Summary
Insekt hæmocytter udfører mange vigtige funktioner, både immune og ikke-immune, i alle faser af insekt udvikling. Vores nuværende viden om hemocyte typer og funktion kommer fra undersøgelser af insekt genetiske modeller. Her præsenteres en metode til udvinding, kvantificere og visualisere hæmocytter fra vilde sommerfuglelarver.
Abstract
Insekt hæmocytter (ækvivalent med mammale hvide blodlegemer) spiller en vigtig rolle i flere fysiologiske processer gennem en insektets livscyklus 1. I larvestadier af insekter hører til ordenerne Lepidoptera (møl og sommerfugle) og Diptera (ægte fluer), er hæmocytter dannet af lymfekirtel (en specialiseret hæmatopoietisk organ) eller embryonale celler og kan føres igennem til det voksne stadie. Embryoniske hæmocytter er involveret i cellemigrering under udvikling og kemotaxi regulering under inflammation. De tager også del i celle apoptose og er afgørende for embryogenese 2. Hæmocytter medierer den cellulære arm af insekt medfødte immunreaktion, der omfatter flere funktioner, såsom cellespredning, celleaggregering, dannelse af knuder, fagocytose og indkapsling af fremmede angribere 3. De er også ansvarlige for orkestrere særlige insekt humorale forsvar under infektion, såsom produktion af antimikrobielle peptider og andre effektormolekyler 4, 5. Hemocyte morfologi og funktion er hovedsageligt blevet undersøgt i genetiske eller fysiologiske insekt modeller, herunder bananfluen, Drosophila melanogaster 6, 7, myggene Aedes aegypti og Anopheles gambiae 8, 9 og tobak hornworm, Manduca sexta 10, 11. Imidlertid kun få oplysninger i øjeblikket findes om den mangfoldighed, klassificering, morfologi og funktion hæmocytter i ikke-model insektarter, især dem indsamlet i naturen 12.
Her beskriver vi en enkel og effektiv protokol til ekstraktion hæmocytter fra vilde larver. Vi bruger næstsidste stadium Lithacodes Fasciola (gul-bredskuldret slug møl) (figur 1) og Euclea delphinii (spiny eg slug) larver (Lepidoptera: Limacodidae), og vise at der er tilstrækkelige mængder af hemolymph (insekt blod)kan isoleres og hemocyte numre talt fra individuel larver. Denne fremgangsmåde kan anvendes til effektivt at undersøge hemocyte typer i disse arter såvel som i andre beslægtede skadelige sommerfugle larver høstet fra marken, eller den kan let kombineres med immunologiske assays til formål at undersøge hemocyte funktion efter infektion med mikrobielle eller parasitiske organismer 13.
Protocol
1. Klargøring
- Forbered nåle (1-2 um spids og 3-4 mm taper) ved hjælp af borosilikatglas kapillarrør og en mikropipette aftrækker. Instrument indstillinger: Rampe: 561, Hastighed: 20; varme: 560, delay: 1; træk: 100; tryk: 500.
- Forberede samlingen opløsning: 60% af Graces medium (GM) suppleret med 10% af føtalt bovint serum (FBS) og 20% af antikoagulerende puffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA og 41 mM citronsyre, pH 4,5 ). Ovennævnte opløsning fremstilles frisk under sterile betingelser og holdes på is hele tiden.
- Forberede inkubationsbuffer opløsning: 90% af GM suppleret med 10% FBS. Denne løsning er også fremstilles friske og holdes på is hele tiden.
- Der fremstilles en i alt mindst 15 pi gange antallet af insekter for både indsamling og af inkubationsopløsningerne.
2. Injektion af Larver med Collection Solution
- Anesthetize næstsidste instjære larver ved afkøling dem på is i 20 minutter forud for hemocyte ekstraktion.
- Passer til den stumpe ende af en ren kapillær nål (16 gauge) til røret, som er forbundet til en 20 ml glassprøjte (figur 2). Forlade rør indeholdende samlingen opløsningen åbne på laboratoriebordet og langsomt fylde kapillaret med pufferen. Kapillarrøret er normalt fyldt med 10-15 pi indsamling opløsning, afhængigt af størrelsen af kålorm (ca. 1 gl opløsning per 10 mg larve samlede kropsmasse = 0,01% af den totale masse). Hvile kanylen på en kugle af ler, der er placeret ved siden af dissektionsmikroskop.
