Summary
يمكن معالجة السقالات Electrospun مرحلة ما بعد الانتاج لتطبيقات هندسة الأنسجة. نحن هنا وصف أساليب الغزل السقالات المعقدة (من خلال الدوران على التوالي)، لجعل سمكا السقالات (بواسطة متعددة الطبقات باستخدام الحرارة أو الصلب بخار)، لتحقيق عقم (الإنتاج العقيم أو التعقيم مرحلة ما بعد الإنتاج)، وخصائص النشاط الحيوي لتحقيق مناسب.
Abstract
Electrospinning هو وسيلة شائعة الاستخدام وتنوعا لإنتاج السقالات (القابلة للتحلل في كثير من الأحيان) لهندسة الأنسجة 3D. 1، 2، 3 العديد من الأنسجة في الجسم الحي الخضوع لانتفاخ ذو محورين بدرجات متفاوتة مثل الجلد، الكلمة، والمثانة والحوض حتى الحنك الصلب والأطفال تنمو. في إنتاج السقالات لهذه الأغراض هناك حاجة لتطوير السقالات من خصائص النشاط الحيوي المناسب (سواء كانت تتحقق من دون أو مع الخلايا) والتي تكون معقمة للاستعمال السريري. التركيز في هذه الورقة ليست هي الطريقة لوضع معايير electrospinning الأساسية (كما أن هناك دراسات واسعة النطاق في electrospinning)، ولكن حول كيفية تعديل نسج مرحلة ما بعد الإنتاج السقالات لجعلها صالحة للأغراض هندسة الأنسجة - هنا سماكة، الخواص الميكانيكية والتعقيم (مطلوب ل الاستخدام السريري) وتعتبر ونحن وصف أيضا كيف يمكن زرعها الخلايا على السقالات وتعرض للسلالة ذو محورين إلى حالة منهم لتطبيقات محددة.
Electrospinning يميل الى انتاج صفائح رقيقة، وجامع electrospinning يصبح المغلفة مع عزل الألياف يصبح موصل الفقراء من هذا القبيل أن الألياف لم تعد الودائع على ذلك. وبالتالي نحن تصف النهج لإنتاج الهياكل سمكا بواسطة الحرارة أو البخار الصلب زيادة قوة السقالات ولكن ليس بالضرورة مرونة. يوصف أيضا الغزل متتابعة من السقالات من البوليمرات المختلفة لتحقيق السقالات المعقدة. يمكن أن يؤثر سلبا على منهجيات تعقيم قوة ومرونة من السقالات. قارنا ثلاث طرق لآثارها على خصائص النشاط الحيوي على السقالات electrospun من حامض اللبنيك، شارك في الجليكوليك بولي (PLGA).
يوصف التصوير من الخلايا في السقالات وتقييم إنتاج البروتينات خارج الخلية (ECM) مصفوفة من الخلايا في السقالات. ويمكن زراعة الخلايا في المختبر على السقالات سقالة تحسين قوة ومرونة ولكن النسيج literatu الهندسةإعادة يدل على أن الخلايا غالبا ما تفشل لانتاج ECM المناسبة عند تربيتها في ظروف ثابتة. هناك بعض النظم التجارية المتاحة التي تسمح واحد لخلايا الثقافة على السقالات في ظل أنظمة تكييف ديناميكي - مثال واحد هو Electroforce بوس 3100 والتي يمكن استخدامها لممارسة برنامج تكييف على الخلايا في السقالات التي عقدت باستخدام قبضة الميكانيكية داخل وسائل الإعلام غرفة مليئة 4 يوصف هذا النهج إلى ثقافة مفاعل حيوي ميزانية خلية لتشويه للرقابة في 2 الأبعاد. نظهر أن يمكن تحريض الخلايا لإنتاج الإيلاستين في ظل هذه الظروف. أخيرا وصفت تقييم خصائص النشاط الحيوي من السقالات المجهزة تربيتها مع أو من دون الخلايا.
Protocol
1. Electrospinning للألياف عشوائي والانحياز
Electrospinning بإنشاء شبكات ليفية غرامة باستخدام الجهد الكهربائي لرسم حل البوليمر نحو جامع للأرض. ويمكن أن تكون جامعي في كثير من الأشكال للغاية ويمكن أن تكون ثابتة أو، وهو الأكثر شيوعا الدورية. يتبخر المذيب قبل حل يصل إلى جامع، وطائرة يتصلب في الألياف.
