5.7 एपी शीर्षस्थान के सापेक्ष में आम तौर पर मनाया जाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 2 (और अंतिम). छवि जम्मू विश्लेषण के लिए कुल प्रोटीन लोड एस काकरेज़ी रंग धुंधला के सामान्य. एस काकरेज़ी रंग चूहा substantia nigra नमूनों में कुल वें दृढ़ संकल्प के प्रोटीन धुंधला हो जाना. पहले पांच गलियों बाईं मानक कुल वें वक्र फार्म, कर रहे हैं जो चूहा जिगर homogenate से 28 μg प्रोटीन substantia nigra नमूनों से प्रोटीन लोड दर्पण जोड़ा गया है. अगले लेन वजन आणविक मार्करों (मेगावाट) शामिल हैं. शेष गलियों चूहा substantia nigra नमूनों से ~ 28μg प्रोटीन होते हैं. प्रोटीन भार के रूप में बीसीए विधि द्वारा निर्धारित प्रत्येक नमूने के प्रोटीन एकाग्रता पर आधारित हैं. हालांकि, क्या होना चाहिए बराबर भार के बावजूद, वहाँ नमूने के बीच एक मामूली का संकेत एस काकरेज़ी रंग धुंधला के अंधेरे में बदलाव कर रहे हैंपरिवर्तनशीलता में प्रोटीन सांद्रता, जो ImageJ विश्लेषण का उपयोग करने के लिए प्रत्येक नमूना के लिए एस काकरेज़ी रंग धुंधला की राशि का विश्लेषण सामान्य से सही है.

चित्रा 4
चित्रा 4 नियंत्रण और उपचार से प्रतिनिधि वें phosphorylation परिणाम है. प्रतिनिधि ser31 phosphorylated tyrosine (PTH) hydroxylase और पिछले एक अध्ययन 4 ए से ser40 PTH खारा और methamphetamine इलाज Wistar चूहों से पश्चिमी blots सेवा चूहा substantia nigra नमूनों में 31 PTH कैलिब्रेटेड सेवा PTH 31 2.0 0.3 एनजी से एनजी करने के लिए और पता लगाने के रैखिक सीमा के भीतर है मानक वक्र के बीच है. पिछले कुल वें स्तर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के आधार पर, कुल वें के 6 एनजी प्रत्येक नमूना के लिए भरी हुई थी बी. चूहा उदर tegmental नमूने में ser40 PTH कैलिब्रेटेड ser40 PTH मानक वक्र श्रृंखला 0.2 एनजी से 1.5 एनजी और पता लगाने के रैखिक सीमा के भीतर है.. पिछले कुल वें स्तर के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण के आधार पर, कुल वें के 9 एनजी प्रत्येक नमूना के लिए भरी हुई थी.

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Discussion

जैसा कि चित्र 1 में उल्लिखित है, ऊपर विस्तृत तरीकों में dopamine के कई readouts और इसके विनियमन प्रोटीन वें, Dat, और एस.एन. या VTA एक ​​नमूना से VMAT2 या तो चूहे या माउस से प्राप्त उपज चाहिए. फिर, इस प्रोटोकॉल बाहर ले जाने का लाभ कर रहे हैं कि अन्वेषक कैसे dopamine vivo में लगभग किसी भी प्रयोगात्मक प्रतिमान के तहत नियंत्रित किया जाता है और ऐसा करने में, पशुओं की संख्या में किसी भी आवश्यकता को कम करने से महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक संसाधनों को बचाने के सक्रिय मिलान readouts में प्राप्त कर सकते हैं प्रयोग.

यह बिल्कुल जरूरी है कि अन्वेषक तापमान विच्छेदन (4 डिग्री सेल्सियस), ऊतक (-70 कम से कम डिग्री सेल्सियस) के भंडारण, बहुत ठंडा HPLC बफर में ऊतक sonication (भंडारण तापमान से हटाने के बाद तत्काल sonication) के दौरान लगाए गए आवश्यकताओं का पालन और बाद में गोली गठन और प्रसंस्करण. एक बार गोली है sonicated और एसडीएस समाधान में उबला हुआ, नमूने के फुर्थ होना जारी रख सकते हैंएर कमरे के तापमान पर संसाधित. संग्रहीत HPLC का भंडारण नमूना विश्लेषण और प्रोटीन विश्लेषण के लिए नमूना बफर तैयार नमूने -80 पर होना चाहिए डिग्री सेल्सियस

