Summary
Electrospun andaimes podem ser processados de pós-produção para aplicações de engenharia de tecidos. Aqui descrevemos métodos para girar andaimes complexos (por fiação consecutivos), para fazer andaimes mais espessa (por camadas de multi-uso de calor ou vapor de recozimento), para atingir a esterilidade (produção asséptica ou pós-produção de esterilização) e adequadas para atingir as propriedades biomecânicas.
Abstract
Electrospinning é um método vulgarmente utilizado e versátil para produzir suportes (muitas vezes biodegradável) para a engenharia de tecidos 3D. 1, 2, 3 Muitos tecidos in vivo submetidos a distensão biaxial em graus variáveis tais como a pele, bexiga chão, pélvica e até mesmo o palato duro como crianças crescer. Na produção de andaimes para estes fins, há uma necessidade de desenvolver andaimes de adequadas propriedades biomecânicas (quer alcançado sem ou com células) e que são estéreis para uso clínico. O foco deste trabalho não é como estabelecer parâmetros eletrofiação básicos (como há uma extensa literatura sobre electrospinning), mas sobre como modificar a pós-produção fiado andaimes para torná-los aptos para fins de engenharia de tecidos - aqui espessuras, propriedades mecânicas e de esterilização (necessário para uso clínico) são considerados e também descrevem como as células podem ser cultivadas em andaimes e submetido a estirpe biaxial para condicionar-los para aplicações específicas.
Electrospinning tende a produzir folhas finas, como o coletor de eletrofiação torna-se revestido com fibras isolantes, torna-se um mau condutor de tal forma que as fibras depósito não mais sobre ele. Daí que descrevem abordagens para produzir estruturas mais espessas por calor ou de vapor de recozimento do aumento da força de andaimes mas não necessariamente a elasticidade. Fiação sequenciais de andaimes de polímeros diferentes para alcançar andaimes complexos também é descrito. Metodologias de esterilização pode afetar negativamente a força ea elasticidade de andaimes. Nós comparar três métodos para os seus efeitos sobre as propriedades biomecânicas em andaimes electrospun de ácido láctico-co-glicólico poli (PLGA).
Imagiologia de células em andaimes e avaliação da produção de matriz extracelular (ECM) proteínas por células em suportes é descrita. A cultura de células in vitro sobre suportes podem melhorar andaime resistência e elasticidade, mas o tecido de engenharia litere mostra que as células muitas vezes não conseguem produzir ECM apropriado quando cultivadas sob condições estáticas. Existem poucos sistemas comerciais disponíveis, que permitem que um de cultura de células em andaimes sob regimes de condicionamento dinâmicos -. Um exemplo é o Electroforce Bose 3100 que pode ser utilizado para exercer um programa de condicionamento em células em andaimes realizada utilizando apertos mecânicas dentro de alguns meios câmara cheia 4 Uma abordagem para um biorreactor de cultura de células para orçamento distorção controlada em 2 dimensões é descrito. Nós mostramos que as células podem ser induzidas a produzir elastina sob estas condições. Finalmente avaliação das propriedades biomecânicas de andaimes transformados cultivadas com ou sem células é descrita.
Protocol
1. Eletrofiação de fibras aleatórias e Alinhados
Electrospinning cria finas redes fibrosas usando potencial elétrico para desenhar uma solução de polímero para um colecionador de terra. Colectores pode estar em formas muito diversas e pode ser estático ou, mais comumente, em rotação. O solvente evapora antes da solução chega ao colector e do jacto solidifica-se em uma fibra.
Cada polímero requer seu próprio conjunto de condições para produzir um determinado tipo de fibra. A concentração do polímero, o solvente, a distância entre a solução bombeada eo colector ligado à terra, a diferença de potencial entre os dois, a velocidade do colector rotativo, a taxa de fluxo, temperatura e humidade serão todos afectar eletrofiação. Existem muitos estudos que descrevem a selecção de parâmetros de eletrofiação e como estes impacto sobre os suportes produzidos (diâmetro da fibra, por exemplo, a morfologia, e orientação). 5, 6, 7, 8Nestas experiências andaimes foram centrifugadas com base em condições seleccionadas para os nossos estudos anteriores. 2, 9
Os seguintes métodos são adequados para a produção de electrospun andaimes de PLGA, ácido láctico poli (PLA), poli ε-caprolactona (PCL) e poli-hidroxibutirato-co-hidroxivalerato (PHBV), utilizando um colector de rotação, como mostrado na Figura 1. Durante todo o diclorometano solvente (DCM) é usado. O método aqui produz PLGA microfibroso, PLA e PCL e PHBV de nanofibras andaime com micro-esferas de tamanho (morfologia "colar de pérolas").
