Summary
Böcek hemocytes böcek tüm gelişim aşamalarında immün ve non-immün hem de pek çok önemli fonksiyonları, yürütmek. Hemocyte türleri ve işlev Bizim bugünkü bilgi böcek genetik modeller üzerinde çalışmalar geliyor. Burada, biz, ayıklanması ve niceleme yabani tırtıllar gelen hemocytes görselleştirmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Böcek hemocytes (memeli beyaz kan hücreleri eşdeğer) bir böceğin yaşam döngüsü 1 boyunca birçok fizyolojik olayda önemli bir rol oynamaktadır. Lepidoptera (güveler ve kelebekler) ve Diptera (gerçek sinekler) emrine ait böceklerin larva evrelerinde hemocytes lenf bezi (özel hematopoetik organı) veya embriyonik hücrelerden oluşur ve erişkin aşamasına kadar yapılabilir. Embriyonik hemocytes inflamasyon sırasında gelişen ve kemotaksis düzenlenmesi sırasında hücre göçü katılmaktadırlar. Onlar da hücre apoptozu katılabilir ve embriyogenesis 2 için gereklidir. Hemocytes, hücre yayılması, hücre agregasyonu, nodül oluşumu, fagositoz ve yabancı işgalciler 3 kapsülleme gibi çeşitli fonksiyonları içeren böcek doğal immün yanıtın hücresel kolu arabuluculuk. Bunlar pr gibi, aynı zamanda enfeksiyon sırasında belirli böcek humoral savunma düzenlemekten sorumludur, antimikrobiyal peptitler ve diğer efektör moleküller 4, 5 oduction. Hemocyte yapısının ve fonksiyonunun başlıca meyve sineği, Drosophila melanogaster 6, 7, sivrisinekler Aedes aegypti ve Anopheles gambiae 8, 9 ve tütün hornworm, Manduca Sexta 10, 11 de dahil olmak üzere, genetik ya da fizyolojik böcek modellerinde çalışıldığı edilmiştir. Ancak, çok az bilgi şu anda çeşitliliği, sınıflandırılması, morfolojisi ve özellikle non-model böcek türleri, yaban 12 toplanan olanlarda hemocytes işlevi hakkında var.
Burada yabani tırtıllar gelen hemocytes ayıklamak için basit ve etkili bir protokol açıklar. Biz sondan instar Lithacodes Fasciola (sarı-omuzlu slug güvesi) (Şekil 1) ve Euclea delphinii (dikenli meşe slug) tırtılların (Lepidoptera: Limacodidae) kullanın ve gösteriyor ki hemolimf, yeterli miktarda (böcek kan)izole edilmiş ve hemocyte sayıda bireysel larva sayılabilir. Bu yöntem, verimli bir şekilde bu tür hem de tarla hasat ilgili diğer lepidopteran tırtılların içinde hemocyte türleri çalışmak için kullanılabilir, ya da kolayca mikrobiyal veya parazit organizmalar ile enfeksiyonu takiben 13 hemocyte araştırmak üzere tasarlanmış imünolojik deneylerlerde ile kombine edilebilir.
Protocol
1. Malzeme Hazırlanması
- Borosilikat cam kapiller tüplerin ve mikropipet çektirmenin kullanarak iğne (1-2 mikron ucu ve 3-4 mm konik) hazırlayın. Cihaz ayarları: rampa: 561; hızı: 20; ısı: 560; gecikmesi: 1; çekme: 100; basıncı: 500.
- Sığır fetüs serumu (FBS) ve% 10 ve Antikoagülan tamponu (% 20 98 mM NaOH, 186 mM NaCI, 1.7 mM EDTA, 41 mM sitrik asit, pH 4.5 ile desteklenmiş Grace Medium (GM),% 60: toplama çözeltisi hazırlayın ). Yukarıdaki çözelti, steril koşullar altında, taze hazırlanmış ve her zaman buz üzerinde tutulur.
- GM% 90 FBS% 10 oranında arttırılmıştır: inkübasyon tampon çözeltisi hazırlayın. Bu çözüm ayrıca taze hazırlanan ve her zaman buz üzerinde tutulur.
- En az 15 ul toplam x toplama ve inkübasyon çözüm hem böceklerin sayısı hazırlayın.
2. Koleksiyon Çözüm ile Tırtıllar Enjeksiyon
- Sondan ins uyuşturhemocyte ekstraksiyon öncesinde 20 dakika süreyle buz üzerinde ürpertici tarafından tar larva.
