Summary
Insekt hemocytes utføre mange viktige funksjoner, både immune og ikke-immune, gjennom alle stadier av insekter utvikling. Vår nåværende kunnskap om hemocyte typer og funksjon kommer fra studier på insekt genetiske modeller. Her presenterer vi en metode for å trekke ut, kvantifisere og visualisere hemocytes fra ville larvene.
Abstract
Insect hemocytes (tilsvarer mammalske hvite blodlegemer) spiller en viktig rolle i flere fysiologiske prosesser gjennom et insekt livssyklus 1. I larvestadier av insekter som tilhører ordre fra Lepidoptera (møll og sommerfugler) og tovinger (sanne fluer), er hemocytes dannet fra lymph kjertel (en spesialisert blodkreft organ) eller embryonale celler og kan bli gjennomført til det voksne stadiet. Embryonale hemocytes er involvert i celle migrasjon under utvikling og chemotaxis regulering ved betennelse. De tar også del i celle apoptose og er avgjørende for embryogenese 2. Hemocytes megle cellenivå arm av insekt medfødte immunforsvaret som inkluderer flere funksjoner, for eksempel celle spredning, celle aggregering, dannelsen av knuter, fagocytose og innkapsling av utenlandske inntrengere 3. De er også ansvarlig for iscenesetter spesifikke insekt humorale forsvar under infeksjonen, som produksjon av antimikrobielle peptider og andre effektor molekyler 4, 5. Hemocyte morfologi og funksjon er i hovedsak blitt studert i genetiske eller fysiologisk insekt modeller, inkludert bananflue, Drosophila 6 melanogaster, 7, myggen Aedes aegypti og Anopheles gambiae 8, 9 og tobakk hornworm, Manduca 10 sexta, 11. Det finnes imidlertid lite informasjon foreløpig om mangfold, klassifisering, morfologi og funksjon av hemocytes i ikke-modell insektarter, særlig de hentet fra naturen 12.
Her beskriver vi en enkel og effektiv protokoll for å trekke hemocytes fra ville larvene. Vi bruker nest siste stadium Lithacodes fasciola (gul-shouldered slug møll) (figur 1) og Euclea delphinii (spiny eik slug) sommerfugllarver (Lepidoptera: Limacodidae) og viser at tilstrekkelige mengder hemolymph (insekt blod)kan bli isolert og hemocyte numre regnet fra individuell larver. Denne metoden kan brukes til å effektivt studere hemocyte typer i disse artene samt i andre relaterte lepidopteran sommerfugllarver høstes fra feltet, eller den kan lett kombineres med immunologiske analyser for å undersøke hemocyte funksjon etter infeksjon med mikrobiell eller parasittiske organismer 13.
Protocol
1. Materiale Forberedelse
- Forbered nåler (1-2 mikrometer tips og 3-4 mm taper) ved hjelp av borosilicate glass kapillærrør og en mikropipette avtrekker. Instrumentinnstillinger: rampe: 561; hastighet: 20; varme: 560; forsinkelse: 1; pull: 100; trykk: 500.
- Klargjør samlingen løsning: 60% av Grace Medium (GM) supplert med 10% av føtalt bovint serum (FBS) og 20% av Antikoagulerende Buffer (98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA og 41 mM sitronsyre, pH 4,5 ). Den ovennevnte løsning er forberedt frisk under sterile betingelser og holdt på is til enhver tid.
- Klargjør inkuberingsbuffer løsning: 90% av GM supplert med 10% av FBS. Denne løsningen er også forberedt frisk og holdt på is til enhver tid.
- Forbered et totalt minst 15 ul × antall insekter for både innsamling og inkubasjonen løsningene.
2. Injeksjon av sommerfugllarver med Collection Solution
- Anesthetize nest siste instjære larver ved kjøling dem på is i 20 min før hemocyte utvinning.
- Monter den butte enden av en ren kapillær nål (16 gauge) inn i røret som er koblet til en 20 ml glassprøyte (figur 2). Forlate røret inneholdende samlingen løsningen åpne på lab benk og sakte fylle kapillæret med bufferen. Kapillæret er vanligvis fylt med ca 10-15 ul samling løsning, avhengig av størrelsen av larven (ca. 1 ul løsning per 10 mg caterpillar total kroppsmasse = 0,01% av total masse). Hvil nålen på en ball av leire som er plassert ved siden av den disseksjonsmikroskop.
