Summary
Electrospun stilladser kan bearbejdes post produktion til vævsdyrkningsapplikationer. Her beskriver vi metoder til spinding komplekse stilladser (af på hinanden følgende spinding), for at gøre tykkere stilladser (ved multi-lag ved hjælp af varme eller damp udglødning), for at opnå sterilitet (aseptisk produktion eller sterilisering post produktion), og for at opnå passende biomekaniske egenskaber.
Abstract
Electrospinning er en almindeligt anvendt og alsidig fremgangsmåde til fremstilling af stilladser, ofte bionedbrydelige) til 3D vævsmanipulering. 1, 2, 3 Mange væv in vivo underkastes biaksial udspiling i forskelligt omfang, såsom hud, blære, bækkenbunden og selv den hårde gane som børn vokse. At producere stilladser til disse formål er der behov for at udvikle scaffolds passende biomekaniske egenskaber (enten opnås med eller uden celler) og som er sterile til klinisk anvendelse. Fokus i dette papir er ikke sådan til at etablere grundlæggende electrospinning parametre (da der er omfattende litteratur om electrospinning), men på hvordan man kan ændre spundet stilladser post produktion for at gøre dem egnede til vævsopbygning formål - her tykkelse, mekaniske egenskaber og sterilisering (kræves til klinisk brug) anses for at være, og vi også beskrive, hvordan cellerne kan dyrkes på stilladser og udsat for biaksial belastning at betingelse dem til specifikke applikationer.
Electrospinning tendens til at producere tynde plader, som electrospinning kollektoren bliver belagt med isolerende fibre bliver en dårlig leder, således at fibrene ikke længere aflejring på den. Derfor beskriver vi fremgangsmåder til at fremstille tykkere strukturer ved hjælp af varme eller damp annealing øge styrken af stilladser, men ikke nødvendigvis elasticitet. Sekventielle spinding af stilladser af forskellige polymerer for at opnå komplekse scaffolds er også beskrevet. Sterilisering metoder kan påvirke styrke og elasticitet af stilladser. Vi sammenligner tre metoder til deres virkninger på de biomekaniske egenskaber på electrospun scaffolds poly mælkesyre-co-glycolsyre (PLGA).
Billeddannelse af celler på stilladserne og vurdering af produktionen af ekstracellulære matrix (ECM)-proteiner fra celler på stilladserne er beskrevet. Dyrkning af celler på stilladserne in vitro kan forbedre stillads styrke og elasticitet, men vævsmanipulering literature viser, at celler ofte ikke at frembringe passende ECM når den dyrkes under statiske betingelser. Der er få kommercielle systemer tilgængelige, som tillader en at dyrke celler på stilladserne under dynamiske conditioning regimer. - Et eksempel er Bose ElectroForce 3100, som kan anvendes til at udøve en konditionering program på celler i stilladser holdt ved anvendelse af mekaniske styr inden for et medie fyldt kammer 4 En tilgang til et budget cellekultur bioreaktor for kontrolleret forvrængning i 2 dimensioner er beskrevet. Vi viser, at celler kan induceres til at producere elastin under disse betingelser. Endelig vurdering af biomekaniske egenskaber af forarbejdede scaffolds dyrket med eller uden celler er beskrevet.
Protocol
1. Electrospinning af tilfældige og Aligned Fibre
Electrospinning skaber fine fiber-netværk ved hjælp af elektriske potentiale til at trække en polymer løsning på vej mod en jordet kollektor. Samlere kan være i mange former og kan være statisk eller, mere almindeligt, at rotere. Opløsningsmidlet fordamper, før opløsningen ankommer ved kollektoren, og strålen størkner til en fiber.