- 20 ml'lik bir cam şırıngaya (Şekil 2) bağlı olan bir boru sistemi içine temiz bir kılcal iğne (16-gauge) sivri ucu monte edin. Toplama çözeltisi ve laboratuar tezgahının üstüne açmak ve yavaş yavaş tampon ile doldurmak kılcal boru içeren bırakın. Kılcal genellikle tırtıl ve boyutuna bağlı olarak, toplama çözeltisi, yaklaşık 10-15 ul ile doldurulur (tırtıl tüm vücut kütlesinin 10 mg başına yaklaşık olarak 1 ul solüsyon = tüm vücut kütlesinin% 0.01). Diseksiyon mikroskobu yanına yerleştirilen bir kil topu iğne dinlendirin.
- Bir Petri kabındaki tırtıl yerleştirin. Böcek spiracles (Şekil 3) açık bir şekilde görünür hale gelir ki, yan üzerinde konumlandırılmalıdır.
- Diseksiyon mikroskop altında görüntülerken, forseps bir çift ile yerde tırtıl tutun ve spiracles biri için iğne yakın yerleştirdiğiniz yere içindemezhep kütikül genellikle yumuşaktır. Yavaşça böceğin vücudunda karşı kılcal iğne basın. Iğne manikür nüfuz sonra, tırtıl (Şekil 3) içine çözeltinin toplam hacmi enjekte. Bu tırtıl içine hava kabarcıkları enjekte önlemek için önemlidir. Tırtıl vücut enjeksiyonu takiben (örneğin,% 20 oranında hacim artışı) şişer ancak patlama veya sızmak gerekir.
- Yara (Şekil 3) dışarı sızmasını önlemek için tampon dorsal böcek konumlandırma, buz tırtıl dönün.
- Tekrar hemolimf ekstraksiyonu için kullanılan her tırtılın için 2,1-2,4 adımları. Bu aşamada, her haşarat devam etmeden önce, 30 dakika süreyle buz üzerinde soğuk izin verir.
3. Hemocytes çıkarımı
- Diseksiyon mikroskobu altında bir Petri kabındaki tırtıl yerleştirin.
- Steril bir scalpe kullanarak tırtıl posterior bölgede sığ bir (2-3 mm uzunluğunda) kesi olun l (Şekil 3). Hedefi dikkatle ponksiyon manikür ve bireysel böceklerden hemocytes içeren tampon / hemolimf karışımı toplamak; bağırsak ve diğer iç organları zarar vermemeye özen gösterin.
- 10 ul pipet ucu ile hemolimf karışımı (yaklaşık 10-20 ul) toplarken tekrar iç doku (Şekil 3) kesmemeye özen, esnek plastik forseps kullanarak hafifçe tırtıl sıkıştırın. Hemolimf tırtıl vücudundan sıkılmış damlacık toplanır. Tırtıl naaşı atın.
- Ayrı etiketli silikonlu 0,5 ml mikrosantrifüj tüpleri içine her tırtılın hemolimf toplayın.
- Bireyin tırtılın toplanan her hemolimf örnek inkübasyon solüsyonu eşit hacmi (yaklaşık 10-20 ul) ekleyin. Her zaman buz üzerinde hemolimf örnekleri tutun.
- Tekrar deneyde kullanılan her tırtılın için 3,1-3,5 adımları.
- Hemolimf örnek karıştırın ve önceden sayma hemocytes hemen inkübasyon çözüm. Bu tedavi hemocytes uygun bir şekilde ayrılmasına izin verir ve topaklanma önler.
- Hemasitometre üzerine inkübasyon çözelti ile karıştırılır hemolimf örnek 10 ul aktarmak için temiz bir pipet ucu kullanın.
- Bir bileşik mikroskop kullanarak, saymak ve büyük kareler en az 15 (kare bir alanı 0,1 mm: 0.04 mm 2, derinlik) olarak hemocytes sayısını kaydetmek hemasitometre merkezi ızgara (Şekil 3). 15 kare olarak hemocytes sayısının toplam miktar elde etmek için bu değerler ekleyin.
- Iyice distile ve deiyonize su ile yıkama şişesi kullanılarak hemasitometre ve kapak slaytı durulayın ve her bir örnek arasındaki Kimwipes (Kimberly-Clark) ile kurulayın.
- Tekrar her hemolimf örnek için 4,1-4,4 adımları.
- Hemolimf volum ml başına hemocytes sayısı ortalaması hesaplamaHer tırtıl için e aşağıdaki gibi:
Hemasitometre ızgaranın her karenin toplamı: (0.04 mm 2 alan) × (0.1 mm derinlik) = 0.004 mm 3 × 15 kare = 0,06 mm 3 tüm 15 sayılır kareler = toplam hacmi.
