Summary
Insect hemocyten voeren tal van belangrijke functies, zowel immune als niet-immune, in alle stadia van insecten ontwikkeling. Onze huidige kennis van hemocyte soorten en functie komt van studies over insecten genetische modellen. Hier presenteren we een methode voor het extraheren, het kwantificeren en visualiseren hemocyten van wilde rupsen.
Abstract
Insect hemocyten (gelijk aan zoogdieren witte bloedcellen) spelen een belangrijke rol in diverse fysiologische processen in het leven van een insect cyclus 1. In larvale stadia van insecten behorend tot de orde van de Lepidoptera (motten en vlinders) en Diptera (ware vliegen), worden hemocyten gevormd uit de lymfeklier (een gespecialiseerde hematopoietische orgel) of embryonale cellen en kan worden uitgevoerd door middel van het volwassen stadium. Embryonale hemocyten zijn betrokken bij celmigratie gedurende de ontwikkeling en chemotaxis regelgeving tijdens de ontsteking. Zij nemen ook deel in cel apoptose en zijn essentieel voor embryogenese 2. Hemocyten bemiddelen de cellulaire arm van het insect aangeboren immuunrespons die verschillende functies, zoals celspreiding, cel aggregatie, vorming van nodules, fagocytose en inkapseling van indringers 3 omvat. Zij zijn ook verantwoordelijk voor het orkestreren specifieke humorale afweer insect tijdens infectie, zoals de productie van antimicrobiële peptiden en andere effectormoleculen 4, 5. Hemocyte morfologie en functie zijn voornamelijk bestudeerd in genetische of fysiologische insect modellen, zoals de fruitvlieg Drosophila melanogaster 6, 7, de muggen Aedes aegypti en Anopheles gambiae 8, 9 en de tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. Er is echter weinig informatie bestaat momenteel over de diversiteit, classificatie, morfologie en functie van hemocyten in niet-model insectensoorten, met name die uit het wild gehaald 12.
Hier beschrijven we een eenvoudig en efficiënt protocol voor de extractie van hemocyten van wilde rupsen. We gebruiken voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (geel-schouders slug mot) (figuur 1) en Euclea delphinii (spiny eiken slug) rupsen (Lepidoptera: Limacodidae) en laten zien dat er voldoende hoeveelheden hemolymfe (insect bloed)kan worden geïsoleerd en hemocyte aantal getelde van individuele larven. Deze methode kan worden gebruikt om efficiënt onderzoeken hemocyte types in deze soorten en in andere lepidoptera rupsen geoogst van het veld, of het kan eenvoudig worden gecombineerd met immunologische assays ontworpen hemocyte functie onderzoeken na infectie met bacteriën of parasitaire organismen 13.
Protocol
1. Materiaal Voorbereiding
- Bereid naalden (1-2 micrometer tip en 3-4 mm conus) van borosilicaatglas capillaire buizen en een micropipet trekker. Instrument instellingen: helling: 561; snelheid: 20; warmte: 560; vertraging: 1; pull: 100; druk: 500.
- Bereid de verzameling oplossing: 60% Medium Grace's (GM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 20% antistollingsmiddel buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA en 41 mM citroenzuur, pH 4,5 ). De bovenstaande oplossing wordt vers bereid onder steriele omstandigheden en op ijs gehouden te allen tijde.
- Bereid de incubatiebuffer oplossing: 90% van GM aangevuld met 10% van FBS. Deze oplossing wordt ook vers bereid en op ijs gehouden te allen tijde.
- Bereid een totaal van ten minste 15 ul x het aantal insecten enerzijds het verzamelen en de incubatie oplossingen.
2. Injectie van Rupsen met Collection Solution
- Verdoven voorlaatste instar larven door koeling ze op ijs gedurende 20 min voor extractie hemocyte.
- Breng het stompe uiteinde van een schone capillaire naald (16 gauge) in de buis die is verbonden met een 20 ml glazen injectiespuit (figuur 2). Laat de buis met de verzameling oplossing openen op de labtafel en langzaam het capillair vullen met de buffer. Het capillair wordt meestal gevuld met ongeveer 10-15 pl verzameling oplossing, afhankelijk van de grootte van de rups (ongeveer 1 ui oplossing per 10 mg rupsband totale lichaamsmassa = 0.01% van lichaamsgewicht). Leg de naald op een bal van klei die naast de dissectiemicroscoop geplaatst.
- Plaats de rups in een petrischaal. Het insect moet worden geplaatst op de zijkant zodat de spiracles duidelijk zichtbaar (Figuur 3).