फिर, इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लाभ सहज सक्रिय मैच vivo में dopamine विनियमन से संबंधित परिणाम के लिए दृष्टिकोण इसके अलावा, डोपामिनर्जिक neuropil के मार्कर (HI, Dat) के आश्वासन के एक बड़े उपाय है कि अन्वेषक है प्रदान करने dopamine ऊतक readouts सामान्य स्थिरता और सटीकता के साथ विदारक एस.एन. या VTA. लत, मानसिक विकार, और हरकत का एरेनास में डोपामाइन की भागीदारी को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल के कई प्रयोगों में नियोजित किया जा सकता है. एक उल्लेखनीय सीमा है कि वें phosphorylation के परिणामों की व्याख्या रूढ़िवादी होना चाहिए के रूप में यह इस हद तक के लिए जो ser31 या ser40 पर phosphorylation में वृद्धि करने के लिए एल DOPA बायोसिन्थेसिस वृद्धि के vivo में की आवश्यकता है समय पर नहीं जाना जाता है. हालांकि, के रूप में उल्लेख किया है, वहाँ है evidence कि ser31 phosphorylation के एल DOPA जैवसंश्लेषण को विनियमित करने के लिए प्रकट होता है और कुल 2,10 सीएनएस में डोपामाइन ऊतक सामग्री को विनियमित करने में एक भूमिका है. इस समय, वें प्रोटीन और वें phosphorylation के लिए मानकों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं. हालांकि, इस प्रयोगशाला को बनाए रखा है और विस्तार में इस्तेमाल किया जब वें vivo में phosphorylation विनियमन पर पहले कागज 11 प्रकाशित किया गया था उन पर आधारित मानकों. फिर भी, यह संभव है इन असतत इस प्रोटोकॉल का उपयोग क्षेत्रों में बरामद वें प्रोटीन dopamine के ऊतक सामग्री मानक के अनुसार.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

इस काम है, और के रूप में उद्धृत 2,10, अनुदान के लिए, भाग में एजिंग रिसर्च एडवर्ड पी. स्टाइल्स ट्रस्ट फंड और नॉर्थवेस्ट लुइसियाना के बायोमेडिकल रिसर्च फाउंडेशन के लिए अमेरिकन फेडरेशन से एक शोध अनुदान एमएफ Salvatore को पुरस्कार प्रदान किया गया द्वारा, और आइक Muslow predoctoral फैलोशिप से बी एस Pruett, LSU स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र - Shreveport.

Materials

Name Company Catalog Number Comments

HPLC system:

The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.

The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.

The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.

Pump: Shimadzu LC-10AD
Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential.
Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode.
Data Acq. System: Waters Empower Pro 2.
Injector: Waters WISP 717
Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) J.T. Baker 4095-02
Trizma Base Sigma T1503-1KG
Trizma HCl Sigma T3253-1KG
Glycerol Sigma G8773-500 mL
PVP-40 Sigma PVP40-1KG
dPBS Gibco 21600-069
Tween20 Sigma P1379-500 mL
Glycine Sigma G8898-1KG
Ponceau S Fluka 81460
Bromophenol Blue Sigma B8026-5G
Dithiothreitol Sigma D-9163
Protein Standard 2 mg BSA Sigma P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A Thermo-Fisher Scientific 23223
Precision Plus Protein Standard Bio Rad 161-0373
[125I]-protein A, specific activity Perkin-Elmer

Table 2. Specific reagents.
10% SDS 10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2) 10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution 1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L) Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L) Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution 5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L) PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L) Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g

Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.

Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.