(15 sayılan tüm kareler / toplam hacim sayılan 15 kare olarak hemocytes toplam sayısının toplamı) x 2 seyreltme faktörü = hemocytes / mm 3 sayısı x 1000 = hemocytes / hemolimf ml sayısı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Burada açıklanan protokol bireysel tırtılların böcek hemolimf 10-20 ul en az hacim toplanmasını sağlar. Bu yöntemi kullanarak toplanan Hemocytes hücre topaklanma, melanization kusurları, doku artıkları veya diğer kirletici ücretsizdir. Dolayısıyla hemocytes kolayca gözlenir ve mikroskop altında sayılır, ve birkaç böcek birkaç Hosur içinde gözlenen edilebilirler. Biz bizim örneklerinde hemocytes çoğunluğu plazmatositler 3 (hemocytes asimetrik yayılma) (Şekil 4) oluştuğunu gözlemledik. Şu anda, detayın (Stoepler ve ark., Yayınlanmamış veriler), bu tırtıllar bulunan değişik türde hemocyte karakterize edilir. Burada anlatılan yöntemi tarla denemeleri toplanan bireysel tırtıllar için toplam hemocyte numaraları sayım için hızlı ve doğru bir araç sağlar.
Hemocyte yoğunluğu 1 ila böcek türleri içinde büyük ölçüde değişebilir rağmen </> Sup, bulduğumuz L. hemocyte numaraları Fasciola tırtıllar 1.10 'dan aralık × 10 6-8,23 × 10 6 hücre / hemolimf ml (ortalama: 3.51 × 10 6, n = 31 tırtıllar), ve diğer lepidopteran türler 14 önceden bildirilen değerler aralığındadır.
Şekil 1 sondan bir önceki evre Lithacodes Fasciola (Lepidoptera: Limacodidae) fotoğrafı. Tırtıl. Bu tırtıllar tipik vücut uzunluğu nihai larva dönemlerinde hiç sondan 10-15 mm arasında değişir. Fotoğraf kredi: John T. Lill.
Şekil 2. Enjeksiyon iğne kurulum. Bir cam şırınga, ucu sivri iğne ve plastik boru aracılığıyla bir kılcal iğne bağlanır (panelleri 1-4). Kil plastik bir parça kılcal iğne (5) geri kalanı için kullanılır. Tırtıl toplama çözeltisi (6) ile enjeksiyon için bir Petri tabağına yerleştirilir.
Şekil 3. Hemocyte ekstraksiyon yöntemi. (A) soğutulmuş tırtıl toplama çözeltisi ile enjekte edilir, (b) aşağıdaki enjeksiyon, tırtıl vücut hafifçe şişer ve enjekte böcek 30 dakika süreyle buz üzerinde durmasına izin verilir, (c, d) bir kesik kullanılarak yapılır Temiz bir neşter, tırtıl kesiden vücudun hemolimf çıkmaya zorlamak için plastik forseps bir çift kullanılarak sıkılır ve hemocytes bir pipet ile birlikte tahsil edilir; (e) hemocytes hemasitometre kullanarak sayılır.
Şekil 4. Mikroskopi pitırtıllar (büyütme: 20x): Euclea delphinii (Limacodidae Lepidoptera) adlı ayıklanan hemocytes gösteren cture.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tıbben önemli böcekler ve lepidopteran modeli böceklerden hemocytes ayıklamak için Yöntemler önce 9, 14 rapor edilmiştir. Hemocyte ekstraksiyon yöntemleri böcek türlerine göre uyarlanmış, böcek ve morfolojik özellikleri gelişim aşamasında. Örneğin, Manduca larva hemolimf izolasyonu kolayca karın 15 sonuna yakın kırpma kavisli boynuz ile gerçekleştirilebilir. Sümüklüböcek tırtıllar (Limacodidae) bu karın yapıdan yoksundur Çünkü, biz küçük ölçekli saha toplanan tırtılların gelen hemolimf çıkarılması için ayrı bir protokol geliştirmiştir. Bu yöntem, daha sonraki denemeler için saklanabilir veya işlenebilir hemocyte hücrelerin büyük sayılar içeren yeterli hemolimf hacimleri izole etmek için verimli kanıtlıyor. Buna ek olarak, erişkin sivrisinek hemocyte toplama dikkatli bacaklar çıkarılması, kanatlar ve karın 16 uç içeren bir zaman alıcı bir adım içerir
Biz morfolojik orman hasat tırtıllar farklı gelişim aşamalarında hemocyte hücre tipleri karakterize için gelecekte yapılacak çalışmalarda bu yöntemi kullanmak niyetinde. Bu tahlil da ayrıntılı olarak hemo toplam sayısı üzerinde çeşitli gelişim aşamalarında ve beslenme koşulları etkisi dahil böcek hücresel bağışıklık tepkisinin çeşitli fizyolojik açıdan, incelemek için sağlıklı hemocytes izole etmek için ilk olarak kritik aşama sağlayabilirkendi doğal ortamlarında elde edilen naif veya enfekte tırtıllar içinde cytes. Doğada farklı patojenlere yanı sıra bunların mikrobik simbiont potansiyel olarak sürekli varlığı bir dizi lepidopteran larvalarının kronik maruz kalma göz önüne alındığında, bu böcekler