- Plasser larven i en petriskål. Insekt bør plasseres på siden, slik at de er lett synlige spiracles (Figur 3).
- Mens du ser under et disseksjonsmikroskop, holder larven på plass med en pinsett og plassere nålen nær ett av spiracles, hvor isekt cuticle er generelt mykere. Trykk forsiktig kapillær nålen mot kroppen av insekt. Når nålen har trengt skjellaget, injisere det totale volumet av løsningen i larven (figur 3). Det er viktig å unngå å injisere luftbobler inn larven. Larven kropp vil hovne opp (f.eks øke i volum med 20%) etter injeksjon, men bør ikke sprekke eller slam.
- Returner larven til isen, posisjonering insekt dorsalt unngå buffer lekker ut av såret (Figur 3).
- Gjenta trinn 02.01 til 02.04 for hver caterpillar brukes til hemolymph utvinning. På dette stadiet, at alle insekter å slappe av på isen i 30 minutter før du fortsetter.
3. Utvinning av Hemocytes
- Plasser larven i en petriskål under disseksjonsmikroskop.
- Foreta en grunne (2-3 mm lang) innsnitt i bakre område av larven med en steril scalpe l (figur 3). Pass på å ikke skade tarmen eller andre indre organer, og målet er å punktere cuticle nøye og samle buffer / hemolymph blanding som inneholder hemocytes fra individuelle insekter.
- Klem larven forsiktig ved hjelp av fleksible plast tang mens samle den hemolymph mix (ca 10-20 ul) med en 10 pl pipettespiss, igjen tar seg ikke å skade de interne vev (figur 3). Hemolymph er hentet fra dråpen presset fra larven kropp. Kast caterpillar levninger.
- Samle hemolymph fra hver enkelt larve i separate merket silikonisert 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- Legg likt volum av inkuberingen løsning (ca. 10-20 pl) til hver hemolymph prøve samlet fra en individuell kålorm. Hold hemolymph prøver på isen hele tiden.
- Gjenta trinn 03.01 til 03.05 for hver larven brukt i forsøket.
- Bland hemolymph prøve og inkubering løsning umiddelbart før telling hemocytes. Denne behandlingen sørger for riktig separasjon av hemocytes og hindrer klumper.
- Bruke en ren pipettespiss å overføre 10 ul hemolymph prøven blandet med inkubering løsningen på en hemocytometer.
- Hjelp av et sammensatt mikroskop, telle og registrere antall hemocytes i minst 15 av de store kvadrater (område på en kvadrat: 0,04 mm 2, dybde: 0,1 mm) av den sentrale rutenett av hemocytometer (Figur 3). Legg disse verdier for å oppnå en total sum av antall hemocytes i de 15 kvadrater.
- Skyll hemocytometer og dekselet lysbilde grundig med en vask flaske med destillert og avionisert vann og tørk av med Kimwipes (Kimberly-Clark) mellom hver prøve.
- Gjenta trinn 04.01 til 04.04 for hver hemolymph prøve.
- Beregn gjennomsnittlig antall hemocytes per ml hemolymph volume for hver caterpillar, som følger:
Totalt volum av hver rute av hemocytometer rutenettet: (0,04 mm 2 område) x (0,1 mm dybde) = 0,004 mm 3 × 15 kvadrater = 0,06 mm 3 = det totale volum av alle 15 telles kvadrater.
(Sum av det totale antallet av hemocytes i de 15 firkanter telles / det totale volumet av alle 15 telles firkanter) x 2 fortynningsfaktor = antall hemocytes / mm 3 x 1.000 = antall hemocytes / ml hemolymph.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollen beskrevet heri tillater innsamling av et minimum volum på 10-20 pl insektvoks hemolymph fra individuelle larvene. Hemocytes samlet ved hjelp av denne metoden er fri for celle klumper, melanization defekter, vev rusk eller andre forurensninger. Derfor hemocytes kan lett observeres og telles under mikroskop, og flere insekter kan observeres i løpet av få Hosur. Vi observerte at flertallet av hemocytes i våre prøver besto av plasmatocytes 3 (hemocytes sprer asymmetrisk) (figur 4). Vi er for tiden karakterisere de ulike hemocyte typene finnes i disse larvene i detalj (Stoepler et al. Upubliserte data). Metoden er beskrevet her gir en rask og nøyaktig måte for telling totalt hemocyte tall for individuelle sommerfugllarver samlet inn fra feltforsøk.
