Omfattande Profilering av dopamin förordning i substantia nigra och ventrala tegmentumområdet

Summary

Dopamin distinkt regleras i mitthjärnan kärnor, som innehåller cellkropparna och dendriter av dopaminneuroner. Här beskriver vi ett dissektion och prov-hantering strategi för att maximera resultat och därmed slutsatser och insikter, om dopamin reglering i mitthjärnan kärnor av substantia nigra (SN) och ventrala tegmentumområdet (VTA) hos gnagare.

Abstract

Dopamin är en kraftigt studerades neurotransmittorn i CNS. I själva verket har dess inblandning i rörelseaktivitet och belöning-beteende främjas fem decennier av undersökning av molekylära brister som är förknippade med dopamin reglering. Majoriteten av dessa undersökningar av dopamin reglering i hjärnan fokus på den molekylära grunden för dess reglering i de regioner terminala området för nigrostriatala och mesoaccumbens vägar, striatum och nucleus accumbens. Dessutom har sådana studier koncentrerat sig på analys av dopamin vävnad innehåll med normalisering att endast våt vävnad vikt. Undersökningen av de proteiner som reglerar dopamin, såsom tyrosinhydroxylas (TH)-protein, TH fosforylering, dopamintransportören (DAT), och vesikulärt monoamintransporterfunktionen 2 (VMAT2) proteinet ofta innefattar inte analys av dopamin vävnadshalt i samma prov. Förmågan att analysera både dopamin vävnad innehåll och dess reglerar proteiner (inklusive post-translational ändringar) ger inte bara inneboende kraft att tolka förhållandet mellan dopamin med proteinet nivån och funktion TH, DAT eller VMAT2, men sträcker sig även prov ekonomi. Detta leder till mindre kostnad, och ändå producerar insikter i molekylära regleringen av dopamin i praktiskt taget alla paradigm av utredarnas val.

Vi fokuserar analyserna i mitthjärnan. Även om SN och VTA normalt försummas i de flesta studier av dopamin förordning skall dessa kärnor enkelt dissekerade med praktik. En omfattande utläsning av dopamin vävnadshalt och TH, DAT, eller VMAT2 kan utföras. Det finns spirande litteratur om effekterna av dopamin funktion i SN och VTA på beteende och impingements av exogena ämnen eller processer sjukdom däri ^1-5. Dessutom föreningar såsom tillväxtfaktorer har en djupgående effekt på dopamin och dopamin-reglerande proteiner, till en jämförelsevis större utsträckning i SN och VTA

Vi kommer att illustrera dissektionen tekniken att avskilja dessa två kärnor och provet bearbetning av de dissekerade vävnad som producerar en profil avslöjar molekylära mekanismer av dopamin reglering in vivo, specifika för varje kärnor (figur 1).

Protocol

1. Dissektion

1. På en bädd av våt-is, kyla en matris gnagare hjärnan (koronära sektioner åtskilda 1 mm från varandra), en Petriskål innehållande 5 rakhyvlar, och en # 11 skalpell. I en separat behållare, betecknad plats 2 ml rör storlek mikrofugrör i torr is.
2. Utredaren ska välja den metod för dödshjälp. Vi har reproducerbara resultat som bedriver en mycket kort anestesi med isofluran, Helst bör en förångare användas. Men om inte finns, använder vi ett stort batteri burk som innehåller en plattform. Med batteriet burken som ligger i en godkänd ventilation huven, placera en isofluran mättad kompress under plattformen och vänta 3-5 minuter så att isofluran för att mätta batteriet burken. Placera råttan insidan och ta bort för halshuggning så snart råttan har förlorat medvetandet. Snabbt bort hjärnan (helst på mindre än två minuter), skölj under kallt vatten och placera omedelbart i det kylda gnagare hjärnan matris.
3. En minut efter positionning hjärnan in i matrisen genom att sätta kalla rakblad in i den kylda hjärnan, med början omkring 2 mm rostralt till optiken chiasm om striatum och nucleus accumbens önskas för analys utöver mitthjärnan kärnor. Fortsätt sätta kalla rakblad med vardera 1 mm avsnitt tills anländer halvvägs genom pons, vacklande placeringen av varje efterföljande rakblad för att underlätta lättare borttagning av varje enskild blad.
4. Då drar ut rakhyvlar, leta efter starten av hippocampus. När den fullständigt har lindats runt mitthjärnan, börjar ta bildytor med # 11 skalpell, såsom illustreras i figur 2.
5. Placera omedelbart dissekerade vävnaden i den nedkylda mikrofugrör på torris. Hos råtta räknar med att kunna dissekera SN och VTA från ett minimum av två koronala skivor och högst tre. Lagra vävnader vid -80 ° C tills för bearbetning.

