Summary
Udformningen af en syntetisk operon kodende både den sekretoriske apparat og de strukturelle monomerer i curli fibre er beskrevet. Overproduktion af disse amyloider og adhærente polymerer giver en målbar gevinst for vedhæftning af den
Abstract
Den her beskrevne fremgangsmåde består i at omlægge E. coli-adhærensegenskaber ved at samle det mindste antal curli gener under kontrol af en stærk og metal-overinducible promotor og i visualisere og kvantificere den resulterende forstærkning af bakteriel vedhæftning. Denne metode gælder passende tekniske principper om abstraktion og standardisering af syntetisk biologi, og resultater på BBa_K540000 Biobrick (Bedste nye Biobrick enhed, manipuleret, iGEM 2011).
Det første trin består i udformningen af den syntetiske operon helliget curli overproduktion som reaktion på metal, og dermed at øge vedhæftningen evner af vildtypestammen. Den oprindelige curli operon blev ændret i silico for at optimere transkriptionelle og translationelle signaler og undslippe den "naturlige" regulering af curli. Denne fremgangsmåde gjorde det muligt at teste med succes vores nuværende forståelse af curli produktion. Moreover, forenkle curli regulering ved at skifte den endogene kompleks promotor (mere end 10 transkriptionelle regulatorer identificeret) til et enkelt metal-reguleret promotor gør vedhæftning meget lettere at kontrollere.
Det andet trin omfatter kvalitativ og kvantitativ vurdering af overholdelse evner ved implementering af simple metoder. Disse fremgangsmåder er anvendelige til en lang række af adhærente bakterier uanset biologiske strukturer involveret i biofilmdannelse. Overholdelse test i 24-brønds polystyrenplader giver en hurtig indledende visualisering af den bakterielle biofilm efter krystalviolet farvning. Dette kvalitative test kan skærpes ved kvantificering af den procentdel af overholdelse. En sådan fremgangsmåde er meget enkel men mere præcis end kun krystalviolet farvning som beskrevet tidligere 1 med både en god reproducerbarhed. Visualisering af GFP-mærkede bakterier på objektglas ved fluorescens eller laser confOcal mikroskopi tillader at styrke de opnåede resultater med den 24-brønds plade test ved direkte observation af fænomenet.
Introduction
Bakteriel tilslutning til abiotisk support spiller en vigtig rolle i bioremediering, biokatalyse eller mikrobiel brændselsceller. Bioremediering processer benytter kapacitet mikroorganismer til at nedbryde organiske stoffer, eller at ændre metalfordeling (immobilisering, flygtiggørelse) eller artsbestemmelse. Disse gavnlige aktiviteter er observeret i akvatiske og terrestriske økosystemer, men også i de kunstige systemer er udviklet til at behandle forurenet vand fra industri og husholdninger affald. Intensiteten og kvaliteten af den mikrobielle aktivitet afhænger af fysisk-kemiske faktorer, men også af livsstil af mikroorganismer (fritflydende eller indlejret i biofilm). The biofilmdannelse er forbundet med en metabolisme fremme resistens over for biocider ved forskellige mekanismer. Dette fænomen vil derfor fremmes i de fleste bioremediering processer. Desuden har engineering Escherichia coli-celler til kontrol af biofilmdannelse er blevet anvendt med succes tilimmobilisere helcelle-sensorer på biochips 2-3.
Tilpasning af mikroorganismer til høj koncentration af metaller sker via forskellige mekanismer såsom adsorption til ekstracellulære matrixkomponenter, aktivering af udstrømningspumpe eller specifikke bærere i stand til at koncentrere metallet ind i cellen. Fremme disse bakterielle aktiviteter via genteknologi muliggør effektiv og billig behandling af metal forurening i laboratorieskala, især i tilfælde af meget toksiske metaller i svag mængde som beskrevet af Raghu et al. 2008 4. Bakteriel rensning repræsenterer i dette tilfælde en konkurrencedygtig og omkostningsbesparende fremgangsmåde i forhold til klassiske kemiske processer ved hjælp af ionbytterharpikser. Forfatterne beskrev en E. coli chassis gensplejset for cobalt optagelse og retention ved først at banke det efflukspumpen kodende gen rcnA og derefter ved transformation med en multi kopi plasmid tillader overproduktion af ettransportør med præferentiel optagelse for cobalt. sådan stamme vises som et effektivt alternativ til ionbytterharpikser til behandling af radioaktivt spildevand, men et centralt uløst problem er genvinding af forurenede bakterier ved afslutningen af processen 4. Målet med vores arbejde var derfor at konstruere en specialdesignet stamme i stand til at holde sig til abiotiske bærere såsom glas eller plastik.