كل البوليمر تتطلب مجموعتها الخاصة من الشروط لإنتاج نوع معين من الألياف. تركيز البوليمر، والمذيبات، والمسافة بين الحل ضخ واختبأ في جامع، وفرق الجهد بين البلدين، وسرعة الدورية للجامع، وتدفق معدل درجة الحرارة، والرطوبة تؤثر على جميع electrospinning. هناك العديد من الدراسات التي تصف مجموعة من electrospinning المعلمات وكيف يمكن لهذه تأثير على السقالات المنتجة (مثل قطر الألياف، والتشكل، والتوجه). 5، 6، 7، 8في هذه التجارب ونسج السقالات بناء على الشروط المحددة في دراساتنا السابقة. 2 و 9
الطرق التالية هي مناسبة لإنتاج السقالات electrospun من PLGA، حامض اللبنيك بولي (جيش التحرير الشعبى الصينى)، وبولي ε-caprolactone (PCL) وبولي البيتاهيدروكسي-CO-hydroxyvalerate (PHBV) باستخدام أحد هواة جمع الدورية كما هو موضح في الشكل رقم 1. في جميع أنحاء ثنائي كلورو ميثان مذيب (DCM) يستخدم. الأسلوب هنا تنتج PLGA microfibrous، جيش التحرير الشعبى الصينى و PCL وnanofibrous سقالة PHBV مع حبات صغيرة الحجم ('عقد من اللؤلؤ "مورفولوجيا).
- معطف. دوار جامع مغزل مع رقائق الألومنيوم، مع الجانب المصقول / لامعة التي تواجه الخارج وكان لدينا مغزل 20 سم و 10 سم في القطر.
- تحضير البوليمر الحلول؛ مصنوعة جيش التحرير الشعبى الصينى، PCL وPHBV على خط النار في حل 10٪ من وزن في DCM. يرصد PLGA على خط النار في حل 20٪ من وزن في DCM.
- 4 مكان الحقن من حجم 5 مل على ضخ حقنة. يتم تحميل المحاقن إلى جontain 5 مل من البوليمر كل، وإعطاء 20 مل في المجموع.
- لجيش التحرير الشعبى الصينى، PCL وPHBV استخدام معدل تدفق قدره 40 μLmin -1 في حقنة.
- لPLGA استخدام معدل تدفق من -1 μLmin 30 في حقنة.
- لجيش التحرير الشعبى الصينى، PCL وPLGA استخدام مسافة العمل من 17 سم من رأس الإبرة إلى مغزل.
- لPHBV استخدام مسافة العمل من 10 سم من رأس الإبرة إلى مغزل.
- توجيه الاتهام الى إبر المحاقن إلى الخامس +17000 (73030 ف، Genvolt، شروبشاير، المملكة المتحدة) وelectrospin من مسافة مناسبة على مغزل رقائق الألومنيوم المطلي.
- للألياف عشوائية تدوير مغزل ب 200 دورة في الدقيقة.
- للألياف الانحياز تدوير مغزل في 1000 دورة في الدقيقة.
- ويمكن تخزين السقالات على رقائق الألومنيوم في ظل ظروف الجفاف. التخزين الموصى بها هي في وعاء مغلق في درجة مئوية 4 في وجود المجففة. في تجربتنا السقالات تبقى مستقرة مدة لا تقل عن 4 أشهر (ربما أكثر بكثير) في ظل هذه الظروف (نحن لسنا على علم بأي بوblished دراسات حول ظروف التخزين طويل الأجل للالسقالات).
2. إنتاج السقالات مجمع بواسطة غزل متسلسل
الغزل تسلسلي يوفر طريقة للجمع بين خصائص المواد المختلفة لخلق المواد التي لديها افضل من كل من العقارات. PHBV تنتج، كثيفة شقة، في حين جيش التحرير الشعبى الصينى ورقة هشة أو الغزل PCL تنتج صفائح مرنة منخفضة الكثافة. كلا مواد دعم مرفق الخلية. الغزل على التوالي هذه النتائج المواد في غشاء الخلية كتيم الكثيفة التي هي مرنة.
- إعداد تلاعب electrospinning حسب المادة 1، مع ظروف PHBV الغزل.
- Electrospin PHBV على النحو الوارد أعلاه.
- دون تغيير رقائق الألومنيوم، electrospin البوليمر الثاني على قمة باستخدام المعلمات والظروف الطبيعية لهذا البوليمر (على سبيل المثال 17 سم إلى حشد إبرة، 17000 V، 200 دورة في الدقيقة لجيش التحرير الشعبى الصينى). هذه العملية مضافة تتراكم طبقة مزدوجة من سقالة انتاج طبقة ثنائية.