- Placer larve i en petriskål. Insektet skal anbringes på siden, således at Spirakler er klart synlige (fig. 3).
- Under visning under et dissektionsmikroskop, holde larve på plads med en pincet og placere nålen tæt på en af de Spirakler, hvor isekt neglebånd er generelt blødere. Tryk forsigtigt kapillære nål mod kroppen af insektet. Når nålen er trængt ind i overhuden, injiceres det totale volumen af opløsning til larven (fig. 3). Det er vigtigt at undgå injektion luftbobler i larve. Larven krop vil svulme (fx stige i mængde med 20%) efter injektion, men bør ikke sprænges eller sive.
- Returnerer larve til isen, placering af insekt dorsalt at forhindre buffer i at sive ud af såret (figur 3).
- Gentag trin 2,1-2,4 for hver caterpillar anvendes til hæmolymfe ekstraktion. På nuværende tidspunkt tillade alle insekter til nedkøling på is i 30 minutter, før du fortsætter.
3. Udvinding af hæmocytter
- Placer larve i en petriskål under dissektionsmikroskop.
- Foretage en lavvandet (2-3 mm lange) snit i den bageste region af kålorm anvendelse af en steril scalpe l (fig. 3). Pas på ikke at beskadige tarmen eller andre indre organer, målet er at punktere neglebånd omhyggeligt og indsamle buffer / hemolymph blanding indeholdende hæmocytter fra individuelle insekter.
- Klem kålorm forsigtigt ved hjælp af fleksible plast pincet, mens indsamling af hemolymph mix (ca. 10-20 pl) med en 10 gl pipettespids, igen pas på ikke at skade de interne væv (Figur 3). Hemolymph opsamles fra dråben presset fra kålorm krop. Kassér Caterpillars resterne.
- Collect hæmolymfe fra hver enkelt larve i separate mærkede silikonebehandlet 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Tilføj tilsvarende volumen af inkuberingen opløsning (ca. 10-20 ul) til hvert hæmolymfe prøve opsamlet fra et individ larve. Hold hæmolymfe prøver på is hele tiden.
- Gentag trin 3,1-3,5 for hver larve anvendt i forsøget.
- Bland hemolymph prøven og inkubation opløsning umiddelbart før optælling hæmocytter. Denne behandling giver mulighed for korrekt adskillelse af hæmocytter og forhindrer sammenklumpning.
- Anvende en ren pipettespids at overføre 10 pi hæmolymfe prøve blandet med inkuberingen opløsning på et hæmocytometer.
- Anvendelse af en forbindelse mikroskop, og tæller registrerer antallet af hæmocytter i mindst 15 af de store kvadrater (areal på en kvadratmeter: 0,04 mm 2, dybde: 0,1 mm) i det centrale gitter hæmocytometer (figur 3). Læg disse værdier til opnåelse af en samlet sum af antallet af hæmocytter i de 15 kvadrater.
- Skyl hæmocytometer og dens omslag slide grundigt med en vaskeflaske med destilleret og demineraliseret vand og tør efter med Kimwipes (Kimberly-Clark) mellem hver prøve.
- Gentag trin 4,1-4,4 for hver hæmolymfe prøve.
- Beregn den gennemsnitlige antal hæmocytter per ml hæmolymfe volume for hver larve, som følger:
Samlet volumen af hver firkant af hæmocytometeret nettet: (0,04 mm 2 område) × (0,1 mm dybde) = 0,004 mm 3 × 15 firkanter = 0,06 mm 3 = det samlede volumen af alle 15 regnet firkanter.
(Summen af det samlede antal hæmocytter i de 15 kvadrater optalt / det samlede volumen af alle 15 regnet kvadrater) x 2 fortyndingsfaktor = antallet af hæmocytter / mm 3 x 1.000 = antallet af hæmocytter / ml af hæmolymfe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen er beskrevet heri mulighed for indsamling af et minimum volumen på 10-20 ul insekt hemolymph fra de enkelte larver. Hæmocytter indsamlet ved denne metode er fri for celle-sammenklumpning melanin defekter, vævsrester eller andre forureninger. Derfor hæmocytter let kan observeres og talt under mikroskop, og flere insekter kan observeres indenfor få Hosur. Vi observerede, at de fleste hæmocytter i vores prøver bestod af plasmatocytes 3 (hæmocytter spredes asymmetrisk) (figur 4). Vi i øjeblikket karakteriseringen af de forskellige hemocyte typer findes i disse larver i detaljer (Stoepler et al. Upublicerede data). Den her beskrevne metode giver en hurtig og præcis midler til at tælle det samlede hemocyte numre for de enkelte sommerfuglelarver indsamlet fra markforsøg.