2. Vävnad Analys: HPLC feller dopamin och metaboliter

För fullständig information om HPLC-utrustning och underhåll, se HPLC-analys vid slutet av manuskriptet.

1. Försiktigt homogenisera vävnaden omedelbart efter avlägsnande från torr-is med användning av iskall 0,1 M _{HCIO4-EDTA-lösning} (0,1 _M HCIO4 & 0,1 mM EDTA) ^9, som innehåller N-metyl dopamin vid en koncentration av 20 ng / ml, som fungerar som en inre standard för återvinning av provet under HPLC-analys. Homogenisatorn vi använder är en Branson Sonifier 150, med inställningen till 10% av full effekt (1 av 10). Följande sonikering volymer rekommenderas:
   I råtta, SN = 250 ^ (ensidig dissektion), 400 fil (bilateral dissektion), VTA = 200 ^ (ensidig dissektion), 400 fil (bilateral dissektion).
   I mus (bilaterala dissektioner endast), SN = 200 ^, VTA = 200 pl.
2. Efter homogenisering, innehålla samplar på torr is. Proven centrifugeringseffektuged (DuPont Sorvall mikrorotationskolonn 24S) vid 12.000 varv per minut för att sedimentera det protein pelleten som skall användas för Western blot-analyser. Supernatanterna injicerades direkt i HPLC. Följande injektionsvolymer rekommenderas för exakt analys i råtta eller mus: (. Från antingen prep) SN = 150 (. Från antingen prep), VTA = 160 xl
3. Lagerstandardlösningen beredes vid 1 mg / ml genom att tillsätta en lämplig mängd av monoaminer och metaboliter * av dopamin komponent till 0,1 M perklorsyra 0,1 mM EDTA. Koncentrationen av varje förening är 1 mg / ml förutom tryptofan som är 5 mg / ml. Lagerstandardlösningen är indelad i 10 | il alikvoter och lagrades i ultralåg tills de behövdes.
   * Alla vikter är korrigerade för saltformen av föreningen i tillämpliga fall.
   Framställ arbetsstandarden genom spädning en 10 ul alikvot av standardlösningen till 100 ml av perklorsyralösning. Koncentrationen av arbetsstandard är 0,1 | ig / ml förutom tryptofan som är 0,5 | ig / ml. 50 pl avDetta arbetsstandarden injiceras i HPLC för ett on-kolonn mängd av 5 ng av varje komponent förutom tryptofan som är 25 ng.
4. Fastställande av dopamin återhämtningen inom provalikvoten:
   Det finns flera steg som är involverade för att bestämma dopamin återhämtning från ett provalikvoten.
5. Först delas dopamin topphöjd av provet av dopamin topphöjden för den standard och multiplicera detta förhållande genom att den totala mängden (ng) av dopamin i standarden. Vår standard dopamin koncentrationen är 0,1 ng / l och 50 pl standard analyseras. Sålunda är mängden dopamin i standarden 5 ng. Således kan ekvationen nedan användas för att bestämma dopamin återhämtningen i ett givet prov:
   (Dopamin topphöjden i provet / dopamin topphöjd i standard) * 5 ng
6. Korrigering för förlust av prov med hjälp av intern standard N-metyl dopamin:
   Den faktiska återvinningen av N-metyl dopamin beräknas på samma sätt som dopamin genom att dividera N-metyl-dopamin topphöjd i provet genom att N-metyl dopamin topphöjd av standarden och multiplicera detta förhållande genom att den totala mängden (ng) av N-metyl dopamin i standarden. Liksom dopamin är vår standard N-metyl dopamin koncentration 0,1 ng / fil. 50 | il av standarden analyseras. Sålunda är mängden av N-metyl dopamin i standarden 5 ng. Sålunda kan ekvationen nedan användas för att bestämma N-metyl dopamin återvinning i ett givet prov:
   (N-metyl dopamin topphöjd i provet / N-metyl dopamin topphöjd i standard) * 5 ng
   Eftersom N-metyl-dopamin i varje prov kommer inte från själva provet utan från HPLC bufferten, är mängden av N-metyl-dopamin förväntas i varje prov beräknas. N-metyl dopaminkoncentrationen i HPLC-buffert är 20 ng / ml eller 0,02 ng / | il, så att det förväntade mängden av N-metyl dopamin i varje prov erhålles genom att multiplicera den N-metyl dopaminkoncentrationen i HPLC-buffert av alikvot volym av varje prov som används för HPLC-analys. Detta visas i nedanstående ekvation:
   (0,02 ng / ^ il) * (alikvot volym av prov som används för HPLC-analys)
7. Skillnaden mellan den förväntade och återvunnen N-metyl dopamin kan sedan användas för att korrigera för mängden dopamin utvanns genom justering av någon provförlust. Ta bara förhållandet mellan förväntade N-metyl dopamin / återhämtade N-metyl dopamin och multiplicera detta genom återkrävda belopp av dopamin. Således är den totala ekvationen för mängden dopamin i en provalikvot som ges nedan:
   (Dopamin topphöjd i provet / dopamin topphöjd i standard) * (N-metyl dopamin topphöjd i standard / N-metyl dopamin topphöjd i provet) * (0,02 ng / ^ il) * (alikvot volym av prov som används för HPLC-analys )
8. Totalt dopamin återhämtat sig från ett prov:
   Värdet av dopamin utvinnas från en provalikvot används sedan för att extrapolera den totala mängden dopamin i ett givet prov. Detta görs genom att dividera den återvunna mängd (ng) of DA av alikvot volym och multiplicera detta värde med den totala volymen av HPLC-buffert som provet sonikerades i. Detta ges av följande ekvation:
   (Mängd (ng) av dopamin i provalikvoten / volym provalikvoten) * (Total volym av HPLC-buffert, i vilken provet sonikerades).
   Läsaren hänvisas till följande studier ^2,4,10 för en omfattande presentation av bedömningen av dopamin och metaboliter i samband med avläsning från dopamin-reglerande proteiner i inte bara SN och VTA, men striatum och nucleus accumbens också.