Blandt hele sættet af adhæsiner og klæbende fimbriae identificeret i Gram-bakterier, valgte vi at designe et system, der giver curli produktion. Curli er tynde (2-5 nm diameter) og stærkt aggregative amyloid fibre, der rager ud fra E. coli and Salmonella overflade som en ikke-krystallinsk og uopløselig matrix 5-7. Curli er også involveret i koloniseringen af abiotiske overflader og udvikling af biofilm 8. Curli blev for nylig vist at binde kviksoelvionerne 9. Amyloider er faktisk kendt for at besidde højaffinitet for metaller ioner, såsom Cu2 +, Zn2 + og Fe3 + 10. Denne egenskab kan yderligere forbedre dekontaminering af metal forurenede spildevand. CSG klynge er ansvarlig for produktionen af curli fibre og er udgøres af to divergerende transkriberede operoner (figur 1). The CSGB, csgA og csgC gener udgør den forstand operon, der koder for de to curli underenheder, CsgA og CSGB. CsgC synes at være involveret i redox aktivitet inden for curli Biogenese systemet og påvirke CsgG pore adfærd 11. Imidlertid fravær af csgC i de fleste curli-producerende bakterier indikerer, at det tilsvarende protein indeholder kun en sekundær grad af kontrol over curli biogenese. At forenkle systemet har vi valgt at arbejde med det mindste antal gener.
Den csgDEFG operonencodes proteiner, essentielle i forordningen og transportaf CsgA og CSGB til celleoverfladen. CsgD er en transskriptionel aktivator ifølge den csgBAC operonen og spiller en central rolle i kontrollen af biofilmdannelse ved at styre produktionen af curli fimbriae og andre biofilm komponenter såsom cellulose 12 og ved inhibering af flagel fremstilling 13. CsgE, CsgF og CsgG udgør en curli-specifikt sekretorisk apparat ydermembranen, hvorigennem det store curli underenhedsprotein CsgA udskilles som et opløseligt protein. Polymerisationen af CsgA afhænger in vivo af membranbundne kimdannelsesmiddel protein CSGB (gennemgået i 14). Komplekse regulatoriske veje, der involverer flere to-komponentsystemer er blevet vist at styre curli genekspression 15-16. Disse komplekse regler tillader bakterier til dannelse af tykke biofilm via curli produktion som reaktion på miljømæssige signaler, men er vanskelige at styre til industrielle anvendelser. For at lette inddrivelsen af The Metal-fyldte bakterier i en industriel proces, bakteriel fastgørelse til en fast bærer faktisk skal kontrolleres af veldefinerede parametre (ne). De adhærerende egenskaber curli hænger sammen med amyloid art 17 og kan anvendes til at forbedre bioremediering processer, men en enklere og let styret anordning skal oprettes.
Blandt disse syv gener 18, absolut et sæt af 5 kræves gener for curli syntese (CSGB og csgA kodende fibre monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, der koder for curli sekretion komplekset) blev udvalgt til konstruktion af syntetiske operon. At undslippe den "naturlige" regulering af curli, en syntetisk operon omfatter disse 5 CSG gener under kontrol af en stærk og kobolt-overinducible promotor (figur 2) blev designet og syntetiseret. Trin-for-trin analyse af curli-kodende region og design procedure for en funktionel SYNæstetiske operon beskrives. To metoder til at visualisere og kvantificere bakteriel vedhæftning til polystyren og glas er forklaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biobrick Design og syntese af Curli Operon
- Bestemme den genetiske organisation og lokalisere de endogene transkriptionelle og translationelle signaler fra curli gener. Disse informationer er samlet i specialiserede databaser, såsom RegulonDB a eller EcoGene b og afsluttet med en nærlæsning af relevante publikationer. Datastyring og in silico preanalysis blev udført med Clone Manager c..
- Vælge de relevante kodende sekvenser. Et sæt på fem absolut nødvendige gener for curli syntese (CSGB og csgA kodende fibre monomerer) og eksport (csgE csgF og csgG, der koder for curlin sekretion komplekset) blev udvalgt til konstruktion af syntetiske operon. Udtrække de udvalgte sekvenser fra databasen i FASTA-format.