- Cubra o. Rotativa coletor mandril com folha de alumínio, com o lado polido / brilhante virado para o exterior O nosso mandril foi de 20 cm de largura, e 10 cm de diâmetro.
- Prepare soluções de polímero; PLA, PCL e PHBV são feitos como se uma solução de 10% em peso em DCM. PLGA é constituído como uma solução 20% em peso em DCM.
- Coloque 4 seringas de 5 ml de volume em uma bomba de seringa. Seringas são carregados para contain 5 ml do polímero cada, dando 20 ml no total.
- Para PLA, PCL e PHBV utilizar uma taxa de fluxo de 40 μLmin -1 por seringa.
- Para PLGA utilizar uma taxa de fluxo de 30 μLmin -1 por seringa.
- Para PLA, PCL e PLGA usar uma distância de trabalho de 17 cm a partir da ponta da agulha para mandril.
- Para PHBV usar uma distância de trabalho de 10 cm da ponta da agulha para mandril.
- Carregue as agulhas de seringa para 17.000 V (73.030 P, Genvolt, Shropshire, Reino Unido) e electrospin a partir da distância apropriada para cima do mandril folha de alumínio revestida.
- Para as fibras aleatórias rodar o mandril a 200 rpm.
- Para fibras alinhadas rodar o mandril a 1000 rpm.
- Andaimes podem ser armazenados na folha de alumínio sob condições secas. Armazenagem recomendada é de um recipiente selado a 4 ° C na presença de dessecante. Em nossa experiência andaimes permanecer estável por pelo menos 4 meses (possivelmente muito mais tempo) nessas condições (não temos conhecimento de qualquer puestudos sobre blished longos condições de armazenamento a longo prazo para andaimes).
2. Produção de Andaimes complexos por Spinning seqüenciais
Fiação sequenciais proporciona um método de combinar as propriedades de diferentes materiais para criar um material que tem o melhor de ambas as propriedades. PHBV produz uma superfície plana, folha, densa frágil enquanto PLA ou PCL fiação produz folhas de baixa densidade elásticas. Ambos os materiais apoiar adesão celular. Consecutivamente fiação estes resultados materiais em uma membrana de célula-impermeável denso que é elástica.
- Configure o equipamento como por eletrofiação Seção 1, com condições de PHBV fiação.
- Electrospin PHBV como acima.
- Sem alterar a folha de alumínio, electrospin um segundo polímero em-parte superior usando os parâmetros e condições normais para que o polímero (por exemplo, 17 cm tambor para agulha, 17000 V, 200 rpm durante PLA). Este processo aditivo acumula-se uma camada dupla de andaime produzindo uma bicamada.
3. Produção de Andaimes Multicamada por Recozimento Várias camadas Juntos
- Andaimes pode ser em várias camadas através da utilização de calor de recozimento. Para fazer esta 4 folhas de PLGA são colocados em cima uns dos outros e, em seguida, termicamente recozido a 60 ° C durante 3 horas.
- Andaimes também pode ser recozida por vapor de recozimento. Aqui 4 folhas de PLGA são colocadas em cima umas das outras e suspensas a 2 cm acima de uma piscina de DCM (10 ml) durante 1 hora. Isto é realizado num recipiente selado à temperatura ambiente.
4. Produção e Esterilização Asséptica Pós-produção de electrospun Andaimes
- Produção de andaime asséptica pode ser alcançado através da eletrofiação num ambiente asséptico de um fluxo laminar no interior de um ambiente de sala limpa. Para fazer isto, quer polímeros estéreis de grau médico ou polímeros esterilizadas por incubação em DCM pode ser usado. Uma vez dissolvido, os polímeros são electrospun sobre folha enrolada em torno estéril comoterilised mandril. Andaimes são então tratadas de forma asséptica. A esterilidade é verificada por incubação de amostras do andaime em meios sem antibiótico de crescimento durante o período adequado.