3. إنتاج السقالات متعدد الطبقات بواسطة التخمير عدة طبقات معا
- ويمكن السقالات متعددة الطبقات من خلال استخدام حرارة الصلب. للقيام بذلك ورقة 4 من PLGA يتم وضعها على رأس كل منهما الآخر ثم حراريا مطوع على 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
- ويمكن أيضا أن السقالات مطوع بواسطة بخار الصلب. توضع ورقة من هنا 4 PLGA على رأس كل منهما الآخر وعلقت 2 سم فوق بركة من DCM (10 مل) لمدة 1 ساعة. يتم تنفيذ هذا في وعاء مغلق في درجة حرارة الغرفة.
4. العقيم إنتاج وتعقيم بعد الإنتاج من السقالات Electrospun
- لا يمكن أن يتحقق العقيم سقالة الانتاج electrospinning في بيئة معقمة من تدفق رقائقي غطاء محرك السيارة داخل بيئة غرفة نظيفة. للقيام يمكن أن تستخدم هذه البوليمرات العقيمة إما من الصف الطبية البوليمرات أو تعقيمها بواسطة حضانة في DCM. حل مرة واحدة، وelectrospun البوليمرات على احباط معقم ملفوفة حول مثلterilised مغزل. ثم يتم التعامل مع السقالات جو معقم و مطهر. يتم التحقق من عقم بواسطة احتضان عينات من سقالة في وسائل الاعلام نمو مضاد حيوي خالية لفترة مناسبة.
- لتطهير الإيثانول (وهذا هو الاستخدام تجريبيا لكنها ليست منهجية معترف بها من التعقيم التي يمكن اتخاذها لالعيادة) يتم وضعها السقالات لفترة وجيزة (15 دقيقة) في حل V / V 70 في المئة من الايثانول في الماء المقطر. لأغراض تجريبية عملي هذا وعادة ما يكفي لتطهير السقالات بحيث يمكن بعد ذلك يمكن الجمع بين بنجاح مع الخلايا المستزرعة.
- لالبيروكسي السقالات تعقيم حامض مغمورة في حامض البيروكسي (0.1٪ V / V في الفوسفات مخزنة المالحة (بى بى سى)) وحضنت لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة كما هو موضح في سليم وآخرون. 9
- لجاما والمشع السقالات تعقيم مع جرعة من 3 كيلو جراى باستخدام مصدر السيزيوم كما هو موضح في سليم وآخرون. 9
5. النشاط الحيوي اختبار السقالات
- يتم قطع السقالات في المستطيلات 5 مم × 20 مم، وتقاس سماكة للباستخدام ميكرومتر، ووضعها في صك بوس Electroforce 3100. هذا الجهاز يطبق قوة من 0-22 N يصل الى تشريد 6MM والمؤامرات الحمل مقابل تشريد كما منحنى الإجهاد / سلالة. هذا يسمح حساب معامل للشباب ومرونة.
6. تصور للخلايا على السقالات وتقييم إنتاج ECM
ويمكن ملطخة الخلايا مع الأصباغ الفلورية الحيوية التي تسمح لأحد أن يرى الخلايا على السقالات لأنها تعلق، تهاجر وتتكاثر. يمكن للثقافة آخر يحدد وجود الخلايا في السقالات التي تلطيخ لنوى الخلايا مع 4 '،6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (دابي). ويمكن تقييم انتاج ECM بواسطة الخلايا على منصة الاعدام من قبل تلطيخ خلايا لمجموعة من البروتينات ECM الإيلاستين بما في ذلك كما هو موضح في هذا المثال. وتم قياس كل السقالات المستخدمة لديهاسمك لا يقل عن 0.2 ملم وتقطع إلى مربعات 1.5 سم × 1.5 سم قبل البذر.
في هذه الدراسات تستخدم الخلايا الليفية الجلدية الإنسان في جميع أنحاء بسبب الدور الذي تلعبه في اعادة اعمار الأنسجة اللينة التي هي مصلحة لدينا مختبر للبحوث الأساسية.
ويتم الحصول على الخلايا من عينات الجلد من المرضى الذين يخضعون للجراحة اختيارية للحد من الثدي أو البطن (أعطيت الموافقة على أنسجتهم لاستخدامها لأغراض البحث العلمي). يتم جمع الأنسجة واستخدام مجهول تحت الأنسجة بحوث البنك رخصة 12179. تغسل الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني مع الستربتومايسين (0.1 ملغ / مل)، والبنسلين (100 وحدة دولية / مل)، والأمفوتريسين B (0.5 ميكروغرام / مل). يتم تحضين عينات الأنسجة في 0.1 التربسين ث / V٪ و 0.1٪ جلوكوز في برنامج تلفزيوني (12-18 ساعة، 4 درجات مئوية). ومقشر الأدمة قبالة، مفروم ناعما وحضنت مع 10 مل من كولاجيناز (0.5٪ وزن / حجم في DMEM و 10٪ FCS، 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة). الطرد المركزي للsuspens الخلية الناتجةايون (400 جرام لمدة 10 دقيقة)، وتنتج بيليه من الخلايا التي يمكن زرعها وsubcultured في DMEM تستكمل مع مصل العجل الجنين (FCS، 10٪ V / V)، ستربتوميسين (0.1 ملغ / مل)، البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، والأمفوتريسين B (0.5 ميكروغرام / مل). وتستخدم الخلايا الليفية فقط من مرور 4-9 في التجارب.