Hver polymer kræver sit eget sæt af betingelser til frembringelse af en given type fiber. Koncentrationen af polymeren, opløsningsmidlet, afstanden mellem pumpes opløsningen og jordet kollektoren, potentialforskellen mellem de to, vil hastigheden af den roterende kollektoren, strømningshastigheden, temperatur og fugtighed påvirke electrospinning. Der er mange undersøgelser, der beskriver udvælgelsen af electrospinning parametre og hvordan disse virkninger for de producerede stilladser (f.eks fiberdiameter, morfologi og orientering). 5, 6, 7, 8I disse eksperimenter skeletter blev spundet ud fra udvalgte betingelser i vore tidligere undersøgelser. 2, 9
De følgende metoder er egnede til fremstilling af electrospun stilladser fra PLGA, polymælkesyre (PLA), poly ε-caprolacton (PCL) og poly hydroxybutyrat-co-hydroxyvalerat (PHBV) under anvendelse af en roterende kollektor, som vist i figur 1. Hele opløsningsmidlet dichlormethan (DCM) anvendes. Metoden her producerer mikrofibrøse PLGA, PLA og PCL og nanofibrous PHBVen stillads med mikro-størrelse perler ('perlekæde' morfologi).
- Coate roterende dorn kollektoren med aluminiumfolie med polerede / blanke side udad. Vores dorn var 20 cm bred og 10 cm i diameter.
- Fremstille polymeropløsninger, PLA-, PCL-og PHBV er fremstillet som en 10 vægt% opløsning i DCM. PLGA er fremstillet som en 20 vægt% opløsning i DCM.
- Sted 4 sprøjter af 5 ml volumen på en sprøjtepumpe. Sprøjter fyldt med contain 5 ml af polymeren hver, hvilket giver 20 ml i alt.
- For PLA, bruge PCL og PHBV en flowhastighed på 40 μLmin -1 per sprøjte.
- For PLGA anvende en strømningshastighed på 30 μLmin -1 per sprøjte.
- For PLA, bruge PCL og PLGA en arbejdsgruppe afstand på 17 cm fra nålens spids til dorn.
- For PHBV bruge en arbejdsgruppe afstand af 10 cm fra nålespidsen til dorn.
- Oplad sprøjtenåle til 17.000 V (73.030 P, Genvolt, Shropshire, Storbritannien) og electrospin fra passende afstand på den aluminiumsfolie belagt dorn.
- For tilfældige fibre rotere spindlen ved 200 rpm.
- For linie fibre rotere spindlen ved 1000 opm.
- Stilladser kan gemmes på aluminiumsfolie under tørre forhold. Opbevarings er i en forseglet beholder ved 4 ° C i nærvær af tørremidlet. Det er vores erfaring stilladser forblive stabile i mindst 4 måneder (muligvis meget længere) under disse betingelser (vi er ikke bekendt med nogen published undersøgelser om langsigtede opbevaringsbetingelser for stilladser).
2. Produktion af komplekse Stilladser ved sekventiel Spinning
Sekventielle spinding tilvejebringer en fremgangsmåde til at kombinere egenskaberne af forskellige materialer for at skabe et materiale, der har det bedste af begge egenskaber. PHBV producerer en flad, tæt, sprøde ark mens PLA-eller PCL-spinning producerer lav densitet elastiske plader. Begge materialer understøtter cellevedhæftning. Fortløbende spinding disse materialer resulterer i en tæt celle-uigennemtrængelig membran, der er elastisk.
- Opstil electrospinning riggen pr afsnit 1, med PHBV spinning forhold.
- Electrospin PHBV som ovenfor.
- Uden at ændre aluminiumfolie, electrospin en anden polymer på toppen ved hjælp af parametre og normale betingelser for denne polymer (f.eks 17 cm tromle til nålen, 17000 V, 200 rpm i PLA). Dette additiv proces opbygger et dobbelt lag af stillads fremstilling af en dobbeltlaget.
3. Produktion af Flerlagede Stilladser ved annealing Adskillige lag sammen
- Stilladser kan flerlaget ved anvendelse af varme annealing. For at gøre dette 4 ark PLGA er placeret oven på hinanden og derefter varme annealet ved 60 ° C i 3 timer.
- Stilladser kan også annealet ved damp annealing. Her 4 ark PLGA er placeret oven på hinanden og suspenderes 2 cm over en pulje af DCM (10 ml) i 1 time. Dette udføres i en forseglet beholder ved stuetemperatur.