Selvom hemocyte tæthed kan variere meget mellem og inden insektarter 1 </ Sup>, fandt vi, at hemocyte tal for L. Fasciola larver området fra 1,10 × 10 6-8,23 x 10 6 celler / ml af hæmolymfe (gennemsnit: 3,51 × 10 6, n = 31 larver), og er i området fra tidligere rapporterede værdier i andre sommerfugle-species 14.
Figur 1 Fotografi af en næstsidste stadium Lithacodes Fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Larve. Typisk krop længden af disse larver spænder fra 10-15 mm i næstsidste til den endelige instars. Foto: John T. Lill.
Figur 2. Injektionskanyle setup. En glassprøjte er forbundet til en kapillær nål via en stump ende nål og plastrør (paneler 1-4). Et stykke plastisk ler anvendes til at hvile kapillarrøret nål (5). Kålorm anbringes i en petriskål til injektion med samlingen opløsning (6).
Figur 3. Hemocyte ekstraktionsmetode. (A) Den afkølede larve injiceres med samlingen opløsningen, (b) efter injektion, vil larven krop kvælde lidt, og den injicerede insekt får lov at hvile på is i 30 minutter, (c, d) et snit ved hjælp af en ren skalpel, er larven klemmes anvendelse af et par plastiske pincet til at tvinge hæmolymfe ud af kroppen gennem snittet, og hæmocytter opsamles med en pipette (e) hæmocytter tælles ved hjælp af et hæmocytometer.
Figur 4. Mikroskopi picture viser udtrukne hæmocytter fra Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) larver (forstørrelse: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fremgangsmåder til ekstraktion hæmocytter fra medicinsk vigtige insekter og lepidoptera-insekter model er tidligere blevet rapporteret, 9, 14. Hemocyte ekstraktionsmetoder er tilpasset efter de insektarter, udviklingsstadium insektet og morfologiske egenskaber. For eksempel kan hæmolymfe isolation fra Manduca larver let udføres ved at klippe det krumme horn nær enden af abdomen 15. Fordi slug larver (Limacodidae) mangler denne abdominal struktur, har vi udviklet en særskilt protokol for hemolymph ekstraktion fra små felt-indsamlede larver. Denne fremgangsmåde viser sig effektiv til isolering af tilstrækkelige hæmolymfe bind med et stort antal hemocyte celler, som kan lagres eller behandles til yderligere eksperimenter. Desuden omfatter hemocyte samling fra voksne myg en tidskrævende trin, der involverer omhyggelig fjernelse af ben, vinger og spidsen af maven 16
Vi agter at anvende denne metode i fremtidige studier til morfologisk karakterisere hemocyte celletyper fra forskellige udviklingsstadier i skov-høstede sommerfuglelarver. Denne analyse kan også give det første afgørende skridt til at isolere sunde hæmocytter at undersøge i detaljer flere fysiologiske aspekter af insekt cellulære immunrespons, herunder effekten af forskellige udviklingsstadier og ernæringsmæssige betingelser for det samlede antal hæmocytes i naive eller inficerede larver opnået fra deres naturlige miljøer. I betragtning af kronisk eksponering af lepidoptera-larver til en række forskellige patogener i naturen, samt det potentielt kontinuerte tilstedeværelse af deres mikrobielle symbionter, forventes det, at disse insekter besidder typer hæmocytter med forskellige egenskaber sammenlignet med immunceller findes i laboratorie-opdrættet insekter. Hertil kommer, kan dette hemocyte ekstraktion protokol også anvendes til undersøgelser med andre grupper af insekter, så immunologisk-relaterede assays skal indarbejdes i økologiske feltstudier, og dermed øge vores forståelse af cellulære forsvarsmekanismer i ikke-model insektarter af landbrugs-eller økologisk betydning. Som konklusion vil vores metode giver en værdifuld ressource til insekt biologer, økologer og der er interesseret i at forstå den funktionelle samspil mellem hemocyte overflod og evnen af vilde insektpopulationer at modstå mikrobiel eller parasitic infektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
TMS blev støttet af Harlan Trust Fellowship (GWU) under denne undersøgelse. Finansieringen af feltet indsamling og avl L. Fasciola og E. delphinii blev leveret af NSF tilskud DEB 0642438 til JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
