Summary
昆虫血球は、昆虫開発のすべての段階を通して免疫および非免疫の両方の多くの重要な機能を、実施しています。血球の種類と機能の私達の現在の知識では、昆虫の遺伝的モデルに関する研究から得られている。ここでは、野生の毛虫から血球を定量化し、可視化、抽出するための方法を提示する。
Abstract
昆虫血球は（哺乳類白血球に相当）昆虫のライフサイクル全体で1いくつかの生理学的過程において重要な役割を果たしている。鱗翅目（蛾や蝶）や双翅目（ハエ真）の受注に属する昆虫の幼虫の段階では、血球はリンパ腺（専門造血器官）や胚細胞から形成され、大人の段階まで行うことができる。胚性血球細胞は、炎症時の開発および走化性調節における細胞遊走に関与している。彼らはまた、細胞のアポトーシスに参加し、胚発生に必須である2。血球は、細胞拡散、細胞凝集、結節の形成、食作用および外国の侵略者3のカプセル化などのいくつかの機能を含む昆虫自然免疫応答の細胞アームを仲介する。彼らは、広報など、また、感染時に特定の昆虫の体液性防御をオーケストレーションするための責任がある抗菌ペプチドおよび他のエフェクター分子4,5のoduction。血球形態と機能は、主にショウジョウバエ、 キイロショウジョウバエ 6,7、蚊ネッタイシマカやハマダラカ 8,9とスズメガの幼虫、 たばこスズメガ 10、11を含む、遺伝的または生理学的な昆虫モデルで研究されてきた。しかし、少しの情報は、現在野生の12から収集されたもの、特に、非モデル昆虫種の血球の多様性、分類、形態と機能について存在する。
ここでは、野生の毛虫から血球を抽出するためのシンプルで効率的なプロトコルを記述します。我々は最後から二番目の齢Lithacodes蛭 （黄色肩幅のスラグ蛾）（ 図1）とEuclea delphinii（とげのオーク·スラグ）幼虫（鱗翅目：Limacodidae）を使用し、体液の十分なボリューム（昆虫血液）を表示単離され、血球の数値は個々の幼虫からカウントすることができます。この方法は効率的にこれらの種においてだけでなく、フィールドから収穫他の関連する鱗翅目の幼虫における血球の種類を研究するために使用することも、容易に微生物や寄生生物13感染後血球機能を調査するために設計された免疫学的測定法と組み合わせることができます。
Protocol
1。材料の準備
- ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブとマイクロピペットプラーを使用して針（1-2μmの先端と3〜4mmのテーパー）を準備します。機器設定：ランプ：561;速度：20;熱：560;ディレイ：1;プル：100;圧力：500。
- ウシ胎児血清（FBS）の10％および抗凝固バッファの20％（98 mMのNaOHを用い、186のNaCl、1.7mMのEDTAおよび41 mMクエン酸、pH 4.5を補ったグレース培地（GM）の60％捕集溶液を調製）。上記溶液を滅菌条件下で新たに調製し、常に氷上に維持されています。
- GMの90％FBSを10％ウシ：インキュベーション緩衝液を準備します。このソリューションは、新たに調製し、常に氷上に維持されています。
- 少なくとも15μlの合計×収集·インキュベーション·ソリューションの両方の昆虫の数を準備します。
2。コレクション·ソリューションとの毛虫の注入
- 最後から二番目のプラグを麻酔血球抽出に先立って20分間氷上でそれらを冷却することによりタールの幼虫。
- 20ミリリットルのガラス製注射器（ 図2）に接続されているチューブにきれいな毛管針（16ゲージ）の鈍端を取り付けます。収集ソリューションは、ラボ·ベンチで開いて、ゆっくりと緩衝液を用いてキャピラリーを埋める入ったチューブのままにしておきます。毛細血管は、通常毛虫のサイズに応じて、収集ソリューションの約10〜15μlで満たされている（毛虫合計体重の10 mg当たり約1μlの溶液=総体重の0.01％）。解剖顕微鏡の横に配置された粘土のボールの上に針を置きます。
- ペトリ皿に毛虫を置きます。昆虫は、気門が（ 図3）はっきりと見えるように、その側に配置されるべきである。