- وبذرت الليفية الجلدية الإنسان، متموجة مرة واحدة في T75 (EasyFlask، نونك، نيويورك، الولايات المتحدة) وذلك بإضافة التربسين / EDTA (5 مل، 5 ملغ / مل التربسين، 2 ملغ / مل EDTA في المياه المالحة)، احتضان لمدة 5 دقائق في 37 درجة مئوية. يتم طرد توقف لمدة 10 دقائق (150 غرام). ومعلق الخلايا في 5 مل من DMEM (تستكمل مع FCS (10٪ V / V)، ستربتوميسين (0.1 ملغ / مل)، البنسلين (100 وحدة دولية / مل) وباء الامفوتريسين (0.5 ميكروغرام / مل)) وعدها باستخدام ويتم تعديل haemocytometer، والتركيز على للبذار. والمصنف عادة في الخلايا 50000 خلية لكل جيد.
- إذا كان ذلك مطلوبا، وذلك قبل البذر الخلايا على السقالة، لا يمكن أن تكون الخلايا ما قبل العلامات باستخدام CellTracker الأحمر أو الأخضر. الخليةتغسل s مع 3 × PBS 5 مل. هناك حل من CellTracker 10 ملم في درجة مئوية المصل مجانا، يضاف الخلية المناسبة، متوسطة (10 مل)، ويتم تحضين الخلايا لمدة 45 دقيقة في 37 بعد الحضانة، ويتم غسل الخلايا في 3 × 5 التالية PBS مل التي بذرها على السقالات. بعد هذا ولا يمكن تصوير سطح السقالات في مجهر ImageExpress أكسون (الأجهزة الجزيئية، سانيفيل، الولايات المتحدة) في λex نانومتر 570-620 λem نانومتر (CellTracker الأحمر) و 480 نانومتر λex - 533 نانومتر λem (CellTracker الخضراء). للتحقيق في اختراق الخلايا في عمق السقالات ويمكن استخدام المجهر multiphoton مبائر. وهذا يمكن تحقيق اختراق نحو 200 ميكرون في معظم السقالات مع أو من دون الخلايا.
- يتم إصلاح عينات ثقافة المشاركة في الفورمالديهايد 1 مل 3.7٪ في برنامج تلفزيوني في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة ويغسل ثم مع 3 × PBS 1 مل.
- تضاف 200 ميكرولتر من أضداد الإيلاستين الأولية إلى كل عينة (5٪ V / V في برنامج تلفزيوني، ELAS أرنب ألفا المضادة للبشريةوالقصدير، وAbDserotec، كيدلينغتون، المملكة المتحدة) وحضنت على 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تغسل العينات مع 3 × PBS 1 مل وحضنت ثم في حل من الأجسام المضادة الثانوية (0.5٪ V / V الماعز المضادة للأرنب مفتش (FC): FITC) في برنامج تلفزيوني المحتوية دابي (1 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة.
- بعد هذا يتم غسل العينات مع 3 × PBS 1 مل.
- والتقط ثم دابي وعينات الجسم المضاد الثانوي الملون على مجهر ImageExpress أكسون فلوري، 365 λex نانومتر - 460 نانومتر لλem دابي و 480 λex نانومتر - 533 نانومتر λem للأجسام المضادة الثانوية. البقع دابي نوى ويسمح احد لمعرفة توزيع الخلايا داخل الألياف بسهولة جدا.
7. تعريض الخلايا في السقالات لتكييف ديناميكي ذو محورين
لدراسة تأثير تكييف الحيوية على إنتاج ECM الليفية طورنا بسيط إثبات صحة مفهوم مفاعل حيوي لاستكشاف هذه.
- جمع البالونات وتدفقجهاز تنظيم وإعداد النظام بحيث يمكن وضعها بسهولة داخل وعاء معقم مناسبة لزراعة الخلايا، بمجرد والمغلفة.