- Para a desinfecção etanol (isto é de utilização experimentalmente, mas não é uma metodologia reconhecida de esterilização que poderia ser levada para a clínica) andaimes são colocados brevemente (15 min) numa solução a 70% v / v de etanol em água destilada. Para fins práticos experimentais este é geralmente suficiente para desinfectar andaimes de modo que eles podem então ser combinado com sucesso com células em cultura.
- Para andaimes de esterilização ácido peracético são imersos em ácido peracético (0,1% v / v em tampão fosfato salino (PBS)) e incubou-se durante 3 horas à temperatura ambiente como descrito no Selim et al. 9
- Para gama andaimes de esterilização são irradiados com uma dose de 3 kGy utilizando uma fonte de césio como descrito no Selim et al. 9
5. Teste Biomecânico de Andaimes
- Andaimes são cortadas em rectângulos de 5 mm x 20 mm, medida para a espessura usando um micrómetro, e colocados num instrumento Bose 3100 Electroforce. Esta máquina aplica uma força de 0-22 N até um deslocamento de 6 milímetros e parcelas a carga vs deslocamento como uma curva de tensão / deformação. Isto permite que o módulo de Young e elasticidade para ser calculado.
6. A visualização de células em andaimes e Avaliação de Produção ECM
As células podem ser marcadas com corantes fluorescentes vitais que nos permitem ver as células sobre os andaimes que atribuem, migrar e proliferar. Cultura pós a presença de células em suportes pode ser determinada por coloração para os núcleos das células com 4 ',6-diamidino-2-fenilindol dicloridrato (DAPI). A produção de ECM por células na andaime pode ser avaliada por coloração das células para uma gama de proteínas de ECM incluindo elastina, como mostrado neste exemplo. Todos os suportes utilizados foram medidos para ter umaespessura de pelo menos 0,2 mm e cortado em quadrados de 1,5 cm x 1,5 cm antes da semeadura.
Nestes estudos fibroblastos dérmicos humanos são utilizados em toda por causa do papel que desempenham na reconstrução de tecidos moles que é interesse de nosso laboratório de pesquisa primária.
As células são obtidas a partir de amostras de pele de pacientes submetidos a cirurgia electiva para a redução da mama ou abdominoplastia (consentimento foi dada para a sua tecido a ser utilizado para fins de investigação). Os tecidos são coletadas e utilizadas de forma anónima no âmbito da Investigação licença do Banco de Tecidos 12179. Os tecidos são lavados com PBS contendo estreptomicina (0,1 mg / ml) e penicilina (100 UI / ml) e anfotericina B (0,5 ug / ml). As amostras de tecido são incubados em 0,1% w / v de tripsina e 0,1% de glucose em PBS (12-18 horas, 4 ° C). A derme é descascada, picada finamente e incubadas com 10 ml de colagenase (0,5% w / v em DMEM e 10% de FCS, 37 ° C durante 18 horas). A centrifugação das células resultantes suspensião (400 g durante 10 minutos), produz um pelete de células que podem ser cultivadas e subcultivados em DMEM suplementado com soro fetal de vitelo (FCS, 10% v / v), estreptomicina (0,1 mg / ml), penicilina (100 UI / ml) e anfotericina B (0,5 ug / ml). Fibroblastos apenas de passagem 4-9 são usados em experimentos.
- Fibroblastos dérmicos humanos, uma vez confluentes em um T75 (EasyFlask, Nunc, New York, EUA) são semeadas por adição de tripsina / EDTA (5 ml, 5 mg / ml de tripsina, 2 mg / ml de EDTA em solução salina), incubando durante 5 minutos a 37 ° C. A suspensão é centrifugada durante 10 minutos (150 g). As células são ressuspensas em 5 ml de DMEM (suplementado com FCS (10% v / v), estreptomicina (0,1 mg / ml), penicilina (100 UI / ml) e anfotericina B (0,5 ug / ml)) e contadas usando um hemocitómetro, ea concentração é ajustada para a propagação. As células são semeadas a normalmente a 50.000 células por poço.