3. Tissue Analys: Totalt Protein och slutliga Normalisering av TH och DAT resultat

1. Placera de utfällda protein pellets (som härrör från HPLC-bufferten behandlingen) till krossad is för att bibehålla 4 ° C. Se till att all buffert har tagits bort och arkiveras (om bekräftande analys krävs). Om SN eller VTA ska behandlas bilateralt (råtta endast), tillsätt 300 pl (SN) eller 200 | il (VTA) av 1% SDS innehållande 5 mM Tris (pH 8,3) och 1 mM EDTA till pelleten och sonikat. Tillsätt 150 pl av SDS-lösning till SN pellets eller 100 il till VTA pellets om behandling vävnad från ensidiga dissektioner.
2. Placera proverna i nära kokande vatten under cirka 5 minuter för att fullborda proteindenaturering och låt svalna till rumstemperatur. Se lock hålls fast i detta steg.
3. Bestämma proteinkoncentrationen i proven med användning av BCA-analysen, innefattande ett protein standardkurva (albumin-standard) intervallet från 2 till 40 | ig protein. Analys 5 il volym av provet i tre exemplar och använda medianvärdet för att fastställa protein mängden mot standardkurvan. Dividera med den analysvolymen för proteinkoncentration. Observera att detta är den första av två åtgärder som vidtagits för att normalisera totalt TH, DAT och VMAT2 resultat totalprotein återhämtning.
4. Bereda proverna med provbuffert (innehållande ditiotreitol) för reducerande SDS-elektrofores på 10% akrylamid gELS. Helst ska den slutliga totala proteinkoncentrationen vara ~ 2 ng / il. Anledningen till denna koncentration kan väljas för att minska provets volym som behövs för den slutliga bestämningen av TH-fosforylering, som ~ 100 ng av totalt protein kommer att vara nödvändigt för lastning att exakt kvantifiera ser31 och ser40 TH fosforylering. Om gul färg ses i provet efter att ha lagt provbuffert är provet för sur. Tillsätt 1 M Tris (pH 8,2) i 10 | il delmängder tills blåa färgen är återställd.
5. Bereda proverna på följande sätt för följande bestämningar av dopamin-reglerande proteiner:
6. TH: Mot en kalibrerad standard för TH protein (som ng), koncentrationen av TH (enligt ng TH per total g protein) i SN väntas variera från ~ 0,05-0,27 ng TH per ug totalt protein ^{2,4, 7,10,11.} Mot en linjär TH standardkurva, allt från 0,5 till 5,0 ng TH och använda primära antikropp mot TH (Millipore cat # AB152, 1:1000 utspädning i PVP T-20 Blockeringslösning) som alstrar en linjär standardkurva, bör den optimala belastningen av totalt protein från SN vara ~ 10 | ig. Koncentrationen av TH i VTA varierar från ~ 0,4 till 1,0 ng TH per g protein ^4,11. Därför bör den totala protein belastning för VTA vara ~ 5 mikrogram.
7. DAT: De relativa mängderna av DAT i SN och VTA är betydligt mindre än i de besläktade områdena terminal fält i striatum och nucleus accumbens ^4. Den relativa uttrycket av DAT som normaliseras till återvunna TH protein är också betydligt lägre i SN och VTA. Därför protein belastningar för kvantifiering av DAT protein i SN eller VTA måste vara mycket större än prov massor av de terminala fältet regionerna. Minst 30 ng totalt protein behövs för precision i DAT bedömning VTA och en nominell belastning på 50 g totalt protein finns behov av bedömningen i SN. Den använda primära antikroppen är Santa Cruz, kat # sc-1433.
8. VMAT2: Expression av VMAT2, Som normaliserades till totalt protein, är större i de mesoaccumbens än nigrostriatala regioner. Men, i förhållande till TH uttryck är VMAT2 uttryck störst i SN och minst i striatum ^4. Med Santa Cruz cat # sc-15.314, en nominell total protein belastning på ~ 40 mikrogram vara bäst för kvantifiering av VMAT2.
9. Köra den lämpliga mängden av totalt protein med användning av SDS-PAGE på 10% akrylamid-geler. Av Bio-Rad Protean II elektroforesenhet används för bestämningar, som är en stor format med gelplatta. Överföra proteiner på 0,45 | im porstorlek nitrocellulosa. För överföringen, som en Hoeffer tank till minst 27 volt tillåter överföring skall ske över en natt.
10. Tillåta blottarna att torka under minst 30 minuter och därefter färgas med Ponceau S-lösning (1% Ponceau S i 5% isättika) under cirka 5 minuter. De-fläcken kraftigt med 0,2% HCl lösning tills individuella proteinbanden tydligt att lösa och bakgrund färgning tas bort. Skaffa en bild av Ponceau S fläckenIng använda Image J för att ytterligare kvantifiera relativa protein laster i varje spår och normalisera TH, DAT eller VMAT2 resultat (Figur 3).

4. Tissue Analys: Platsspecifik TH fosforylering

Fosforyleringen av TH på ser31 eller ser40 kan öka L-DOPA biosyntes i katekolaminerga celler ^12. Även mängden av fosforylering vid varje ställe som är nödvändigt för att öka L-DOPA biosyntes i dopaminerga hjärnan regioner som SN och VTA är inte fastställd, finns det bevis för att ser31 fosforylering spelar en viktig roll i regleringen av L-DOPA biosyntes ¹⁰ och samvarierar med DA vävnadshalt bland striatum, nucleus accumbens, Sn och VTA ^{2, 10.} Icke desto mindre inkludera ser40 bestämningar är nödvändigt, eftersom ett flertal studier visar att det kan påverka TH-aktiviteten, i synnerhet om en tröskel på fosforylering uppnås ^12.

Medan ser19 phosphorylatipå inte påverkar TH-aktiviteten enbart ^13,14, kan det anses en sentinel för ^{Ca2 +-beroende} signalering i DA neuron, med tanke på att extracellulärt Ca ^{2 +} är nödvändigt att öka ser19 fosforylering enligt depolariserande betingelser ^12. Dessutom finns det en signifikant positiv korrelation mellan ser19 fosforylering med ser31 fosforylering endast i SN och VTA ^10, vilket innebär att ser19 fosforylering status kan påverka ser31 fosforylering, och därmed indirekt L-DOPA biosyntes.

