Summary
昆虫的血细胞进行了许多重要的功能，包括免疫和非免疫，昆虫生长发育的各个阶段的。我们目前的知识来自血细胞类型和功能对抗虫基因模型的研究。在这里，我们提出了野生毛毛虫血细胞提取，量化和可视化的方法。
Abstract
昆虫血细胞（相当于哺乳动物白血细胞）的昆虫的整个生命周期的1几种生理过程中发挥重要的作用。在幼虫阶段的昆虫，属于鳞翅目（飞蛾和蝴蝶），双翅目（真苍蝇）的订单，血细胞形成的淋巴腺（一个专门的造血器官）或胚胎干细胞，可以通过到成年阶段。参与胚胎血细胞在细胞迁移过程中的发展和趋化调控在炎症过程中。他们还参与细胞凋亡和胚胎发育2是必不可少的。血细胞介导的细胞手臂的昆虫先天免疫反应，包括多种功能，如细 胞扩散，细胞聚集，形成结节，细胞吞噬功能和外国侵略者的封装3。他们还负责编排特定的昆虫体液防御感染过程中，如公关最大制本抗菌肽和其他效应分子4，5。栉孔扇贝血细胞的形态和功能主要是研究遗传或生理昆虫模型，包括果蝇， 果蝇 6，7，蚊子埃及伊蚊和冈比亚按蚊 8日，9日和烟草天蛾，烟草天蛾 10，11。然而，目前的资料很少存在的多样性，分类，形态和功能的血细胞非模式昆虫物种，特别是那些从野生12。
在这里，我们描述了一个简单而有效的协议，提取野生毛毛虫血细胞。我们使用：，倒数第二龄Lithacodes片形吸虫 （黄肩蛞蝓蛾）（ 图1）和Euclea delphinii（多刺的橡木蛞蝓）毛毛虫（鳞翅目：刺蛾科），并表明，足量的血淋巴（昆虫血）可以分离和血细胞的数目计数从个别幼虫。此方法可用于有效地研究在这些物种以及从外地收获在其他相关的鳞翅目毛虫的血细胞类型，或它可以容易地结合旨在探讨血细胞的功能与微生物或寄生生物13感染后的免疫学测定方法。
Protocol
1。材料制备
- 准备用硼硅玻璃毛细管和微管拉拔器的针头（1-2微米的头和锥度3-4毫米）。仪器设置：斜坡：561速度：20;热：560;延迟：1;拉：100压力：500。
- 准备在收集解决方案：Grace的中等（GM）辅以10％的胎牛血清（FBS）和抗凝血剂缓冲区的20％（98毫米的NaOH，186 mM的氯化钠，1.7 mM的EDTA和41 mM的柠檬酸酸，pH值4.5的60％ ）。在无菌条件下，将上述溶液制备新鲜，并在任何时候都在冰上保存。
- 准备的孵化缓冲溶液：90％的GM补充有10％的胎牛血清（FBS）。该解决方案还准备了新鲜的冰在任何时候都保持。
- 准备一个总共至少15微升×昆虫的收集和孵化溶液的两个数。
2。注射采集解决方案的毛毛虫
- 麻醉倒数第二个插件低温在冰上20分钟前血细胞提取焦油幼虫。
- 适合一个干净毛细管进入管件，它连接到一个20毫升的玻璃注射器（ 图2）的针（16号）的钝端。让管中收集解决方案，打开该实验室的长椅上，慢慢地填充毛细管的缓冲区。毛细管通常填充有约10-15微升收集溶液，毛虫（约1μl溶液每10毫克毛虫总身体质量的大小取决于=身体总质量的0.01％）。休息了一球粘土，是摆在解剖显微镜下针。
- 毛毛虫放在培养皿中。应被定位在其一侧，使气门是清晰可见的（ 图3）的昆虫。
- 在解剖显微镜下观察的同时，保持到位的毛虫与对钳子，放置的针接近一个气孔，其中在第一节角质层一般较柔和。轻轻按下毛细管针对人体的昆虫。一旦针穿透角质层，注入溶液的总体积到毛毛虫（ 图3）。重要的是要避免气泡注入到毛虫。毛毛虫的身体会在注射后膨胀（ 例如 ，增加量的20％），但不应破裂或渗出。
- 返回毛虫冰，定位昆虫从伤口（ 图3）中漏出的背面，以防止缓冲器。
- 重复步骤2.1-2.4血淋巴中提取用于为每个毛毛虫。在这个阶段，让所有的昆虫，冰上冷却30分钟，然后再继续。
3。血细胞的提取
- 在解剖显微镜下，将毛毛虫的培养皿中。
- 浅（长2-3毫米）切口在后区的毛毛虫使用无菌scalpe的升（ 图3）。请注意，不要破坏肠道或其他内部器官的目的是到穿刺的角质层仔细，收集缓冲/血淋巴的组合包含个人昆虫的血细胞。
- 挤压的毛毛虫，灵活的塑料镊子轻轻地使用，同时收集10微升移液器吸头的血淋巴组合（约10-20微升），再小心，不要伤到内部组织（ 图3）。血淋巴收集到的液滴从毛毛虫的身体挤压。扔掉的毛毛虫的遗体。
- 为单独的标记硅化的0.5 ml微量离心管收集血淋巴每一个人毛虫，。
- 孵化溶液等体积的（约10-20微升）添加到每个血淋巴样品收集从个别毛虫。将冰血淋巴样品在任何时候都。
- 重复步骤3.1-3.5实验中所用的每个毛毛虫。
- 混合血淋巴样品和孵化解决方案之前血细胞计数。这种治疗方法可以适当的血细胞分离，并防止结块。
- 使用干净的移液枪枪头转移10μL血淋巴样品的孵育液混合到一个血球计数仪。
- 使用的化合物显微镜，计数和至少15的大正方形（面积为1平方：0.04毫米2，深度：0.1毫米），中央网格的血细胞计数仪（ 图3）的记录中的血细胞数量。这些值添加到获得的15个正方形中的血细胞的数量的总和。