- Tijdens het bekijken onder een dissectiemicroscoop, houdt de rups vast met een pincet en plaats de naald dicht bij een van de spiracles, waar de insekte cuticula is over het algemeen zachter. Druk voorzichtig op de capillaire naald tegen het lichaam van het insect. Zodra de naald is doorgedrongen tot de cuticula, injecteren het totale volume van de oplossing in de rups (figuur 3). Het is belangrijk te voorkomen injecteren luchtbellen in de rups. De rups lichaam zal (bijvoorbeeld in volume te verhogen met 20%) zwellen na de injectie, maar mag niet barsten of lekken.
- Zet de rups het ijs, het positioneren van de insect dorsaal naar buffer lekt uit de wond (figuur 3).
- Herhaal stappen 2.1-2.4 per caterpillar voor hemolymfe extractie. In dit stadium zodat alle insecten op ijs gedurende 30 minuten rusten alvorens verder te gaan.
3. Extractie van hemocyten
- Plaats de rups in een petrischaal onder de dissectiemicroscoop.
- Een ondiepe (2-3 mm lang) incisie in het achterste gedeelte van de rupsband met een steriel scalpe l (Figuur 3). Zorg ervoor dat u de darm of andere inwendige organen beschadigen, het doel is om het doorprikken van de cuticula zorgvuldig en verzamel de buffer / hemolymfe mix met hemocyten van individuele insecten.
- Knijp voorzichtig in de rups met behulp van flexibele kunststof pincet terwijl het verzamelen van de hemolymfe mix (ongeveer 10-20 ui) met een 10 ul pipet tip, weer zorg ervoor dat u de interne weefsels (figuur 3) verwonden. Hemolymfe wordt verzameld uit de druppel geperst uit het lichaam van de rups. Gooi de rups de overblijfselen.
- Verzamel hemolymfe van elke afzonderlijke rups in afzonderlijke label gesiliconiseerd 0,5 ml microcentrifugebuisjes.
- Voeg gelijke volume van de incubatie-oplossing (ongeveer 10-20 ui) aan elk monster hemolymfe vanuit een individu rups. Houden hemolymfe monsters op ijs te allen tijde.
- Herhaal stappen 3.1-3.5 voor elke rupsband gebruikt in het experiment.
- Meng de hemolymfe monster en de incubatie-oplossing onmiddellijk voorafgaand aan het tellen hemocyten. Deze behandeling zorgt voor een goede scheiding van hemocyten en voorkomt klonteren.
- Gebruik een schone pipet tip om 10 ul van hemolymfe monster, gemengd met de incubatie oplossing op een hemocytometer te dragen.
- Met een samengestelde microscoop, tellen en dient het aantal hemocyten in ten minste 15 van de grote vierkanten (oppervlak van een vierkante: 0,04 mm 2, diepte: 0,1 mm) van het centrale rooster van de hemocytometer (figuur 3). Voeg deze waarden een totale som van het aantal hemocyten in de 15 vierkanten ontstaat.
- Spoel de hemocytometer en het deksel schuif grondig met een wasfles met gedestilleerd en gedeïoniseerd water en droog het af met Kimwipes (Kimberly-Clark) na elk monster.
- Herhaal stap 4,1-4,4 voor elke hemolymfe monster.
- Bereken het gemiddelde aantal hemocyten per ml hemolymfe volume voor elke rups, als volgt:
Totale volume van elk vierkant van de hemocytometer rooster: (0,04 mm 2-gebied) × (0,1 mm diepte) = 0,004 mm 3 × 15 vierkantjes = 0,06 mm 3 = het totale volume van alle 15 geteld pleinen.
(Som van het totaal aantal hemocyten in de 15 vierkanten geteld / het totale volume van alle 15 vierkanten geteld) x 2 = verdunningsfactor het aantal hemocyten / mm 3 x 1000 = het aantal hemocyten / ml hemolymfe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het protocol hier beschreven staat de inzameling toe van een minimaal volume van 10-20 ul van insecten hemolymfe van individuele rupsen. Hemocyten verzameld via deze werkwijze zijn vrij van cellen klonteren, melanisatie gebreken weefsel vuil of andere verontreinigingen. Daarom hemocyten gemakkelijk kunnen worden waargenomen en geteld onder de microscoop en diverse insecten kunnen worden waargenomen binnen een paar Hosur. We hebben waargenomen dat de meeste hemocyten in onze monsters bestonden uit plasmatocytes 3 (hemocyten verspreiden asymmetrisch) (Figuur 4). We momenteel karakterisering van de hemocyte types in de rupsen in detail (Stoepler et al.., Ongepubliceerde data). De hier beschreven methode biedt een snelle en nauwkeurige methode voor het tellen van het totaal hemocyte nummers voor afzonderlijke rupsen verzameld uit veldexperimenten.