Exempel på last överväganden för optimal kvantifiering av platsspecifika TH fosforylering stökiometri: Nedan är de överväganden som krävs för noggranna och exakta bestämningar av platsspecifika TH fosforylering i dissekerade vävnader presenteras. När det är möjligt, bör en kalibrerad TH fosforylering standard ingå i bedömningen av prov TH fosforylering. Provet belastningen måste ta hänsyn enlount inneboende stökiometri på varje fosforylering plats så att analysen kvantifierar fosforyleringen inom det dynamiska arbetsområde av antikroppen som används. Som en sista anmärkning, bör den inneboende totala protein som kommer in i analysen för varje prov också laddas i standardkurvan körfält. Detta uppnås enkelt med ett bärarprotein (t ex råttlever) som inte uttrycker TH.

1. . ser19 Av de tre fosforyleringsställena, ser19 fosforylering stökiometri nivåer är störst i SN och VTA, allt från 0,15 till 0,25 ^2,10,11. Den andra faktor är att genom vår detektionsmetod är ser19 ps kvantifieras i linjära intervallet mellan 0,5 och 5,0 ng fosfor-ser19 ^10. Mot bakgrund av dessa överväganden totalt TH protein belastning mellan 5 och 10 ng (vilket ger en uppskattad 0,75 till 2,5 ng fosfor-ser19 från provet) skulle ge ett tillförlitligt mått på ser19 TH fosforylering. Vi använder Phosphosolutions primära (katalognummer P1580-19) vid 1:1000 spädning.
2. . ser31 ser31 fosforylering stökiometri nivåer är jämförelsevis mindre i SN och VTA jämfört med deras besläktade terminal fältet regioner, allt från ~ 0,04 till 0,10 ^2,4,10,11. Genom vår detektionsmetod är ser31 ps upptäcks i linjära intervallet mellan 0,5 och 7,0 ng fosfor-ser31 ^10. Mot bakgrund av dessa överväganden totalt TH protein belastning på mellan 10 och 30 ng (vilket ger en uppskattad 0,50 till 3,0 ng fosfor-ser31 från provet) skulle ge ett tillförlitligt mått på ser31TH fosforylering. Se figur 4A för ett exempel på ser31 kvantifiering. Vår primära antikropp är en in-house affinitetsrenade antikropp som är tillverkad av 21 Biochemicals ^talet (Boston, MA) och valideras för specificitet av fosfor-epitopen använda våra interna standarder ^2.
3. ser40 ser40 fosforylering stökiometri nivåer i SN och VTA intervallet från ~ 0,02 -. ,06 ^2,4,10,11. Genom vår detektionsmetod, ser40 ps detekteras i linjära området mellan 0,2 och 2,0 ng fosfo-ser40 ^10. Mot bakgrund av dessa överväganden totalt TH protein belastning på mellan 10 och 30 ng (vilket ger en uppskattad 0,20 till 1,8 ng fosfor-ser40 från provet) skulle ge ett tillförlitligt mått på ser40TH fosforylering. Se figur 4B visas ett exempel på ser40 kvantifiering. Vi använder Phosphosolutions primära (katalognummer P1580-40) vid 1:1000 spädning.

5. Representativa resultat

1. Dopamin i SN jämfört med VTA Det finns tre avläsningar av dopamin (eller metaboliter) som kan vidtas i kvantitativ analys,. Per total återhämtat sig från dissekering, per protein, och per TH protein (visats för striatum, SN, nucleus accumbens och VTA i tabell 1 nedan). Totalt dopamin återhämtning mellan SN och VTA är ganska jämförbara, mellan 6-9 ng i två till tre koronala skiva dissektioner ^2. Normalisera dopamin återhämtning totalprotein visar that, baserat på den dissekeringsmetod används, att VTA kommer att ha större dopamin per totalt protein, i genomsnitt 6-8 ng / mg protein i SN och 9-10 ng / mg protein i VTA ^{2, 4.} Slutligen bör en normalisering av dopamin till totalt återvunna TH visar också en skillnad mellan SN och VTA, är större i VTA ¹⁰ och sträcker sig mellan 0,2 och 0,8 ng dopamin per ng ​​TH protein mellan de två regionerna ^2,10.