- Se necessário, antes de semear células sobre o andaime, as células podem ser pré-marcada com CellTracker vermelho ou verde. A células são lavados com 3 x 5 ml de PBS. Uma solução de 10 mM em CellTracker livre de soro, de células apropriada, médio (10 ml) é adicionado e as células são incubadas durante 45 minutos a 37 ° C. Após a incubação, as células são lavadas em 3 5 mL x PBS a seguir que são semeados em andaimes. Seguindo esta a superfície dos suportes pode ser trabalhada em um microscópio ImageExpress Axon (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) a 570 nm λex - 620 nm λem (CellTracker vermelho) e 480 nm λex - 533 nm λem (CellTracker verde). Para investigar a penetração de células mais profundo em andaimes um microscópio confocal multifotônica pode ser usado. Isto pode atingir cerca de 200 micron de penetração na maioria dos suportes com ou sem células.
- Amostras post de cultura são fixadas em formaldeído a 1 ml de 3,7% em PBS a 37 ° C durante 20 minutos e, em seguida, lavou-se com 3 x 1 ml de PBS.
- 200 ul de anticorpos primários de elastina são adicionados a cada amostra (5% v / v em PBS, de coelho anti-humanos ELAS alfaestanho, AbDserotec, Kidlington, Reino Unido) e incubados a 37 ° C durante 30 minutos.
- As amostras são lavadas com 3 x 1 ml de PBS e depois incubadas numa solução de anticorpo secundário (0,5% v / v de cabra anti-IgG de coelho (FC): FITC) em PBS contendo DAPI (1 ug / ml) durante 30 minutos.
- Seguindo esta as amostras são lavadas com 3 x 1 ml de PBS.
- DAPI e amostras de anticorpo secundário coradas são então trabalhada num microscópio fluorescente ImageExpress Axon, 365 nm λex - 460 nm para λem DAPI e 480 nm λex - 533 λem nm para o anticorpo secundário. Manchas DAPI núcleos e permite que se encontra a distribuição de células dentro das fibras muito facilmente.
7. Células sujeitando em andaimes ao condicionamento dinâmico Biaxial
Para examinar o efeito do condicionamento dinâmico da produção de fibroblastos ECM desenvolvemos um biorreator de prova de conceito simples para explorar isso.
- Monte balão e fluxoaparelho regulação e preparar o sistema de modo que pode ser prontamente colocados em um vaso de estéril adequado para cultura de células, uma vez que é revestido.
- Autoclavar do aparelho, incluindo o balão (122 ° C, 220 mBar durante 1 hora). Nós podemos confirmar que os balões sobreviver autoclave sem prejudicar sua função de inflar e desinflar-los repetidamente.
- Em uma sala limpa, desempacotar o aparelho em uma capela de fluxo laminar em condições de ser electrospun em.
- Inflar o balão para a área de superfície necessária (lembrar o balão ainda necessita de se encaixar no recipiente de cultura), com solução salina tamponada com fosfato e ligar o PBS para uma terra eléctrica a um ponto em que o aparelho não necessita de ser estéril (tubo de derivação em 3 vias da torneira).
- Electrospin polímero a necessária para o balão utilizando as condições normais de fiação, utilizando uma distância de trabalho de 10 cm. Permitir que o andaime para secar durante 1 hora. Os 'molhado' fibras são "pegajosos", o suficiente para aderir ao surfÁs do balão sem posteriormente destacando.
- Colocar o balão em um vaso estéril e transportá-lo para uma câmara de fluxo laminar adequado para cultura de células.
- Remover o balão a partir do navio e local para uma superfície de estéril (placa de Petri) e repetidamente (cada 20 segundos) pipetar uma suspensão de células (1 x 10 6 células em 5 ml de DMEM) para o balão revestido durante 20 minutos para tentar distribuir células uniformemente sobre a superfície.
- Coloque balão para dentro do vaso de cultura, e adicionar pré-aquecidos meios apropriados para o tipo de célula.
- Ligar o aparelho a inflação para uma bomba de seringa (Kent Scientific, Genie Plus, Connecticut, EUA) e inflar / desinflar o balão conforme o necessário para dar distensão biaxial. Um computador bomba de seringa controlada pode ser utilizada para conseguir um regime distensão mais complexa.