Selv hemocyte tetthet kan variere sterkt mellom og innenfor insektarter 1 </ Sup>, fant vi ut at hemocyte tall for L. fasciola sommerfugllarver spenner fra 1,10 x 10 6 til 8,23 x 10 6 celler / ml av hemolymph (middelverdien: 3,51 x 10 6, n = 31 Larvene), og er i området fra tidligere rapporterte verdier i andre lepidopteran arter 14.
Figur 1 Fotografi av en nest siste stadium Lithacodes fasciola (Lepidoptera: Limacodidae). Caterpillar. Typisk kroppslengde på disse larvene varierer fra 10-15 mm i nest siste til ultimate instars. Photo credit: John T. Lill.
Figur 2. Injeksjonsnål oppsett. En glassprøyte er koblet til en kapillær nål via en stump ende nål og plastrør (paneler 1-4). Et stykke plast leire brukes til hvile kapillær nålen (5). Larven er plassert i en petriskål injeksjonsvæske med samlingen løsningen (6).
Figur 3. Hemocyte utvinning metoden. (A) Den avkjølte larven er injisert med samlingen løsningen, (b) etter injeksjon, vil larven kropp svelle litt, og det injiserte insekt får hvile på is i 30 min, (c, d) et kutt er gjort ved hjelp av en ren skalpell, blir larven klemt ved hjelp av en par av plast pinsettangens å tvinge hemolymph ut av kroppen gjennom snittet og hemocytes samles med en pipette, (e) hemocytes telles ved hjelp av en hemocytometer.
Figur 4. Mikroskopi picture viser utdraget hemocytes fra Euclea delphinii (Lepidoptera: Limacodidae) sommerfugllarver (forstørrelse: 20x).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metoder for å trekke hemocytes fra medisinsk viktige insekter og lepidopteran modell insekter har tidligere blitt rapportert 9, 14. Hemocyte ekstraksjonsmetoder metoder tilpasses studentens insektarter, utviklingsstadiet av insekt og dens morfologiske egenskaper. For eksempel, kan hemolymph isolasjon fra Manduca larver lett utføres ved snipping den buede hornet nær slutten av buken 15. Fordi slug sommerfugllarver (Limacodidae) mangler denne abdominal strukturen, har vi utviklet en distinkt protokoll for hemolymph utvinning fra små-sized felt-samlet larvene. Denne metoden viser effektiv for å isolere tilstrekkelig hemolymph volumer som inneholder store mengder hemocyte celler som kan lagres eller behandles for videre eksperimentering. I tillegg inneholder hemocyte samling fra voksen mosquitoes en tidkrevende trinn som involverer en forsiktig fjerning av ben, vinger og spissen av magen 16
Vi har til hensikt å utnytte denne metoden i fremtidige studier til morfologisk karakterisere hemocyte celletyper fra ulike utviklingsstadier av skog-høstes larvene. Denne analysen kan også gi den første kritiske trinnet for isolere sunne hemocytes å undersøke i detalj flere fysiologiske aspekter av insekt cellulære immunrespons, herunder virkningen av ulike utviklingsstadier og ernæringsmessige forhold på det totale antallet av hemocytes i naive eller infiserte larver innhentet fra sine naturlige omgivelser. Gitt kronisk eksponering av lepidopteran larver til en rekke forskjellige patogener i naturen, samt potensielt kontinuerlig tilstedeværelse av deres mikrobielle symbionter, er det forventet at disse insektene besitter typer hemocytes med forskjellige egenskaper i forhold til immunceller funnet i laboratoriet reared insekter. I tillegg kan denne hemocyte ekstraksjon protokollen også påføres til studier med andre grupper av insekter, slik immunologiske-relaterte analyser for å bli innlemmet i økologiske feltstudier, og dermed øke vår forståelse av cellulære forsvarsmekanismer i ikke-modell insektarter for landbruks-eller økologiske betydning. I konklusjonen, vil vår metode gir en verdifull ressurs for insekt biologer, økologer og de som er interessert i å forstå den funksjonelle samspillet mellom hemocyte overflod og evne ville insektpopulasjoner å tåle mikrobiell eller parasitic infeksjoner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
TMS ble støttet av Harlan Trust Fellowship (GWU) i denne studien. Midler til feltet innsamling og avl L. fasciola og E. delphinii ble levert av NSF stipend DEB 0642438 til JTL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