- 血细胞计数仪和盖玻片彻底清洗瓶用蒸馏水和去离子水冲洗干净并擦干Kimwipes（金佰利），每个样品之间。
- 每个血淋巴样品重复步骤4.1-4.4。
- 计算血细胞数的平均值，每毫升的血淋巴volume为每个毛毛虫，如下所示：
血细胞计数仪网格的每个正方形的总体积为：（0.04毫米2面积）×（0.1 mm深度）= 0.004毫米3×15平方= 0.06毫米3 =总体积的所有15个平方。
（血细胞总数的计数/计数所有15个正方形）的总体积的15平方的总和×2稀释因子=血细胞数/ mm 3的 ×1,000 =血细胞/毫升的血淋巴中的数目。
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Representative Results
本文描述的协议允许的最小体积的10-20微升从个别毛虫昆虫血淋巴的集合。血细胞收集使用此方法是无细胞结块，黑化缺陷，组织碎片或其他污染物。因此血细胞可以很容易地观察和显微镜下计数，和几种昆虫可以观察到，在短短的Hosur。我们观察到，在我们的样本中的血细胞的大部分包括浆细胞3（血球扩频不对称）（ 图4）。目前，我们正在表征不同的血细胞类型中发现这些毛毛虫在细节（Stoepler 等，未发表的数据）。这里描述的方法提供了一种快速，准确的方法计算总血球数从现场实验收集的个人毛虫。
虽然血细胞密度之间的差别很大，并在昆虫种类1 </ SUP>，我们发现，血细胞数为L.片形吸虫毛虫范围从1.10×10 6 - 8.23×10 6细胞/毫升的血淋巴（平均为3.51×10 6，n = 31的毛虫），并在以前报道的其他鳞翅目昆虫物种14中的值的范围内。
图1。一个倒数第二个，龄Lithacodes片形吸虫 （鳞翅目：刺蛾科）毛毛虫的照片。这些毛毛虫的典型体长范围从倒数第二到最终龄在10-15毫米。图片来源：约翰T.莉儿。
图2。注射针设置。的玻璃注射器经由一钝头的针和塑料管连接到毛细管针（面板1-4）。塑性粘土一块用于休息毛细管针（5）。毛毛虫被放置在陪替氏培养皿中的注射用收集的溶液（6）。
图3。血细胞的提取方法。 （一）的冷藏毛虫注入的收集溶液;（二）以下注射的毛虫的身体将溶胀稍微，和在注入昆虫被允许到休息在冰上30分钟;（Ç，ð）的切口被制成使用一个干净的手术刀，毛毛虫使用对塑料镊子挤压，迫使血淋巴的身体通过切口，用吸管收集和血细胞（E）使用血球计数仪计数血细胞。
图4。显微镜的pi，王国芳显示提取的血细胞，由Euclea delphinii（鳞翅目：刺蛾科）毛毛虫（放大倍数：20倍）。
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Discussion
从医学上重要的昆虫，鳞翅目模式昆虫血细胞中提取先前已报道的方法9，14。血细胞提取方法适于根据昆虫种类，发育阶段的昆虫和其形态特征。例如，可以容易地进行从烟草天蛾幼虫的血淋巴中分离，通过剪断腹部15的端部的弯曲角附近。因为刺蛾幼虫（刺蛾科）缺乏这方面腹部的结构，我们已经开发了一种独特的协议为小型现场采集的毛毛虫血淋巴中提取。此方法证明有效的隔离足够的的血淋巴卷含有大量的血细胞，可以存储或处理的进一步的实验。另外，血细胞从成蚊的集合包括一个费 时的步骤，涉及仔细去除腿，翅膀和腹部16的前端
我们打算利用这种方法，在今后的研究中，森林收获的毛毛虫从不同发育阶段的形态特征血细胞类型的细胞。此法还可以提供健康的血细胞分离昆虫细胞免疫反应，包括生理方面的HEMO的总数不同发育阶段和营养条件的影响，详细研究的第一个关键步骤天真或受感染的毛毛虫核细胞中获得自然的环境。鉴于慢性暴露鳞翅目幼虫在本质上不同的病原体，以及潜在的连续的存在下，他们的共生微生物的范围，可以预料，这些昆虫具有相比，在实验室饲养的免疫细胞中发现的不同的属性类型的血细胞与昆虫。此外，此血细胞提取的协议也可以被施加到研究与其他组的昆虫，允许被纳入生态场研究免疫相关检测，从而增加非模型昆虫种类的细胞防御机制的认识农业或生态重要的意义。总之，我们的方法将提供一个宝贵的资源，昆虫生物学家，生态学家和那些有兴趣在功能之间的相互了解血细胞的丰度和野生昆虫种群承受能力的微生物或parasitiÇ感染。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
TMS支持的哈伦信托奖学金（GWU）在研究过程中。经费实地收集和育种研究片形吸虫和 E。 delphinii提供了由国家科学基金会资助DEB 0642438 JTL。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
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