8. Os resultados representativos
As figuras a seguir são resultados representativos que podem ser esperadosse os métodos acima são seguidos.
Electrospinning pode ser utilizada para criar andaimes com arquitecturas aleatórios e ordenada (Figura 1), este é repetitivo e as fibras são uniformes. Muitos tipos de polímeros podem ser electrospun com características que podem variar consideravelmente, como mostrado na Figura 2 para PHBV, PLA ou PCL. Electrospinning pode produzir luz andaimes macias ou membranas celulares densas impenetráveis (ver Figura 3). Todos os suportes mostrados aqui facilitando a fixação e proliferação celular. O trabalho anterior mostrou que as células podem migrar através destes suportes até uma profundidade de pelo menos 500-600 uM 9 para o PLA o diâmetro da fibra média é de 3 mm;. Para PHBV é 0.3μm com pérolas que variam de 5-20 mm; para PCL é 3 micrómetros, e para PLGA é 11 mM. Outros estudos utilizando outros sistemas solventes relatam que PHBV pode ser electrospun como fibras sem esferas ou pérolas de polímero. 10,11
<p = classe "jove_content"> Se andaimes mais espessas são necessários vapor e aquecer o recozimento pode ser empregue para recozer camadas de andaimes juntos (ver Figura 4). Estas camadas de andaime não delaminar e pode ser muito difícil encontrar a junção entre as camadas.Nós mostramos que as membranas de bicamada pode ser feita quando as células A e B podem ser cultivados em cada uma membrana separada sem entrelaçamento, como mostrado na Figura 5. Aqui demonstramos isso usando fibroblastos dérmicos humanos coloridas com dois diferentes corantes fluorescentes rastreador celular. Tal membrana uma bicamada seria útil quando a cultura de células para formar um tecido duro, tais como o osso ou cartilagem de um lado separadas das células destinadas a formar um mole (e geralmente mais rápido crescimento) de tecido do outro lado, tais como a reparação fenda palatina ou reconstrutiva periodontal cirurgia. 12, 13
No que diz respeito ao impacto de esterilização em electrospun scaffolds temosrelatado anteriormente que o método de impactos de esterilização na cultura de células de andaime e subsequente. 9 Isto é ilustrado na Figura 6 que mostra os efeitos do ácido peracético, a irradiação gama e etanol sobre o diâmetro da fibra e resistência à tracção e módulo de Young de um andaime de PLGA .
A irradiação gama não tem efeito significativo sobre o diâmetro da fibra enquanto o ácido peracético e etanol reduzir o diâmetro da fibra de cerca de 50%. Com respeito à resistência à tracção de cada um dos métodos de esterilização mudou a resistência à tracção e da elasticidade das matrizes. Cultura de células sobre estes suportes ainda mais reduzida a tensão de tracção máxima, mas aumentou a elasticidade.
Finalmente, um método de testar o efeito de distensão biaxial dinâmico em células cultivadas em electrospun andaimes é apresentado. Esta abordagem à prova de conceito mostra que as células permanecem viáveis durante dinâmicodistensão, mas também produzir maiores quantidades de elastina sob estas condições. Isto contrasta marcadamente com a falta de elastina, quando as mesmas células sobre o mesmo andaime são mantidas sob condições estáticas (ver Figura 7).
Figura 1. Mostra um desenho animado de um equipamento de eletrofiação e dos fiação de fibras aleatórios e em paralelo e em seguida as camadas de fibras colocados uns sobre os outros. Fibras perpendiculares pode ser criado por eletrofiação um conjunto de fibras alinhadas para uma folha de alumínio, girando a folha de 90 ° e, em seguida, imediatamente eletrofiação um segundo conjunto de fibras alinhadas no topo destas.