- الأوتوكلاف الجهاز بما في ذلك بالون (122 درجة مئوية، 220 ميللي بار لمدة 1 ساعة). يمكننا أن نؤكد أن البالونات جهاز الأوتوكليف قيد الحياة دون أن يؤثر سلبا وظيفتها من خلال تضخيم وبتأطيرها مرارا وتكرارا.
- في غرفة نظيفة، فك الجهاز في غطاء محرك السيارة تدفق الصفحي في وضع يمكنها من أن تكون على electrospun.
- نفخ البالون لمساحة المطلوبة (تذكر البالون ما زال يحتاج إلى تدخل في وعاء الثقافة) مع الفوسفات مخزنة المالحة، وربط برنامج تلفزيوني على الأرض الكهربائي عند نقطة في الجهاز التي لا تحتاج إلى أن تكون عقيمة في أنبوب فرع ( 3 في اتجاه والحنفية).
- Electrospin البوليمر المطلوبة على البالون باستخدام الغزل الظروف العادية، وذلك باستخدام مسافة العمل من 10 سم. السماح للسقالة لتجف لمدة 1 ساعة. في "الرطب" الألياف "لزجة" بما فيه الكفاية على الانضمام إلى الأمواجالآس البالون دون فصل في وقت لاحق.
- وضع بالون داخل وعاء معقم ونقله إلى غطاء محرك السيارة تدفق رقائقي مناسبة لزراعة الخلايا.
- إزالة البالون من السفينة ومكان على سطح معقم (طبق بتري) وبشكل متكرر (كل 20 ثانية) ماصة تعليق خلية (1 × 10 6 خلايا في 5 مل من DMEM) على منطاد المغلفة لمدة 20 دقيقة في محاولة لتوزيع خلايا بالتساوي على السطح.
- وضع البالون في الإناء والثقافة، وإضافة ما قبل وسائل الاعلام حرارة مناسبة لنوع من الخلايا.
- توصيل جهاز التضخم إلى ضخ حقنة (كينت العلمية، جيني زائد، كونيتيكت، الولايات المتحدة)، وتضخيم / فرغ البالون كما هو مطلوب لإعطاء انتفاخ ذو محورين. ويمكن استخدام جهاز الكمبيوتر مضخة محقنة تسيطر عليها لتحقيق نظام انتفاخ أكثر تعقيدا.
8. ممثل النتائج
الأرقام التالية هي نتائج ممثل ما يمكن توقعهإذا ما اتبعت الطرق المذكورة أعلاه.
يمكن استخدامها لإنشاء السقالات Electrospinning مع أبنية عشوائية وأمر (الشكل 1)، وهذا هو تكرار والألياف تكون موحدة. ويمكن electrospun العديد من أنواع البوليمرات ذات الخصائص التي يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا كما هو مبين في الشكل رقم 2 لPHBV، جيش التحرير الشعبى الصينى أو PCL. يمكن Electrospinning إنتاج السقالات رقيق ضوء أو أغشية الخلايا الكثيفة التي لا يمكن اختراقها (انظر الشكل 3). جميع السقالات هو موضح هنا سهلت مرفق خلية والانتشار. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن الخلايا يمكن أن ينتقل من خلال هذه الاطر ما يصل الى عمق لا يقل عن 500-600 ميكرون 9 لجيش التحرير الشعبى الصينى قطر الألياف المتوسط هو 3 ميكرون؛. لPHBV فمن 0.3μm مع اللؤلؤ تتراوح 5-20 ميكرون، ل PCL هو 3 ميكرومتر، وبالنسبة للPLGA هو 11 ميكرون. الدراسات الأخرى التي تستخدم أنظمة المذيبات الأخرى تفيد بأن PHBV يمكن أن يكون electrospun كما ألياف بدون حبات اللؤلؤ أو البوليمر. 10،11
<ف الطبقة = "jove_content"> إذا كانت مطلوبة أكثر سمكا السقالات البخار ويمكن استخدام الحرارة الصلب ليصلب طبقات من السقالات معا (انظر الشكل 4). هذه الطبقات سقالة لا delaminate ويمكن أن يكون من الصعب جدا العثور على مفترق الطرق بين الطبقات.نعرض التي يمكن تقديمها أغشية طبقة ثنائية الخلايا حيث يمكن لكل ألف وباء يمكن تربيتها على غشاء منفصلة بدون اختلاط كما هو موضح في الشكل 5. هنا علينا أن نبرهن ذلك عن طريق استخدام الخلايا الليفية الجلدية الملونة الإنسان مع اثنين من مختلف فلوري الأصباغ تعقب الخلية. ومن شأن مثل هذا الغشاء طبقة ثنائية أن تكون مفيدة عند زراعة الخلايا لتشكيل الأنسجة الصلبة مثل العظام أو الغضاريف على جانب واحد فصل من الخلايا مصمم لتشكيل لينة (وعادة ما تكون أسرع نموا) الأنسجة في الجانب الآخر مثل إصلاح الحنك أو اللثة التجميلية جراحة. 12 و 13
فيما يتعلق بتأثير التعقيم في electrospun السقالات لديناذكرت سابقا أن الأسلوب من آثار التعقيم على خلية ثقافة سقالة واللاحقة. 9 ويتضح هذا في الشكل (6) مما يدل على آثار للحمض البيروكسي، أشعة جاما والايثانول على قطر الألياف والنهائي الشد ومعامل يونج من على سقالة PLGA .