   DA-regionen	Totalt utvanns DA	DA per mg protein	DA per ng ​​TH
   striatum	214 ± 16	165 ± 13	0,56 ± 0,11
   SN	8,4 ± 0,8	6,1 ± 0,5	0,18 ± 0,03
   Kärna accumbens	60 ± 6	75 ± 4	0,77 ± 0,03
   VTA	6,0 ± 1,0	9,2 ± 1,4	0,22 ± 0,03

2. Totalt proteiner: TH, DAT, VMAT2 Använda den kalibrerade standarden TH protein för kvantifiering, är mer TH återvinns i SN än VTA från dissektionen (60 ng i SN och 26 ng i VTA ^2). Men när normaliserat till protein, vänder detta förhållande, med TH per total protein i VTA är ~ 3 - till 5-faldigt högre än i SN (~ 0,32 ng / g protein i VTA och ~ 0,09 i SN) ^{4, 10.}
   Den förväntade återhämtningen av DAT i SN och VTA är liknande, med något mer återhämtning i VTA per totalprotein eller per total TH återhämtat ^4. Noterbart är DAT protein mycket mindre förekommande i dessa regioner jämfört med de besläktade terminala fältet regioner ⁴ VMAT2 återvinning som per total protein är större i VTA jämfört SN ^4. Emellertid, vid normalisering till TH protein finns det något större återhämtning i SN ^4.
3. Platsspecifik TH fosforylering Från ett antal studier, har det varit konsekventa resultat i ser19, ser31 och ser40 fosforylering mängd i SN och VTA, och även i förhållande till de besläktade områdena terminalen fält. Ser19 fosforylering är särskilt större i SN och VTA (~ 0,2-0,3) jämfört med striatum och nucleus accumbens (~ 0,05-0,15) ^2,4,7,10,11. Ser31 fosforylering är betydligt mindre i SN och VTA jämfört med deras besläktade terminal fältet regioner, som är ~ 0,06 till 0,10 mellan dessa somatodendritiska regioner ^2,4,7,10,11. Under inhibering av aromatisk syra med NSD-1015, finns det en 2-faldig ökning i ser31 fosforylering i VTA endast ^10. Ser40 fosforylering varierar mellan 0,02 och 0,05 i SN ochVTA och i allmänhet den här stökiometri inte skiljer sig väsentligt från de besläktade områdena terminalen fält ^2,4,7,10,11.

Figur 1. Dopaminerga avläsning från en vävnad dissektion.

Figur 2. Dissection Teknik för att isolera mellanhjärnan dopaminerga neuropil. Tekniken för att dissekera substantia nigra (SN) från ventrala tegmentala området (VTA). 1. Ta bort överliggande cortex och hippocampus (dessa strukturer har redan tagits bort i ovanstående bild). 2. Gör ett vertikalt snitt skiljer det pigmenterade området för SN från VTA. 3. Göra en horisontell skärning vid eller nära mittlinjen precis ovanför den dorsala och den laterala större delen av SN. 4. Reta SN bort från resten av hjärnstammen. När väl SN har tagits bort, på samma sätt reta VTA bort frånResten av mitthjärnan. Obs: Detta avsnitt är typiskt observeras vid koordinater i förhållande till bregma, på AP 5,7.

Figur 3. Andra (och sista) normalisering av totalt protein last-Ponceau S färgning för Image J analys. Ponceau S proteinfärgning av totalt TH beslutsamhet i råtta substantia nigra prover. De första fem banorna bilda vänster är standard totala TH kurva, som 28 g protein från råttleverhomogenat lades för att spegla proteinet belastningen från substantia nigra proverna. Nästa bana innehåller molekylvikt (MW) markörer. De återstående banorna innehåller ~ 28μg protein från råtta substantia nigra prover. De protein-belastningar är baserade på proteinkoncentrationen för varje prov som bestämdes med BCA-metoden. Trots vad som borde vara lika laster, det finns variationer i mörker Ponceau S färgning mellan proven indikerar en lättvariabiliteten i proteinkoncentrationer, som är korrigerade för genom normalisering med ImageJ analys för att analysera mängden av Ponceau S-färgning för varje prov.