4. Aseptisk Produktion og postproduktion Sterilisering af Electrospun Stilladser
- Aseptisk stillads produktion kan opnås ved electrospinning i et aseptisk miljø af en laminar strømningshætte i et rent rum miljø. At gøre dette enten sterile polymerer af medicinsk kvalitet eller polymerer steriliseret ved inkubation i DCM, kan anvendes. Efter opløsning, er polymerer electrospun på steril folie viklet somterilised dorn. Stilladser derefter behandles aseptisk. Sterilitet er verificeret ved at inkubere prøver af stilladset i antibiotikum-frit vækstmedier for den pågældende periode.
- For ethanol desinfektion (dette er i brug eksperimentelt, men er ikke anerkendt metode til sterilisering, som kan blive ført til klinikken) scaffolds er anbragt i kort tid (15 min) i en 70% volumen / volumen opløsning af ethanol i destilleret vand. Til praktiske forsøg er sædvanligvis tilstrækkelig til at desinficere scaffolds, således at de kan derefter kombineres med held med dyrkede celler.
- For pereddikesyresterilisering stilladser er nedsænket i pereddikesyre (0,1% v / v i phosphatbufret saltvand (PBS)) og inkuberet i 3 timer ved stuetemperatur, som beskrevet i Selim et al. 9
- For gamma-sterilisation stilladser er bestrålet med en dosis på 3 kGy under anvendelse af en cæsiumkilde som beskrevet i Selim et al. 9
5. Biomekanisk test af stilladser
- Stilladser er skåret i firkanter 5 mm x 20 mm, målt i tykkelse under anvendelse af et mikrometer, og anbringes i en Bose ElectroForce 3100 instrument. Denne maskine anvender en kraft på 0-22 N op til en forskydning på 6 mm og afbilder belastning versus forskydning som en spændings / deformationskurve. Dette tillader Youngs modulus og elasticitet skal beregnes.
6. Visualisering Celler Stilladser og vurdering ECM Produktion
Celler kan farves med vitale fluorescerende farvestoffer, som tillader en at se celler på stilladserne, som de vedhæfte vandrer og formere sig. Efter dyrkning i tilstedeværelse af celler på stilladserne kan bestemmes ved farvning for cellekerner med 4 ',6-diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI). Fremstilling af ECM af celler på stilladset kan vurderes ved farvning af celler til en række af ECM-proteiner, herunder elastin, som vist i dette eksempel. Alle anvendte skeletter blev målt til at have entykkelse på mindst 0,2 mm og skåret i kvadrater på 1,5 cm x 1,5 cm før podning.
I disse studier humane fibroblaster bruges i hele på grund af den rolle, de spiller i blødt væv genopbygning, som er vores laboratorium primære forskningsmæssige interesse.
Celler stammer fra hudprøver fra patienter, der gennemgår elektiv kirurgi for bryst reduktion eller abdominalplastik (samtykket er givet for deres væv, der skal anvendes til forskningsformål). Væv indsamles og anvendes anonymt under Forskning vævsbank licens 12179. Væv vasket med PBS indeholdende streptomycin (0,1 mg / ml) og penicillin (100 IU / ml) og amphotericin B (0,5 ug / ml). Vævsprøver inkuberes i 0,1% w / v trypsin og 0,1% glucose i PBS (12-18 timer, 4 ° C). Dermis trækkes ud, hakket fint og inkuberet med 10 ml collagenase (0,5% w / v i DMEM og 10% FCS, 37 ° C i 18 timer). Centrifugering af de resulterende celler suspension (400 g i 10 minutter), frembringer en pellet af celler, som kan dyrkes, og subdyrket i DMEM suppleret med føtalt kalveserum (FCS, 10% v / v), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 IU / ml) og amphotericin B (0,5 ug / ml). Kun fibroblaster af passage 4-9 bruges i eksperimenter.
- Fibroblaster fra menneskehud, når de konfluente i en T75 (EasyFlask, Nunc, New York, USA) podes ved tilsætning af trypsin / EDTA (5 ml, 5 mg / ml trypsin, 2 mg / ml EDTA i saltvand), inkubation i 5 minutter ved 37 ° C. Suspensionen centrifugeres i 10 minutter (150 g). Cellerne resuspenderes i 5 ml DMEM (suppleret med FCS (10% v / v), streptomycin (0,1 mg / ml), penicillin (100 IU / ml) og amphotericin B (0,5 ug / ml)) og talt under anvendelse af en hæmocytometer, og koncentrationen justeres til såning. Celler normalt podes med 50.000 celler per brønd.