Hoewel hemocyte dichtheid kan sterk variëren tussen en binnen de insectensoorten 1 </ Sup>, vonden we dat hemocyte nummers voor L. Fasciola rupsen variëren van 1,10 x 10 6 tot 8,23 x 10 6 cellen / ml hemolymfe (gemiddelde: 3.51 x 10 6, n = 31 rupsen) en in het bereik van eerder gerapporteerde waarden in andere species lepidoptera 14.
Figuur 1 Foto van een voorlaatste instar Lithacodes Fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Rups. Typische lichaamslengte van deze rupsen varieert van 10-15 mm in de voorlaatste naar de ultieme stadia. Photo credit: John T. Lill.
Figuur 2. Injectienaald setup. Een glazen spuit is verbonden met een capillaire naald via een stomp uiteinde naald en kunststofbuizen (panelen 1-4). Een kunststof klei wordt gebruikt om de capillaire naald (5) rusten. De rups wordt in een petrischaal voor injectie met het verzamelen oplossing (6).
Figuur 3. Hemocyte extractiemethode. (A) De gekoelde rups wordt ingespoten met het verzamelen oplossing, (b) na injectie, de rups lichaam enigszins zwellen en de geïnjecteerde insect mag op ijs rusten gedurende 30 min, (c, d) een snede gemaakt met een schone scalpel wordt de rups geperst met een paar plastic tang de hemolymfe dwingen uit het lichaam via de incisie en hemocyten worden verzameld met een pipet, (e) hemocyten worden geteld met een hemocytometer.
Figuur 4. Microscopy picture met geëxtraheerde hemocyten van Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) rupsen (vergroting: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Werkwijzen voor het extraheren van hemocyten medisch belangrijke lepidoptera insecten en insecten model eerder gemeld 9, 14. Hemocyte extractie zijn aangepast op basis van de insectensoorten, de ontwikkelingsfase van het insect en de morfologische kenmerken. Zo kan hemolymfe isolatie van Manduca larven gemakkelijk worden uitgevoerd door knippen de gebogen hoorn het einde van de buik 15. Omdat slug rupsen (Limacodidae) missen deze buik structuur, hebben we een aparte protocol voor hemolymfe extractie uit kleine veld verzamelde rupsen. Deze methode blijkt efficiënt te isoleren voldoende hemolymfe volumes met grote aantallen hemocyte cellen die kunnen worden opgeslagen of verwerkt voor verdere experimenten. Bovendien hemocyte verzameling van volwassen muskieten omvat een tijdrovende stap die het zorgvuldig verwijderen van de poten, vleugels en de punt van de buik 16 omvat
We zijn van plan om deze methode te gebruiken in toekomstige studies naar morfologisch hemocyte celtypes karakteriseren van verschillende ontwikkelingsstadia van het bos geoogst rupsen. Deze test kan ook de eerste kritische stap voor het isoleren van gezonde hemocyten te onderzoeken in detail verschillende fysiologische aspecten van het insect cellulaire immuunreactie, inclusief het effect van verschillende ontwikkelingsstadia en nutritionele omstandigheden op het totale aantal hemocyten in naïeve of geïnfecteerde rupsen verkregen uit hun natuurlijke omgeving. Gezien de chronische blootstelling van Lepidoptera larven een aantal verschillende pathogenen in de natuur, alsook de potentieel continue aanwezigheid van de microbiële symbionten, wordt verwacht dat deze insecten soorten hemocyten bezitten met verschillende eigenschappen ten opzichte van immuuncellen in het laboratorium gekweekte insecten. Bovendien kan deze hemocyte extractieprotocol ook worden toegepast op studies met andere groepen insecten, waardoor immunologische assays verband moet in ecologisch veldonderzoek waardoor ons begrip van cellulaire afweermechanismen in non-model insectensoorten van landbouw-of ecologische belang. Tot slot, onze methode zal een waardevolle bron aan insecten biologen, ecologen en diegenen die geïnteresseerd zijn in het begrijpen van de functionele wisselwerking tussen hemocyte overvloed en het vermogen van wilde insecten populaties aan microbiële of parasiti weerstaanc infecties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
TMS werd gesteund door de Harlan Trust Fellowship (GWU) tijdens deze studie. Financiering voor veld verzamelen en kweken van L. Fasciola en E. delphinii werd verstrekt door NSF subsidie DEB 0642438 naar JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