Figura 2. Mostra a morfologia das esteiras electrospun aleatórios de (A) PLA (barra de escala é de 100 mm), (B) PHBV (barra de escala é de 100 mm), (C) PCL bar (escala é 100 uM) e (D) PLGA (barra de escala é de 200 mm). Note-se que o PLA, PCL e PLGA são todos andaimes microfibroso uniformes. PHBV é girada como um "colar de pérolas", com nanofibras de conexão 5-20 mM contas porte. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Produção de um andaime de várias camadas. Aqui, os suportes são inicialmente fiadas usando PHBV e, em seguida, seringas preenchidas com PLA ou PCL são utilizados. Estes são girados em cima do andaime PHBV. A figura mostra o surgimento destas estruturas multicamadas, (A) A camada de PHBV único, (B) Uma seção transversal de uma bicamada PHBV-PLA, mostrando a nanofibras denso, "colar de pérolas" PHBV camada (à esquerda) e mais aberto microfibroso PLA camada (direita) e (C) Uma camada de PLA único.nk "> Clique aqui para ver maior figura.
A Figura 4. Andaimes mais espessas podem ser produzidos por calor e vapor de recozimento de recozimento. (A) e (B) mostram uma secção através de um recozido de vapor PLA andaime onde iniciais andaimes fibrosas de cerca de 150 um são sido colocados juntos e diclorometano vapor é usado para fazer andaimes muito mais espessa de até 500 mm. Em (C) e (D) pode-se ver que o andaime consiste em camadas de fibras muito mais espessa, intercalados com camadas de fibras mais finas criados por calor recozimento camadas de fibras finas e grossas em conjunto. Esta abordagem pode ser utilizada para produzir suportes de complexos propriedades mecânicas. para ver figura maior .
Fi gura 5. Aparecimento de células em um andaime de camada dupla. Em todos os casos as células presentes são fibroblastos dérmicos humanos. (A) fibroblastos sobre electrospun PLA onde as células são fixadas e coradas com DAPI. (B) células DAPI coradas sobre PHBV. Em (C) os fibroblastos são pré-marcadas com um corante vital, verde CellTracker, e você pode ver a aparência deles no lado PLA da bicamada. (D) Uma secção através da bicamada com vermelhos fibroblastos coradas na superfície inferior e PHBV verdes fibroblastos coradas sobre a superfície superior PLA. (E) Fibroblastos pré-corados com vermelho CellTracker crescido na superfície PHBV. A utilização de corantes fluorescentes vitais fornece uma metodologia conveniente para observar a distribuição de células na andaime enquanto as células são ainda em crescimento. Pode-se usar rotineiramente estes corantes por pelo menos 7 dias. No entanto, a concentração de corante se dilui como as células se dividem. Barras de escala são iguais a 0,1 mm.g6.jpg "alt =" Figura 6 "/>
Figura 6. Propriedades biomecânicas electrospun andaime são obtidos utilizando um dispositivo de Bose Electroforce tensiómetro (A). (B) tensão / deformação curvas de PLGA andaimes esterilizados por irradiação gama, álcool, ácido peracético, ou produzido assepticamente. Três medições pode ser obtido a partir de tais gráfico um: a tensão de tracção final (UTS) para o qual a fibra pode ser submetido antes de quebrar, a estirpe à tracção eo módulo de Young. Esta dá uma indicação da elasticidade do andaime. (C) O efeito de cada método de esterilização em PLGA diâmetro da fibra em uM. Cada metodologia de esterilização diminuiu UTS. Tanto o ácido peracético e radiação gama diminuir o módulo de Young dando um andaime mais elástica, o álcool faz com que o andaime particularmente frágil. Clique aqui para ver maior figura .Figura 7. Esta figura mostra a utilização de um balão simples para fornecer um bioreactor biaxial em que andaimes (e células em crescimento dentro das andaimes) pode ser submetido a distensão biaxial, por períodos de tempo. (A) Um balão vazio sobre o qual electrospun fibras, PHBV, foram depositados. Nesta fase, o balão é parcialmente coberta com fibras. (B) Um balão totalmente revestido com PHBV e fibras de PLA. (C) uma suspensão de células é repetidamente pipetados para o balão. (D) Um balão colocado dentro de uma garrafa de meios estéreis onde o balão está ligado a uma bomba de seringa e PBS (utilizado como um electrólito condutor) é usado para inflar suavemente e permitir que a deflação do balão contra um programa programado. (E) As células em andaimes sendo removido do balão no final da experiência e análise realizada para a viabilidade celular mostrado em (F) onde as células viáveis desenvolver uma cor azul escuro usando o ind metabólicaicator 3 - (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio. (G) mostra que as células (azul) cultivados sobre este balão e sujeito a distensão biaxial desenvolver elastina fibras (verde, manchado utilizando anticorpos específicos de elastina), enquanto que as mesmas células sobre um andaime idêntico (H) cultivadas sob condições estáticas têm uma produção de elastina negligenciável . Barras de escala são iguais a 0,025 mm.