- Hvis det kræves, før podning celler på stilladset, kan cellerne være præ-mærkede anvendelse CellTracker rød eller grøn. Cellens vaskes med 3 x 5 ml PBS. En opløsning af 10 mM CellTracker i serumfrit er celle-fald medium (10 ml) tilsat, og cellerne inkuberes i 45 minutter ved 37 ° C. Efter inkubering vaskes cellerne i 3 x 5 ml PBS, hvorefter de podet stillads. Efter denne overfladen af skeletterne kan afbildes på en Axon ImageExpress mikroskop (Molecular Devices, Sunnyvale, USA) ved 570 nm λex - 620 nm λem (CellTracker rød) og 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker grøn). For at undersøge udbredelsen af celler dybere ind scaffolds en multifoton konfokalt mikroskop, kan anvendes. Dette kan nå omkring 200 mikron indtrængen i de fleste stilladser med eller uden celler.
- Skrive kultur prøver fikseret i 1 ml 3,7% formaldehyd i PBS ved 37 ° C i 20 minutter og derefter vasket med 3 x 1 ml PBS.
- 200 ul af elastin primære antistoffer sættes til hver prøve (5% volumen / volumen i PBS, kanin-anti-humant alfa elastomertin, AbDserotec, Kidlington, England) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter.
- Prøver vaskes med 3 x 1 ml PBS og derefter inkuberet i en opløsning af sekundært antistof (0,5% v / v gede-anti-kanin-IgG (Fc): FITC) i PBS indeholdende DAPI (1 ug / ml) i 30 minutter.
- Efter denne prøverne vaskes med 3 x 1 ml PBS.
- DAPI og sekundære antistof farvede prøver derefter afbildes på en Axon ImageExpress fluorescensmikroskop, 365 nm λex - 460 nm λem for DAPI og 480 nm λex - 533 nm λem for det sekundære antistof. DAPI pletter kerner og gør det muligt at se fordelingen af celler i fibrene meget let.
7. Udsætte celler for Stilladser til Biaksial Dynamic Conditioning
For at undersøge effekten af dynamiske condition på fibroblast ECM produktion har vi udviklet et simpelt proof-of-concept bioreaktor at udforske denne.
- Saml ballonen og flowregulering apparat og forberede system, så den let kan anbringes i en steril beholder egnet til celledyrkning, når den er coatet.
- Autoklaven apparatet indbefatter ballonen (122 ° C, 220 mbar i 1 time). Vi kan bekræfte, at balloner overleve autoklavering uden at påvirke deres funktion ved oppumpning og tømning dem gentagne gange.
- I et rent rum, pakke apparatet i en laminar strømningshætte i stand til at blive electrospun på.
- Oppuste ballonen til det ønskede overfladeareal (Husk ballonen stadig at passe ind i dyrkningsbeholderen) med phosphatpufret saltvand og forbinde PBS til en elektrisk jord ved et punkt i apparatet, som ikke behøver at være sterile (siderøret på 3-vejs hanen).
- Electrospin den ønskede polymer på ballonen ved hjælp af de normale spindebetingelser, under anvendelse af en arbejdsafstand på 10 cm. Tillade stilladset tørre i 1 time. Den "våde" fibre er 'klæbrige' nok til at klæbe til surfes af ballonen uden efterfølgende afmontering.
- Placere ballonen i en steril beholder og transportere det til et laminært stinkskab egnet til cellekultur.
- Fjerne ballonen fra beholderen og anbringes på en steril overflade (petriskål) og gentagne gange (hver 20 sekunder) afpipetteres en cellesuspension (1 x 10 6 celler i 5 ml DMEM) på den belagte ballonen i 20 minutter for at forsøge at distribuere Cellerne jævnt over overfladen.
- Placere ballonen ind i dyrkningsbeholderen, og der tilsættes forvarmet medium passende for celletypen.
- Slut inflationen apparatet til en sprøjtepumpe (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, USA) og puste / tømme ballonen, som skal afgive biaksialt udspiling. Et computerstyret sprøjtepumpe kan anvendes til at opnå en mere kompleks distension regime.