أشعة جاما لا يوجد لديه تأثير كبير على قطر الألياف في حين حامض البيروكسي والايثانول تقلل القطر من الألياف بمقدار 50٪ تقريبا. فيما يتعلق في نهاية المطاف قوة الشد تتغير كل أساليب التعقيم وقوة الشد في نهاية المطاف، ومرونة من السقالات. ثقافة من الخلايا في هذه الاطر خفض مزيد من التوتر الشد في نهاية المطاف، ولكن زيادة مرونة.
أخيرا، ويقدم وسيلة لاختبار تأثير انتفاخ ذو محورين الحيوية على الخلايا المستزرعة على السقالات electrospun. هذا النهج إثبات صحة مفهوم يدل على أن الخلايا لا تزال قابلة للحياة خلال ديناميكيةانتفاخ ولكن أيضا إنتاج كميات متزايدة من الإيلاستين في ظل هذه الظروف. هذا يتناقض بشكل واضح لعدم وجود الإيلاستين عندما يتم الحفاظ على نفس الخلايا على منصة الاعدام نفسه في ظل ظروف ثابت (انظر الشكل 7).
الشكل 1. يظهر رسم كاريكاتوري للتلاعب electrospinning وللغزل من ألياف العشوائية ومتوازية وبعد ذلك طبقات من الألياف وضعت فوق بعضها البعض. يمكن أن تنشأ ألياف عمودي electrospinning بواسطة مجموعة من الألياف الانحياز على رقائق الألومنيوم، تناوب احباط من قبل 90 درجة ثم electrospinning على الفور مجموعة ثانية من الألياف الانحياز على رأس هذه.
الشكل 2. يبين مورفولوجية الحصير electrospun عشوائية من (A) لجيش التحرير الشعبى (مقياس شريط هو 100 ميكرون)، (B) PHBV (مقياس شريط هو 100 ميكرون)، (C) PCL (شريط المقياس 100 ميكرون) و (D) PLGA شريط النطاق (على بعد 200 ميكرون). لاحظ أن جيش التحرير الشعبى الصينى، PCL وPLGA كلها السقالات microfibrous موحدة. ونسج PHBV بأنها "عقد من اللؤلؤ، مع ألياف النانو التي تربط 5-20 حبات الحجم ميكرون. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل 3. إنتاج سقالة متعدد الطبقات. هنا يتم نسج البداية السقالات باستخدام PHBV ومن ثم يتم استخدام الحقن مليئة جيش التحرير الشعبى الصينى أو PCL. ونسج على رأس هذه السقالة PHBV. هذا الرقم يدل على ظهور هذه السقالات متعدد الطبقات، (أ) طبقة PHBV واحدة، (ب) وقطاع عريض من طبقة ثنائية PHBV، جيش التحرير الشعبى الصينى، والتي تبين nanofibrous كثيفة، "عقد من اللؤلؤ" PHBV طبقة (يسار) وجيش التحرير الشعبى الصينى اكثر انفتاحا microfibrous طبقة (يمين) و (ج) وجيش التحرير الشعبى الصينى طبقة واحدة.ناغورني كاراباخ "> انقر هنا لعرض أكبر شخصية.
يمكن أن تنتج الشكل 4. أثخن السقالات بواسطة الحرارة الصلب والصلب بخار. (أ) و (ب) تبين من خلال قسم سقالة بخار صلب جيش التحرير الشعبى الصينى حيث تم وضع الاطر ليفي الأولي من حوالي 150 ميكرون معا، ويستخدم ثنائي كلورو ميثان البخار لجعل السقالات سمكا بكثير من ما يصل الى 500 ميكرون. في (ج) و (D) يمكن للمرء أن يرى أن سقالة يتكون من طبقات من ألياف أكثر سماكة تتخللها طبقات من ألياف أرق التي أنشأتها حرارة الصلب طبقات من ألياف رقيقة وسميكة معا. ويمكن استخدام هذه الطريقة لإنتاج السقالات من الخواص الميكانيكية المعقدة. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .
فاي جوري 5. ظهور الخلايا على سقالة طبقة ثنائية. في جميع الحالات خلايا موجودة الليفية الجلدية الإنسان. (أ) الخلايا الليفية في جيش التحرير الشعبى الصينى electrospun حيث يتم إصلاح الخلايا وملطخة دابي. (ب) الخلايا دابي الملون على PHBV. في (ج) والخلايا الليفية هي مرحلة ما قبل الملون مع صبغة حيوية، أخضر CellTracker، ويمكنك ان ترى ظهور لهم على الجانب جيش التحرير الشعبى الصينى من طبقة ثنائية. (د) وقسم من خلال طبقة ثنائية مع الليفية ملون أحمر على السطح السفلي PHBV والخلايا الليفية ملون أخضر على السطح العلوي جيش التحرير الشعبى الصينى. (E) الخلايا الليفية قبل الملون باللون الأحمر CellTracker نمت على السطح PHBV. استخدام الأصباغ الفلورية حيوي يوفر منهجية ملائمة للنظر في توزيع الخلايا على سقالة في حين أن الخلايا لا تزال تنمو. يمكن للمرء أن يستخدم بصورة روتينية هذه الأصباغ ما لا يقل عن 7 أيام. ومع ذلك يصبح تضعف من تركيز صبغة مثل انقسام الخلايا. الحانات نطاق تساوي 0.1 ملم.g6.jpg "ALT =" الشكل (6) "/>
الشكل (6). ويتم الحصول على الخصائص الحركية الحيوية من سقالة electrospun باستخدام جهاز مقياس التوتر السطحي Electroforce بوس (A). السقالات تعقيمها (B) الإجهاد / سلالة منحنيات PLGA بواسطة أشعة جاما، والكحول، حامض البيروكسي، أو أنتجت جو معقم و مطهر. ويمكن الحصول على ثلاثة قياسات من الرسم البياني من هذا القبيل: الضغط الشد القصوى (UTS) الذي يمكن أن يتعرض لها من الألياف قبل وقوعه، من سلالة الشد نهاية المطاف، ومعامل ليونغ. هذا الأخير يعطي مؤشرا على مرونة من السقالة. (ج) وتأثير كل طريقة التعقيم على قطر الألياف PLGA في ميكرون. انخفضت كل منهجية تعقيم UTS. كلا حامض البيروكسي وأشعة جاما على تخفيض معامل يونغ يعطي سقالة أكثر مرونة، والكحول يجعل من سقالة هش للغاية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .الشكل 7. وهذا الرقم يدل على استخدام بالون بسيط لتوفير مفاعل حيوي ذو محورين الذي يمكن أن يتعرض السقالات (والخلايا المتزايد داخل السقالات) إلى انتفاخ ذو محورين لفترات من الزمن. (أ) على منطاد بددت التي أودعت electrospun الألياف، PHBV،. في هذه المرحلة وتغطي جزئيا البالون مع الألياف. (ب) بالون مغلفة تماما مع PHBV والألياف جيش التحرير الشعبى الصينى. (ج) pipetted مرارا وتعليق خلية على البالون. (D) ويتم استخدام البالون وضعت داخل زجاجة من وسائل الاعلام عقيمة حيث يتم توصيل البالون لمضخة محقنة وبرنامج تلفزيوني (كما تستخدم من مكونات إجراء) لتضخيم بلطف، والسماح للانكماش البالون ضد جدول زمني مبرمج. (E) خلايا في السقالات التي يجري إزالتها من بالون في نهاية التجربة والتحليل الذي أجري لبقاء الخلية هو مبين في (واو) حيث تطوير خلايا قابلة للحياة الى اللون الازرق الداكن باستخدام دائرة الهجرة والجنسية الأيضicator 3 - (4،5-dimethylthiazol-2-يل) -2،5-diphenyltetrazolium بروميد. (G) يدل على ان خلايا (الأزرق) مثقف على هذا البالون وتخضع لانتفاخ ذو محورين تطوير ألياف الإيلاستين (الأخضر، الملون باستخدام الاجسام المضادة الإيلاستين محددة)، في حين أن الخلايا نفسها على سقالة متطابقة (H) تربيتها تحت ظروف ثابتة لها لا تذكر إنتاج الإيلاستين . الحانات نطاق تساوي 0،025 ملم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning هو تقنية شعبية جدا لإنتاج السقالات لهندسة الأنسجة. 14، 15، 16 في حين أنه من السهل نسبيا لإنتاج السقالات electrospun الأساسية لاستخدام هذه التقنية التجريبية هي أيضا معقدة ومتعددة الأوجه مع العديد من المتغيرات. 6 هناك العديد من الدراسات التي تصف كيف يمكن لل electrospinning المعلمات تحديد إنتاج سقالة. في هذه الدراسة يتم التركيز على إنتاج كبير آخر التحديات التي تجعل من السقالات المعمارية المناسبة والخواص الميكانيكية وتشجيع الخلايا داخلها لصنع البروتينات خارج الخلية لتحقيق تناسب النسيج للزرع في رجل.