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References

  1. Trevitt, J. T., Carlson, B. B., Nowend, K., Salamone, J. D. Substantia nigra pars reticulate is a highly potent site of action for the behavioral effects of the D1 antagonist SCH23390 in rat. Psychopharmacology. 156, 32-41 (2001).
  2. Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Spann, S. L., Dempsey, C. Aging reveals a role for nigral tyrosine hydroxylase ser31 phosphorylation in locomotor activity generation. PLoS ONE. 4, e8466 (2009).
  3. Rossato, J. L., Bevilaqua, L. R. M., Izquierdo, I., Medina, J. H., Cammarota, M. Dopamine controls persistence of long-term memory storage. Science. 325, 1017-1020 (2009).
  4. Keller, C. M., Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Guerdin, G. F., Goeders, N. E. Biphasic dopamine regulation in mesoaccumbens pathway in response to non-contigent binge and escalating methamphetamine regimens in the Wistar rat. Psychopharmacology. 215, 513-526 (2011).
  5. Lu, L., Dempsey, J., Liu, S. Y., Bossert, J. M., Shaham, Y. A single infusion of brain-derived neurotrophic factor into the ventral tegmental area induces long-lasting potentiation of cocaine seeking after withdrawal. J. Neurosci. 24, 1604-1611 (2004).
  6. Hoffer, B. J., Hoffman, A., Bowenkamp, K., Huettl, P., Hudson, J., Martin, D., Lin, L. F., Gerhardt, G. A. Glial cell line-derived neurotrophic factor reverses toxin-induced injury to midbrain dopaminergic neurons in vivo. Neurosci. Lett. 182, 107-111 (1994).
  7. Salvatore, M. F., Zhang, J. L., Large, D. M., Wilson, P. E., Gash, C. R., Thomas, T. C., Haycock, J. W., Bing, G., Stanford, J. A., Gash, D. M., Gerhardt, G. A. Striatal GDNF administration increases tyrosine hydroxylase phosphorylation in the rat striatum and substantia nigra. J. Neurochem. 90, 245-254 (2004).
  8. Lu, L., Wang, X., Wu, P., Xu, C., Zhao, M., Morales, M., Harvey, B. K., Hoffer, B. J., Shaham, Y. Role of ventral tegmental area glial cell-line derived neurotrophic factor in incubation of cocaine craving. Biol. Psychiatry. 66, 137-145 (2009).
  9. Lavicky, J., Dunn, A. J. Corticotropin-releasing factor stimulates catecholamine release in hypothalamus and prefrontal cortex in freely moving rats as assessed by microdialysis. J. Neurochem. 60, 602-612 (1993).
  10. Salvatore, M. F., Pruett, B. S. Dichotomy of tyrosine hydroxylase and dopamine regulation between somatodendritic and terminal field areas of nigrostriatal and mesoaccumbens pathways. PLoS ONE. 7, e29867 (2012).
  11. Salvatore, M. F., Garcia-Espana, A., Goldstein, M., Deutch, A. Y., Haycock, J. W. Stoichiometry of tyrosine hydroxylase phosphorylation in the nigrostriatal and mesolimbic systems in vivo: Effects of acute haloperidol and related compounds. J. Neurochem. 75, 225-232 (2000).
  12. Salvatore, M. F., Waymire, J. C., Haycock, J. W. Depolarization-stimulated catecholamine biosynthesis: involvement of protein kinases and tyrosine hydroxylase phosphorylation sites in situ. J. Neurochem. 79, 349-360 (2001).
  13. Haycock, J. W., Lew, J. Y., Garcia-Espana, A., Lee, K. Y., Harada, K., Meller, E., Goldstein, M. Role of serine-19 phosphorylation in regulating tyrosine hydroxylase studied with site- and phosphospecific antibodies and site-directed mutagenesis. J. Neurochem. 71, 1670-1675 (1998).
  14. Lindgren, N., Xu, Z. Q., Linskog, M., Herrera-Marschitz, M., Goiny, M., Haycock, J. W., Goldstein, M., Hokfelt, T., Fisone, G. Regulation of tyrosine hydroxylase activity and phosphorylation at ser19 and ser40 via activation of glutamate NMDA receptors in rat striatum. J. Neurochem. 74, 2470-2477 (2000).

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तंत्रिका विज्ञान में 66 अंक चिकित्सा फिजियोलॉजी मध्यमस्तिष्क substantia nigra कि उदर tegmental क्षेत्र tyrosine hydroxylase phosphorylation nigrostriatal mesoaccumbens dopamine ट्रांसपोर्टर
Substantia nigra और ventral Tegmental क्षेत्र के में Dopamine विनियमन के व्यापक रूपरेखा
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Salvatore, M. F., Pruett, B. S.,… More

Salvatore, M. F., Pruett, B. S., Dempsey, C., Fields, V. Comprehensive Profiling of Dopamine Regulation in Substantia Nigra and Ventral Tegmental Area. J. Vis. Exp. (66), e4171, doi:10.3791/4171 (2012).

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