8. Repræsentative resultater
De følgende tal er repræsentative resultater, der kan forventesHvis de ovennævnte fremgangsmåder følges.
Electrospinning kan anvendes til at skabe scaffolds med tilfældige og ordnet arkitekturer (figur 1), der er reproducerbar og fibrene er ensartet. Mange typer af polymerer kan electrospun med karakteristika, der kan variere betydeligt som vist i figur 2 for PHBV, PLA eller PCL. Electrospinning kan producere lys fluffy stilladser eller tætte celle uigennemtrængelige membraner (se figur 3). Alle stilladser her viste lettet cellebinding og spredning. Tidligere arbejde har vist, at celler kan migrere gennem disse scaffolds til en dybde på mindst 500-600 um 9. For PLA den gennemsnitlige fiberdiameter er 3 um. For PHBV er 0.3μm med perler i området fra 5-20 um, for PCL er 3 um, og PLGA er 11 um. Andre undersøgelser med andre opløsningsmiddelsystemer rapporterer, at PHBV kan være electrospun som fibre uden perler eller polymer perler. 10,11
<p class = "jove_content"> Hvis tykkere scaffolds kræves damp og varme annealing kan anvendes til at anneale lag scaffolds sammen (se figur 4). Disse stilladsdele lag ikke delaminere, og det kan være meget vanskeligt at finde forbindelsen mellem lagene.Vi viser, at dobbeltlagsmembraner kan foretages, når cellerne A og B kan hver dyrkes på en separat membran uden sammenspinding som vist i figur 5. Her viser vi dette ved hjælp af humane fibroblaster farvet med to forskellige fluorescerende celler tracker farvestoffer. Sådan en tolags membran ville være nyttige ved dyrkning af celler til dannelse af et hårdt væv såsom knogle eller brusk i den ene side er adskilt fra celler designet til at danne en blød (og sædvanligvis hurtigere voksende) væv på den anden side, såsom ganespalte reparation eller rekonstruktionskirurgi periodontal kirurgi. 12, 13
Med hensyn til virkningen af sterilisation på electrospun stilladser har vitidligere rapporteret, at fremgangsmåden til sterilisering virkninger på stilladset og efterfølgende cellekultur. 9 Dette er illustreret i figur 6, som viser virkningerne af pereddikesyre, gammabestråling og ethanol i fiberdiameteren og trækstyrke og Youngs modul af en PLGA stillads .
Gammabestråling har ingen signifikant virkning på fiberdiameter henviser pereddikesyre og ethanol reducere fiberdiameter med cirka 50%. Med hensyn til trækstyrke hver af metoderne til sterilisering ændret trækstyrke og elasticitet af skeletterne. Dyrkning af celler på disse scaffolds yderligere reduceret endelige trækspænding, men forøgede elasticitet.
Endelig er en fremgangsmåde til at teste virkningen af dynamiske biaksial udspiling af celler dyrket på electrospun stilladser præsenteret. Denne proof-of-concept tilgang, viser, at cellerne stadig er levedygtige under dynamiskudspiling men også producere forøgede mængder af elastin under disse betingelser. Dette står i skarp kontrast til manglen på elastin, når de samme celler på samme stilladset holdes under statiske betingelser (se figur 7).
Figur 1. Viser en tegning af en electrospinning rig og spinding af tilfældige og parallelle fibre og derefter lag af fibre placeret over hinanden. Vinkelrette fibre kan dannes ved electrospinning et sæt af flugtende fibre på aluminiumfolie, som roterer folien ved 90 ° og derefter straks electrospinning et andet sæt af på linie liggende fibre oven på disse.
Figur 2. Viser morfologien af tilfældige electrospun måtter af (A) PLA (Målestokken er 100 um), (B) PHBV (Målestokken er 100 um), (C) PCL (Målestokken er 100 um) og (D) PLGA (Skalastang er 200 um). Bemærk, at PLA-, PCL og PLGA er alle mikrofibrøse ensartede stillads. PHBV er spundet som en 'perlekæde' med nanofibre forbinder 5-20 um størrelse perler. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Fremstilling af en flerlaget konstruktion. Her stilladser er først spundet bruger PHBVen og derefter sprøjter fyldt med PLA-eller PCL bruges. Disse spundet på toppen af PHBV stilladset. Figuren viser udseendet af disse flerlags stilladser (A) En enkelt PHBV lag (B) Et tværsnit af en PHBV-PLA dobbeltlag, der viser den tætte nanofibrous, "perler" PHBV lag (venstre) og mere åben mikrofibrøse PLA lag (til højre) og (C) En enkelt PLA lag.nk "> Klik her for at se større figur.