Figur 4. Representativa TH fosforylering resultat från kontroller och behandlingar. Representant ser31 fosforylerad tyrosin hydroxylas (PTH) och ser40 PTH Western blot från saltlösning och metamfetamin behandlade Wistarråttor från en tidigare studie ^4. A. Ser 31 PTH i råtta substantia nigra prover. De kalibrerade tjäns 31 PTH standardkurvprover varierar från 0,3 ng till 2,0 ng och är inom det linjära området för detektion. Baserat på tidigare Western blot-analys av totala TH nivåer var 6 ng av totalt TH laddad för varje prov. B. ser40 PTH i råtta ventrala tegmentala prover. De kalibrerade ser40 PTH standardkurvprover varierar från 0,2 ng till 1,5 ng och är inom det linjära området för detektion. Baserat på tidigare Western blot-analys av totala TH nivåer, var 9 ng av den totala TH lastas för varje prov.

Discussion

Som visas i figur 1, bör de metoder som beskrivs ovan ger flera avläsningar av dopamin och dess reglering proteiner TH, DAT, och VMAT2 från ett urval av Sn eller VTA erhålls från antingen råtta eller mus. Återigen, fördelarna med att genomföra detta protokoll är att utredaren kan få operativt-matchade avläsning av hur dopamin regleras in vivo under praktiskt taget alla experimentella paradigm och därigenom spara stora experimentella resurser genom att minska antalet djur som krävs i varje experiment.

Det är absolut nödvändigt att utredaren följa temperatur krav under dissektionen (4 ° C), lagring av vävnad (minst -70 ° C), vävnad ultraljudsbehandling (omedelbar ultraljudsbehandling efter uttaget ur lagret temperatur) i iskall HPLC buffert och efterföljande pelletbildning och bearbetning. När väl pelleten sonikeras och kokades i SDS-lösning, kan proverna fortfarande FurthER bearbetas vid rumstemperatur. Lagring av arkiverad HPLC analyserat provet och provet buffert som framställts prover för protein analys bör vara -80 ° C.