laboratuvar-yetiştirilen bulunan bağışıklık hücreleri ile karşılaştırıldığında, farklı özelliklere sahip hemocytes türleri sahip olması beklenmektedir böcekler. Buna ek olarak, bu hemocyte ekstraksiyon protokolü de böylece olmayan model böcek türlerinin hücresel savunma mekanizmaları anlayışımızı artırarak, immunolojik ilgili deneyleri ekolojik alanda çalışmalar dahil olmasını sağlayan diğer böcek grupları ile çalışmalar uygulanabilir tarım veya ekolojik önemi. Sonuç olarak, bizim yöntem böcek biyologlar, ekolojistler ve hemocyte bolluk ve mikrobiyal veya parasiti dayanacak yabani böcek populasyonlarının yeteneği arasındaki fonksiyonel etkileşimin anlaşılması ilgilenenler için değerli bir kaynak sağlayacaktırc enfeksiyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
TMS Bu çalışma sırasında Harlan Trust Bursu (GWU) tarafından desteklenmiştir. Alan koleksiyon için fon ve L. damızlık Fasciola ve E. delphinii JTL NSF hibe DEB 0642438 tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Borosilicate glass tubes | Sutter Instruments | B100-50-10 | OD: 1.0, ID: 0.50 mm |
| Grace's Medium | Sigma | G8142 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | SH3007102 | Heat inactivated |
| Dumont #5 Forceps | Fine science tools | 11252-40 | |
| Neubauer hemocytometer | Hausser Scientific | 3200 | |
| Plastic tubing | Tri-Tech | TT-3-32OD | OD: 3/32'', ID: 1/32' |
| Glass medical syringe | Fortuna Optima | D-97877 | 50 ml volume |
| Blunt end needle | Small Parts | NE-162PL-25 | 16 Gauge x 1" length |
References
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 22, 677 (2006).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (7), 542 (2007).
- Strand, M. R. The insect cellular immune response. Insect Sci. 15 (1), 1 (2008).
- Fauvarque, M. O., Williams, M. J. Drosophila cellular immunity: a story of migration and adhesion. J. Cell Sci. 124 (9), 1373 (2011).
- Nehme, N. T., Quintin, J., Cho, J. H., Lee, J., Lafarge, M. C., Kocks, C., Ferrandon, D. Relative roles of the cellular and humoral responses in the Drosophila host defense against three gram-positive bacterial infections. PLoS One. 6 (3), e14743 (2011).
- Ulvila, J., Vanha-Aho, L. M., Rämet, M. Drosophila phagocytosis - still many unknowns under the surface. APMIS. 119 (10), 651 (2011).
- Moreira, C. G., Regan, J. C., Zaidman-Remy, A., Jacinto, A., Praq, S. Drosophila hemocyte migration: an in vivo assay for directional cell migration. Methods Mol. Biol. 769, 249 (2011).
- Hillyer, J. F. Mosquito immunity. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 218 (2010).
- Castillo, J. C., Robertson, A. E., Strand, M. R. Characterization of hemocytes from the mosquitoes Anopheles gambiae and Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 36 (12), 891 (2006).
- Jiang, H., Vilcinskas, A., Kanost, M. R. Immunity in lepidopteran insects. Adv. Exp. Med. Biol. 708, 181 (2010).
- Eleftherianos, I., Xu, M., Yadi, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. Plasmatocyte-spreading peptide (PSP) plays a central role in insect cellular immune defenses against bacterial infection. J. Exp. Biol. 212 (12), 1840 (2009).
- Ribeiro, C., Brehélin, M. Insect haemocytes: what type of cell is that. J. Insect Physiol. 52 (5), 417 (2006).
- Beetz, S., Brinkmann, M., Trenczek, T. Differences between larval and pupal hemocytes of the tobacco hornworm, Manduca sexta, determined by monoclonal antibodies and density centrifugation. J. Insect Physiol. 50 (9), 805 (2004).
- Beetz, S., Holthusen, T. K., Koolman, J., Trenczek, T. Correlation of hemocyte counts with different developmental parameters during the last larval instar of the tobacco hornworm, Manduca sexta. Arch. Insect Biochem. Physiol. 67 (2), 63 (2008).
- Eleftherianos, I., Joyce, S., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Reynolds, S. E. Probing the tri-trophic interaction between insects, nematodes and Photorhabdus. Parasitology. 137 (11), 1695 (2010).
- Qayum, A. A., Telang, A. A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (51), e2772 (2011).