- 解剖顕微鏡で見ながら、ピンセットで所定の位置に毛虫を保持し、気門の1つに針の近くに配置する場所で宗派のキューティクルは、一般的に軟質である。優しく昆虫の身体に対してキャピラリーニードルを押してください。針がキューティクルに浸透した後は、キャタピラ（ 図3）に溶液の全体積を注入します。毛虫に気泡を注入避けることが重要である。毛虫の体は注射後（ 例えば 、20％の体積の増加）膨潤するが、破裂したり、にじみ出るべきではありません。
- 傷（ 図3）から漏れるのを防ぐためにバッファ背虫を配置し、氷に毛虫を返します。
- 体液の抽出に使用される各毛虫の手順2.1から2.4を繰り返します。この段階では、すべての昆虫が進む前に、30分間氷上で冷却することができます。
3。血液細胞の抽出
- 解剖顕微鏡下でシャーレに毛虫を置きます。
- 無菌scalpeを使用して毛虫の臼歯部では浅い（2-3 mm長）を切開する L（ 図3）。腸や他の臓器に損傷を与えないように注意してください。目標は慎重に穿刺にキューティクルであり、個々の昆虫から血球を含有する緩衝液/血リンパミックスを収集します。
- 10μlのピペットチップで体液ミックス（約10〜20μl）を収集しながら、再び内部の組織（ 図3）を傷つけないように注意しながら、柔軟なプラスチック製のピンセットを使って静かに毛虫を絞る。血リンパは毛虫の体から搾り液滴から収集されます。毛虫の遺体を捨ててください。
- 別のラベルの付いたシリコーン処理、0.5mlのマイクロ遠心チューブに、個々の毛虫から体液を採取します。
- 個々の毛虫から収集された各体液試料にインキュベーション溶液の等量（約10〜20μl）を追加します。すべての回で氷の上に体液サンプルを保管してください。
- 実験に用いた各毛虫の手順3.1から3.5を繰り返します。
- 体液試料および血球計数直前に培養液を混ぜる。この治療法は、血球の適切な分離を可能にし、凝集を防ぐことができます。
- 血球計算板の上に、インキュベーション溶液と混合体液サンプル10μlを転送するためにクリーンなピペットチップを使用しています。
- 血球計算板の中央グリッド（ 図3）の化合物の顕微鏡を使用して、大きい正方形（0.1ミリメートル：0.04ミリメートル2、深さが1の正方形の面積）の少なくとも15の血球の数をカウントし、記録します。 15正方形の血球数の総和を得るためにこれらの値を追加します。
- 徹底的に蒸留、脱イオン水で洗浄瓶を用いて血球計算板とカバーのスライドを洗浄し、各サンプル間キムワイプ（キンバリークラーク）で拭いて乾かしてください。
- 各体液サンプルについてステップ4.1から4.4を繰り返します。
- 血リンパvolumのmlあたり血球の平均数を計算次のように各毛虫のe、：
血球計算グリッドの各四角形の総容積：（0.04 mm 2の面積）×（0.1ミリメートルの深さ）= 0.004ミリメートル3×15乗= 0.06ミリメートル3全15カウントの正方形=総量。
（全15カウントの正方形/総量カウント15の正方形の血球の総数の合計）×2希釈係数=血球/ mm 3の数×1,000 =血球/体液のミリリットル数。
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Representative Results
本明細書中で説明されたプロトコルは、個々の幼虫から昆虫体液の10〜20μlの最小体積の収集を可能にします。このメソッドを使用して収集血球は細胞凝集、メラニンの欠陥、組織片などの汚れから保護されています。したがって血球は容易に顕微鏡下で観察し、計数することができ、いくつかの昆虫が少ないホスール内で観察することができます。私たちは、サンプル中の血球の大部分はplasmatocytes 3（血球が非対称的に広がって）（ 図4）から成っていたことを観察した。我々は現在、（Stoepler ら 、未発表データ）は詳細にこれらの毛虫で見つかった別の血 球タイプを特徴付けるされています。ここで説明する方法は、フィールド実験から収集された個々の幼虫の総血球数をカウントするための迅速かつ正確な手段を提供します。