Återigen är den stora fördelen av protokollet den inneboende inställning till operativt-matchresultat avseende dopamin reglering in vivo. Dessutom normalisering dopamin vävnad avläsning av markörer för dopaminerg neuropil (TH, DAT) ger ett stort mått av säkerhet att utredaren är dissekera SN eller VTA med konsekvens och exakthet. Med tanke på inblandning av dopamin i missbruk, psykisk sjukdom och arenor motoriskt, kunde detta protokoll användas i många experiment. Ett anmärkningsvärt begränsning är att tolkningen av resultaten TH fosforylering ska vara försiktig, eftersom det inte är känt vid denna tidpunkt i vilken utsträckning en ökning av fosforylering vid ser31 eller ser40 krävs vivo för att öka L-DOPA biosyntes. Men, som nämnts, finns det evidence att ser31 fosforylering visas för att reglera L-DOPA-biosyntes och har en roll vid reglering av den totala halten dopamin vävnad i centrala nervsystemet ^2,10. Vid denna tidpunkt standarder för TH-protein och TH-fosforylering inte är kommersiellt tillgängliga. Har dock detta laboratorium upprätthållas och fördjupas sådana normer som bygger på dem som används när det första dokumentet om TH fosforylering reglering in vivo publicerades ^11. Ändå är det möjligt att normalisera dopamin vävnaden innehåll återvinns TH proteinet i dessa skilda områden som använder detta protokoll.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC system:
The basic system consists of a Shimadzu LC10-ADvp HPLC pump, a Waters WISP 717 automatic sample injector, a 250 X 4.4 mm 5 micron Spherosorb ODS-1 C18 reverse-phase column (Waters), a Bioanalytical Systems (BAS) TL12 dual glassy carbon electrode, two BAS LC4B electrochemical detectors, and a Waters Empower 2 data collection and integration system.
The column is maintained at 30-45 °C (BAS LC22A column heater). The mobile phase is 0.1 M sodium phosphate (pH 3.0), 0.1 mM EDTA, 0.2-0.4 mM 1-Octane Sulfonic Acid (Eastman-Kodak), and 0.35% acetonitrile (v/v), filtered through a 0.45 micron filter. Flow rate is of 1.2 ml/min. Four liter batches of mobile phase are optimized for separations by adjusting the pH, Octane Sulfonic Acid and column temperature. The mobile phase is recycled, and is continuously purged with helium gas to remove dissolved oxygen. Recycling of the mobile phase is almost essential to maintain good resolution for a reasonable period of time. The mobile phase shelf-life is maintained by using a flow switch (controlled by the integrator) to divert to waste the first 2-7 min of each run.