Figur 4. Tykkere scaffolds kan fremstilles ved varme annealing og damp annealing. (A) og (B) viser et snit gennem en damp annealede PLA stillads, hvor de første fibrøse scaffolds på omkring 150 um er blevet anbragt sammen, og dichlormethan damp anvendes til fremstilling af meget tykkere stilladser op til 500 um. I (C) og (D) kan man se, at scaffold består af lag af meget tykkere fibre indflettet med lag af tyndere fibre skabt af varme annealing lag af tynde og tykke fibre sammen. Denne fremgangsmåde kan bruges til at producere stilladser af komplekse mekaniske egenskaber. Klik her for at se større figur .
Fi Gure 5. udseende af celler på et dobbeltlag stillads. I alle tilfælde celler til stede, er humane dermale fibroblaster. (A) fibroblaster på electrospun PLA hvor cellerne fikseret og farvet med DAPI. (B) DAPI farvede celler på PHBV. I (C) fibroblaster er præ-farvet med en vital farvestof, CellTracker grøn, og du kan se fremkomsten af dem på PLA side af dobbeltlaget. (D) et snit gennem dobbeltlaget med røde farvede fibroblaster på den nedre PHBV overflade og grønne farvede fibroblaster på den øvre PLA overflade. (E) Fibroblaster præ-farvet med CellTracker røde dyrkes på PHBV overfladen. Anvendelsen af vitale fluorescerende farvestoffer tilvejebringer en bekvem metode til at se på fordelingen af celler på stilladset, medens cellerne stadig vokser. Man kan rutinemæssigt anvende disse farvestoffer i mindst 7 dage. Imidlertid er koncentrationen af farvestoffet bliver fortyndes cellerne deler sig. Målestoksforhold er lig med 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Figur 6 "/>
Figur 6. Biomekaniske egenskaber electrospun stilladset opnås ved anvendelse af en Bose ElectroForce tensiometer enhed (A). (B) spændings / belastningskurve kurver PLGA skeletter steriliseret ved gammabestråling, alkohol, pereddikesyre eller aseptisk fremstillet. Tre målinger kan opnås fra sådan en graf: endelige trækspændingen (UTS), som fiberen kan udsættes før den bryder det endelige trækspænding og Youngs modul. Sidstnævnte giver en indikation af elasticiteten af stilladset. (C) Virkningen af hver steriliseringsmetode på PLGA fiberdiameter i um. Hver sterilisering metode reduceret UTS. Både pereddikesyre og gamma-bestråling mindske Youngs modul giver en mere elastisk stillads, alkohol gør stilladset særligt sprødt. Klik her for at se større figur .Figur 7. Denne figur viser anvendelsen af en simpel ballon for at tilvejebringe en biaksialt bioreaktor, som stilladser (og celler, der vokser i stilladserne) kan underkastes biaksial udspiling i perioder. (A) En tømte ballon hvorpå electrospun fibre PHBV, er blevet deponeret. På dette stadium ballonen er delvist dækket med fibre. (B) en ballon fuldstændigt coatet med PHBV og PLA fibre. (C) En cellesuspension gentagne gange pipetteres på ballonen. (D) En ballon anbringes i en flaske af sterile medier, hvor ballonen er forbundet til en sprøjtepumpe og PBS (anvendt som en elektrolyt), der anvendes til forsigtigt oppuste og tillade tømning af ballonen mod en programmeret tidsplan. (E) Celler scaffolds, der fjernes fra ballonen ved afslutningen af eksperimentet og analyse foretaget for cellelevedygtighed er vist i (F), hvor levedygtige celler udvikler en mørkeblå farve ved hjælp af metabolisk indicator 3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid. (G) viser, at celler (blå) dyrket på denne ballon og underkastet biaksial udspiling udvikle elastin fibre (grøn, farvet under anvendelse af elastin specifikke antistoffer), hvorimod de samme celler på en identisk stillads (H) dyrkes under statiske betingelser har ubetydelige elastin produktionen . Målestoksforhold er lig med 0,025 mm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Electrospinning er en meget populær teknik til fremstilling af stilladser til vævsmanipulering. 14, 15, 16 Selv om det er forholdsvis simpelt at fremstille basale electrospun scaffolds til eksperimentel anvendelse teknikken er også kompleks og multifacetteret med mange variable. 6 Der er mange undersøgelser, der beskriver, hvorledes electrospinning parametre bestemmer stilladset fremstillet. I denne undersøgelse er fokus på de betydelige udfordringer, post-produktion at gøre stilladser passende arkitekturer og mekaniske egenskaber og at tilskynde celler i dem til at gøre ekstracellulære proteiner for at opnå væv egnet til implantation i mennesker.