血球密度は1〜昆虫種内大幅に異なりますが</>をSUP、我々が発見したLの血球数値肝蛭の幼虫の1.10×10 6の範囲- 8.23×体液の10 6細胞/ ml（平均値：3.51×10 6であり、n = 31毛虫）、および他の鱗翅目の種14で以前に報告された値の範囲内にある。
図1の最後から二番目の齢Lithacodes蛭 （鱗翅目：Limacodidae）の写真。毛虫。これらの毛虫の典型的な体長は究極齢に最後から二番目の10〜15 mmの範囲である。写真クレジット：ジョンT.リル。
図2：注射針のセットアップ。ガラスシリンジは、平滑末端針とプラスチックチューブを介してキャピラリーニードルに接続されている（パネル1-4）。プラスチック粘土の作品は、キャピラリーニードル（5）を休ませるために使用されます。毛虫は、収集ソリューション（6）注射用シャーレに入れています。
図3血球抽出方法。 （a）はチルド毛虫は、回収溶液を注入され、（b）以下の注入は、毛虫の体がわずかに膨潤され、注入された昆虫は、氷上で30分間静置していること、（c、d）のカットを使用して行われきれいなメス、毛虫は切開を通して体内の体液を強制的にプラスチック製のピンセットを使用して圧迫され、血球をピペットで回収されること、（e）血球は血球計数器を用いてカウントされます。
図4顕微鏡π毛虫（倍率20倍）：Euclea delphinii（Limacodidae鱗翅目）から抽出された血球を示し影。
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Discussion
医学的に重要な昆虫や鱗翅目昆虫のモデルから血球を抽出するための方法は、以前に9、14が報告されている。血球抽出方法は、昆虫種によると、昆虫とその形態学的特徴の発達段階に適応している。たとえば、 マンドゥカの幼虫体液から分離は容易に腹部15の端の近くに湾曲した角を切り取ることによって行うことができる。ナメクジの幼虫（Limacodidae）この腹部構造を欠いているため、我々は、小型のフィールド収集幼虫から体液を抽出するための異なったプロトコルを開発してきました。この方法はさらに、実験のために保存したり、処理することができる血球多数の細胞を含む十分な血リンパボリュームを分離するための効率的な証明している。また、蚊の成虫から血球コレクションは足、翼と腹部16の先端を慎重に除去を含む時間のかかる工程を含む
私たちは、形態学的に森林伐採毛虫の異なる発生段階から血球細胞型を特徴付けるために今後の研究では、このメソッドを利用しようとする。このアッセイはまた、HEMOの総数上の様々な発達段階や栄養条件の影響を含めて詳細に昆虫細胞性免疫応答のいくつかの生理学的側面を検討し、健康な血球を分離するための最初の重要なステップを提供することができますそれらの自然環境から得られたナイーブまたは感染幼虫でcytes。性質の異なる病原体の範囲、ならびにそれらの微生物の共生の可能性のある継続的な存在への鱗翅目幼虫の慢性暴露を考えると、それは研究室で育てられたで見つかった免疫細胞に比べて、これらの昆虫は、異なる特性を持つ血球の種類を持っていることが予想される昆虫。また、この血球抽出プロトコルは、このように、農業や生態系の非モデル昆虫種における細胞防御メカニズムの理解を増加させる、免疫関連のアッセイは生態学的なフィールド研究に組み込むことができ、昆虫の他のグループとの研究にも適用することができます重要。結論として、我々の方法は、昆虫学者、エコロジストと血球量と微生物またはparasitiに耐える野生昆虫集団の能力との間の機能的相互作用を理解することに興味がある方に貴重なリソースを提供しますcの感染症。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
TMSは、この研究の間にハーラン·トラスト·フェローシップ（GWU）によってサポートされていました。フィールドコレクションと繁殖L.のための資金蛭とE. delphiniiは JTLにNSFの助成DEB 0642438によって提供されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
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