The electrodes are maintained at potentials of approximately 0.78 and 0.95V with respect to a Ag/AgC1 reference electrode. The electrode at the higher potential is used exclusively for the determination of tryptophan (and the NMDA internal standard). The 0.78 V potential provides a superior signal to noise ratio for detection of the monoamines and compounds, other than tryptophan. The chromatograms are stored on the hard drive of the Empower workstation, and subsequently processed and the data transferred directly into an Excel spreadsheet for computation of metabolite amounts and compilation of group data.
Pump: Shimadzu LC-10AD Cell: BAS Cross Flow. Glassy carbon working electrode at 0.780 and 0.950 V potential. Detector: BAS LC-4B operated in dual channel mode. Data Acq. System: Waters Empower Pro 2. Injector: Waters WISP 717 Column: Waters Spherosorb ODS-1, 5 μM particle, 4.4 mm X 250 mm.
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)	J.T. Baker	4095-02
Trizma Base	Sigma	T1503-1KG
Trizma HCl	Sigma	T3253-1KG
Glycerol	Sigma	G8773-500 mL
PVP-40	Sigma	PVP40-1KG
dPBS	Gibco	21600-069
Tween20	Sigma	P1379-500 mL
Glycine	Sigma	G8898-1KG
Ponceau S	Fluka	81460
Bromophenol Blue	Sigma	B8026-5G
Dithiothreitol	Sigma	D-9163
Protein Standard 2 mg BSA	Sigma	P5619-25VL
Pierce BCA Protein Assay Reagent A	Thermo-Fisher Scientific	23223
Precision Plus Protein Standard	Bio Rad	161-0373
[125I]-protein A, specific activity	Perkin-Elmer
Table 2. Specific reagents.
10% SDS			10 g SDS, 100 mL DI H20
1% SDS (pH to 8.2)			10 mL 10%SDS 60.5 mg Trizma Base 37.22 mg EDTA 90 mL DI H20
Copper II Sulfate Solution			1 g Copper II sulfate 25 mL DI H20
3X Sample Buffer			Trizma Base 2.27 g SDS 6 g Dithiothreitol 0.463 g Glycerol 30 g Bromophenol Blue 10 mg D I H20 (initially add above reagents to 40 mL of H20 in a graduated cylinder; then add H20 until volume reaches 100 mL) HCl (add as needed to reach pH of 6.85) Freeze solution in 50 2.0 mL tubes. (makes 100 mL): Volume of 3X Sample Buffer needed = ½ volume of SDS used in sample.
1X Sample Buffer			Dilute 3X Sample Buffer down to 1X sample buffer using DI H20
10X Running Buffer (Makes 4 L)			Trizma Base 121.1 g Glycine 577 g SDS 40 g
10X Transfer Buffer: (Makes 4 L)			Glycine 360 g Trizma Base 96 g
Ponceau			Ponceau S. 0.5 g Acetic Acid 5 mL DI H20 95 mL
.2% HCl Solution			5.2 mL HCl in 500mL of DI H20
PVP-T20 Blocking Soln. (Makes 4 L)			PVP-40 40 g dPBS 38.2 g Tween20 2 g Thimerisol 0.4 g 1M Tris pH 7.6 (60.6 g Tris HCl + 13.9 g Tris Base in 500 mL DI H20)- 50 mL
10X Blot Buffer (Makes 4 L)			Tween 20 20 g Tris Base 14 g Tris HCl 61 g
Table 3. Protein Assay and Western Blotting Formulas.
Tyrosine hydroxylase standards: The calibrated TH protein and phosphorylation standards used by this laboratory are derived from PC12 cell extracts, which were analyzed for TH protein content and phosphorylation stoichiometries against a previously calibrated TH standards that ultimately originated from the laboratory of Dr. John Haycock 11.