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Discussion
Electrospinning é uma técnica muito popular para a produção de andaimes para engenharia de tecidos. 14, 15, 16 Embora seja relativamente simples para produzir scaffolds electrospun básicas para o uso experimental da técnica também é complexo e multifacetado, com muitas variáveis. 6 Há muitos estudos que descrevem como o eletrofiação parâmetros determinam o andaime produzido. Neste estudo, o foco está na produção considerável desafios pós para fazer andaimes de arquiteturas adequadas e propriedades mecânicas e incentivar células dentro delas para fazer proteínas extracelulares para alcançar o ajuste de tecido para a implantação no homem.
Nosso objetivo neste artigo é descrever métodos para equipar leitores para projetar e caracterizar andaimes para uma ampla gama de propósitos. Neste artigo vamos descrever metodologias para fazer andaimes complexos e mais grosso e para esterilizar andaimes para uso experimental e clínica. Descrevemos também imagens cells sobre os suportes ea indução de produção de fibras de elastina submetendo as células a distensão biaxial.
Muitas das características desejadas de andaimes pode ser conseguida de pós-produção (tais como várias camadas de recozimento) e esterilização. No entanto, estes por sua vez, irá afetar as propriedades mecânicas dos andaimes. Relata que as metodologias de esterilização todos tendem a mudar de resistência à tração e módulo de Young em graus diferentes. Um estudo recente do nosso grupo em comparação irradiação gama, ácido peracético e etanol para os seus efeitos como potenciais regimes de esterilização para PLGA andaimes 9 Os efeitos adversos de técnicas de esterilização pode ser evitada através da produção de andaimes sob condições assépticas -. Este último requer a utilização de uma sala limpa . Diferentes usuários podem selecionar metodologias diferentes, mas todos devem estar cientes de que as metodologias de esterilização atuais terá um impacto negativo sobre as propriedades dos andaimes.
C ulture de células em andaimes também afeta as propriedades mecânicas dos andaimes. A indução de produção de ECM submetendo as células de andaimes à distensão biaxial pode ser utilizada para afectar as propriedades mecânicas.
A metodologia de fiação um andaime sobre a outra para fazer uma membrana de bicamada é facilmente compreendida e descrevemos andaimes bicamada capazes de suportar duas populações diferentes de células ilustradas no presente documento por rotulagem de pré-células com dois corantes vitais Reportados celulares. Estes foram utilizados para ilustrar que a membrana de bicamada alcançado a sua finalidade indicada.
Finalmente, o orçamento rig distensão biaxial descrito neste estudo pode ser usado para oferecer uma gama de regimes. Cíclico, linear, e os regimes aleatórios podem ser prontamente programado e aplicada. Esta versatilidade permitirá que o sistema a ser utilizado para muitos dos problemas enfrentados na engenharia de tecidos, tais como, fenda palatina, do pavimento pélvico, bexiga e da pele.