Vores mål i denne artikel er at beskrive metoder til at ruste læserne til at designe og karakterisere stilladser til en bred vifte af formål. I denne artikel vil vi beskrive metoder til at gøre komplekse og tykkere stilladser og at sterilisere stilladser for eksperimentel og klinisk brug. Vi beskriver også billedbehandling calen på stilladserne og induktion af elastin fiberproduktion ved at udsætte celler for biaksial udspiling.
Mange af de ønskede egenskaber af stilladser kan opnås efter fremstilling (f.eks annealing flere lag) og sterilisering. Men disse vil igen påvirke de mekaniske egenskaber af stillads. Vi rapporterer, at sterilisation metoder alle er tilbøjelige til at ændre trækstyrke og Youngs modul i forskellig grad. En nylig undersøgelse fra vores gruppe sammenlignet gammastråling, pereddikesyre og ethanol til deres virkninger som potentielle sterilisering ordninger for PLGA stilladser 9 De negative virkninger af sterilisering teknikker kan undgås ved at producere stilladser under aseptiske forhold -. Sidstnævnte kræver anvendelse af et renrum . Forskellige brugere kan vælge forskellige metoder, men alle bør være opmærksomme på, at de nuværende sterilisering metoder vil indvirke negativt på egenskaberne af stilladser.
C ULTUR af celler på stilladser også påvirker stilladser »Mekaniske egenskaber. Induktion af ECM produktion ved at udsætte celler på stilladserne på biaksial udspiling kan anvendes til at påvirke de mekaniske egenskaber.
Metoderne til spinning en stillads over en anden til at gøre en tolagsmembranen er let at forstå, og vi beskriver dobbeltlagsmembranpartikler stilladser i stand til at understøtte to forskellige populationer af celler illustreret i dette dokument ved præ-mærkning celler med to vitale celle tracker farvestoffer. Disse blev anvendt til at illustrere, at den dobbeltlagede membran opnås det erklærede formål.
Endelig budget biaksiale udspiling rig som beskrevet i denne undersøgelse kan anvendes til at levere en række systemer. Cykliske, lineære og tilfældige regimer kan let programmeres og anvendes. Denne alsidighed tillader systemet at blive anvendt til mange af problemerne i vævsmanipulering, såsom ganespalte, bækkenbunden, blære og hud.
"> I vævsteknik litteratur brug af en-akset testsystemer til dyrkning af celler på stilladser er blevet rapporteret. 4 Men vi kunne ikke finde alle offentliggjorte litteratur beskæftiger sig med, hvordan bløde væv reagerer på biaksiale udspiling. Denne simple metode viser, at cellerne reagerer på toakset udspiling med produktionen af elastin -. et centralt element i den ekstracellulære matrix, som giver bløde væv elastisk rekyl Dette giver en klar indikation af, hvor conditioning bløde væv, som de vokser i laboratoriet tilbyder en rute til at producere væv egnet til implantation af områder i kroppen, hvor de indfødte væv har iboende elasticitet. Dette er et område, hvor yderligere udvikling vil helt klart fortjente af tissue engineering samfund og bioreaktor producenter.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker BBSRC for at finansiere en ph.d. for Mr. Frazer Bye.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