هدفنا في هذه المقالة لوصف أساليب لتزويد القراء لتصميم وتوصيف السقالات لمجموعة واسعة من الأغراض. في هذه المقالة وصفنا منهجيات لجعل السقالات تعقيدا وأكثر سمكا، وتعقيم السقالات للاستخدام التجريبية والسريرية. وصفنا أيضا التصوير جells على السقالات وتحريض إنتاج ألياف الإيلاستين عن طريق إخضاع الخلايا لانتفاخ ذو محورين.
ويمكن تحقيق العديد من الميزات المطلوبة من السقالات مرحلة ما بعد الإنتاج (مثل الصلب عدة طبقات) والتعقيم. ومع ذلك فإن هذه بدورها تؤثر في الخواص الميكانيكية للالسقالات. نحن التقرير أن منهجيات تعقيم جميع تميل إلى تغيير في نهاية المطاف قوة الشد ومعامل يونغ للبدرجات متفاوتة. وتشير دراسة حديثة من مجموعتنا مقارنة أشعة جاما، وحامض البيروكسي والايثانول لآثارها كما نظم تعقيم المحتملة لالسقالات PLGA يمكن تجنبها (9) الآثار السلبية لتقنيات التعقيم من خلال إنتاج السقالات تحت ظروف معقمة -. هذا الأخير يتطلب استخدام غرف الأبحاث . ويمكن للمستخدمين مختلف تحديد منهجيات مختلفة ولكن كل وينبغي أن تكون على علم بأن المنهجيات التعقيم الحالية سوف يؤثر سلبا على خصائص السقالات.
C ulture من الخلايا في السقالات يؤثر أيضا على خصائص السقالات 'الميكانيكية. ويمكن استخدام الاستقراء الإنتاج ECM بإخضاع الخلايا على السقالات لانتفاخ ذو محورين يؤثر على الخواص الميكانيكية.
ويفهم بسهولة ومنهجية من الغزل إلى سقالة على أخرى لجعل غشاء طبقة ثنائية، ونحن تصف السقالات طبقة ثنائية قادرة على دعم اثنين من السكان متنوعة من الخلايا هو موضح في هذه الورقة ما قبل وضع العلامات الخلايا مع اثنين من الحيوية الأصباغ تعقب الخلية. واستخدمت هذه لتوضيح أن غشاء طبقة ثنائية حققت هدفها المعلن.
أخيرا يمكن أن تستخدم للتلاعب ميزانية انتفاخ ذو محورين وصفها في هذه الدراسة إلى تقديم مجموعة من الأنظمة. ويمكن دوري، الخطي، والأنظمة العشوائية برمجتها بسهولة وتطبيقها. وهذا التنوع يسمح الاستفادة من نظام للعديد من المشاكل التي تواجهها في هندسة الأنسجة، مثل الشق الحلقي، قاع الحوض والمثانة والجلد.
"> في نسيج الأدب الهندسة تم الإبلاغ عن استخدام نظم الاختبار ذو محورين للخلايا زراعة على السقالات. 4 ولكن لم نتمكن من العثور على أي الكتابات المنشورة كيفية التعامل مع الأنسجة الرخوة تستجيب لانتفاخ ذو محورين. هذا النهج بسيط يدل على أن الخلايا تستجيب ل انتفاخ ذو محورين مع إنتاج الإيلاستين - عنصرا رئيسيا من عناصر المصفوفة خارج الخلية التي تعطي مرونة الأنسجة الرخوة نكص وهذا يعطي مؤشرا واضحا لكيفية تكييف الأنسجة الناعمة لأنها تنمو في المختبر يوفر طريقا لإنتاج أنسجة ملائمة لزرع للمناطق الجسم حيث أنسجة الأم لديها مرونة جوهرية، وهذا هو أحد المجالات التي سوف بوضوح مزيد من التطوير يمكن تستحق من نسيج المجتمع الهندسية والشركات المصنعة مفاعل حيوي.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر BBSRC لتمويل على درجة الدكتوراه عن اللقاء السيد فريزر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