"> Na literatura de engenharia de tecidos do uso de sistemas de testes uniaxiais para a cultura de células em andaimes tem sido relatada. 4 Entretanto, fomos incapazes de encontrar qualquer literatura publicada como lidar com tecidos moles responder a distensão biaxial. Esta abordagem simples demonstra que as células respondem ao distensão biaxial com a produção de elastina -. um componente chave da matriz extracelular que dá tecidos moles recolhimento elástico Isto dá uma indicação clara de como os tecidos moles condicionado à medida que crescem no laboratório oferece uma via para produzir tecidos apropriado para implantação para áreas de do corpo onde os tecidos nativas têm elasticidade intrínseca. Esta é uma área onde o desenvolvimento ainda serão claramente merecido pela comunidade de engenharia de tecidos e fabricantes de biorreatores.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos BBSRC para financiar um PhD para o Sr. Bye Frazer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly lactic-co-glycolic acid | Sigma Aldrich | ||
| Poly lactic acid | Sigma Aldrich | 81273 | Inherent viscosity ~2.0dl/g |
| Poly ε-caprolactone | Sigma Aldrich | ||
| Poly hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate 12:1 | Goodfellow | 578-446-59 | PHB88/PHV12 |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich or Fisher | 270997 or D/1850/17 | >99.8% contains 50-150ppm amylene stabiliser |
| 50 multi coloured balloons | Wilkinson’s Hardware Stores Ltd. | 0105790 | |
| Goat anti-rabbit IgG (FC):FITC | AbDserotec | STAR121F | |
| Rabbit anti-human alpha elastin | AbDserotec | 4060-1060 | |
| Screw Cap GL45 PP 2 Port, pk/2 | SLS | 1129750 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma Aldrich | 32670 | |
| CellTracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
| CellTracker red CMTX | Invitrogen | C34552 |
References
- Canton, I., McKean, R., Charnley, M., Blackwood, K., Fiorica, C., Ryan, A., MacNeil, S. Development of an Ibuprofen-releasing biodegradable PLA/PGA electrospun scaffold for tissue regeneration. Biotechnology and bioengineering. 105, 396-408 (2010).
- Blackwood, K., McKean, R., Canton, I., Freeman, C., Franklin, K., Cole, A., Brook, I., Farthing, P., Rimmer, S., Haycock, J., Ryan, A., MacNeil, S. Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement. Biomaterials. 29, 3091-3104 (2008).
- Yang, F., Maurugan, R., Wang, S., Ramakrishna, S. Electrospinning of nano/micro scale poly(L-lactic acid) aligned fibers and their potential in neural tissue engineering. Biomaterials. 26, 2603-2610 (2005).
- Sittichokechaiwut, A., Edwards, J. H., Scutt, A. M., Reilly, G. C. Short bouts of mechanical loading are as effective as dexamethasone at inducing matrix production by human bone marrow mesenchymal stem cell. Eur. Cell Mater. 20, 45-57 (2010).
- Sill, T. J., von Recum, H. A. Electrospinning: applications in drug delivery and tissue engineering. Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).
- Deitzel, J., Kleinmeyer, J., Harris, D., Beck Tan, N. C. The effect of processing variables on the morphology of electrospun nanofibers and textiles. Polymer. 42, 261-272 (2001).
- Fridrikh, S., Yu, J., Brenner, M., Rutledge, G. Controlling the fiber diameter during electrospinning. Physical review letters. 90, 1-4 (2003).
- Fong, H., Chun, I., Reneker, D. Beaded nanofibers formed during electrospinning. Polymer. 40 (16), 4585-4592 (1999).
- Selim, M., Bullock, A. J., Blackwood, K. A., Chapple, C. R., MacNeil, S. Developing biodegradable scaffolds for tissue engineering of the urethra. BJU Int. 107 (2), 296-302 (2010).
- Tong, H. -W., Wang, M. An investigation into the influence of electrospinning parameters on the diameter and alignment of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibers. Journal of Applied Polymer Science. 120 (3), 1694-1706 (2011).
- Tong, H. -W., Wang, M. Electrospinning of poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) fibrous tissue engineering scaffolds in two different electric fields. Polymer Engineering & Science. 51 (7), 1325-1338 (2011).
- Retzepi, M., Donos, N. Guided Bone Regeneration: biological principle and therapeutic applications. Clinical oral implants research. 21, 567-576 (2010).
- Moreau, J., Caccamese, J., Coletti, D., Sauk, J., Fisher, J. Tissue engineering solutions for cleft palates. Journal of oral maxillofacial. 65, 2503-2511 (2007).
- Yang, F., Both, S., Yang, X., Walboomers, X., Jansen, J. Development of an electrospun nano-apatite/PCL composite membrane for GTR/GBR application. Acta biomaterialia. 5, 3295-3304 (2009).
- Yoshimoto, H., Shin, Y., Terai, H., Vacanti, J. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Telemeco, T., Ayres, C., Bowlin, G., Wnek, G., Boland, E., Cohen, N., Baumgarten, C., Mathews, J., Simpson, D. Regulation of cellular infiltration into tissue engineering scaffolds composed of submicron diameter fibrils produced by electrospinning. Acta biomaterialia. 1, 377-385 (2005).