Som csgGFE klynge er antisense i E. coli-genomet, omsætte denne sekvens i dens omvendte komplement counterpkunst ved hjælp af Klon Manager-værktøj operationer> Proces molekyle> Inverter molekyle. Indsæt csgEFG sekvens bag csgBA ved hjælp af funktionen "Liger" (Klon> Liger). - Tilsæt passende promotor. Ved at placere de fem udvalgte curli gener under kontrol af promotoren P RCN, er curli forudsiges at være over-produceres i nærvær af cobalt og nikkel. Den RCN locus koder for et udstrømningspumpe ansvarlig for Ni og Co afgiftning (rcnA) og dets beslægtede metallo-regulator (rcnR). RcnR kontrollerer ekspressionen af rcnA og egen-genet som reaktion på Ni og Co 19. The RCN sekvens omfattende rcnR CDS, hele RCN intergeniske region samt de 41 1. Nukleotider af rcnA var placedin foran csgBAEFG højtflyvende-sekvensen (figur 1, sekvensen af hele konstruktionen tilvejebringes som supplerende data).
- Optimere den transkriptionellesignaler. En perfekt ribosombindingssted (eller perfekt RBS = AAGGAGGTATATA) sattes foran det første ATG af csgBA DNA-sekvensen. En anden perfekt RBS blev tilsat foran csgEFG sekvens. Endogen RBS for CSGB og csgF og csgG generne blev bevaret.
- For at montere IGEM standarder, skal apparatet flankeret af en standard BioBrick præfiks og suffiks, der indeholder restriktionssteder for EcoRI, PstI (præfiks) og Spe og Xbal (suffiks). Indsæt de tilsvarende sekvenser i hver ende af indretningen d.
- Eliminere eventuelle EcoRI, PstI, Spe I og Xba I genkendelsessted i indretningen. For at lette yderligere samling proces kan BioBrick del selv ikke indeholder nogen af disse restriktionssteder. In silico restriktionsanalyse af indretningen afslørede en Pst I-stedet i csgA sekvensen, et PstI-sted i rcnR sekvensenog et EcoRI-site i csgE genet. Disse steder er henholdsvis placeret i position 80 (mut1), 1340 (Mut2) og 1830 (Mut3) af indretningen sekvens (supplerende data) og blev modificeret som følge af tavse mutationer.
Mut1 PstI-sted CTGCAG ændret i CGTCTG
Mut2 PstI-sted CTGCAG ændret i CAGCAG
Mut3 Eco RI-sted GAATTC ændret i GAATT - Kør gennem oversættelse simulering ved hjælp af Clone Manager-software (Operation> Proces-molekyler> Oversæt molekyler). Brug sekvensopstillingsprogram BLAST at kontrollere perfekt homologi mellem vildtype curli protein og proteinerne kodet af det syntetiske operon.
- Bestille den syntetiske operon. Kommercielle gensynteseteknikker tjenester er tilgængelige fra en række virksomheder i hele verden, vores partner var Genecust (Luxembourg). 4 ug af den kunstige operon (3165 bp) blev modtaget få uger senere og indsat i pUC57 (pIG2).
2. Visualiser og kvantificere adhærerende bakterier på Polystyren
- Fyld hver brønd i en 24-brønds polystyrenplade med 2 ml M63 minimalt medium (glucose 0,2%) og inokulere hver brønd med 106 celler af en overnatskultur. Vokse bakterier ved 30 ° C i 18 til 48 timer uden rystning. Hver søjle (4 brønde) betegner en modalitet. Tilsættes en passende mængde cobalt (25-100 mM) og antibiotika (ampicillin 100 μg.L -1) efter behov. De 3 første rækker af 24-brønds plade til at kvantificere de adhærerende bakterier ved at tage gennemsnittet af de tre gentagelser, er den sidste række venstre anvendes til at visualisere biofilmen.
- For de 3 første rækker af 24-brønds plade: til hver brønd, genvinde supernatanten indeholdende de planktoniske celler.
- Forsigtigt skylle hver brønd med 1 ml M63 og pool 1 ml vask med den oprindelige supernatant opnået i 2,2). Denne pool kaldes svømning celler (= S).
- Opsaml biofilm i 1 ml of M63 ved skrabning og pipettering op og ned (= B). Vortex 15 sek. Estimere antallet af overflade-bundne og svømning bakterier fra den optiske densitet ved 600 nm (OD600) til opnåelse af vedhæftning procentsatsen for hver modus.
- Procentdelen af vedhæftning beregnes ved anvendelse af formlen: BX100 / (3xS + B).
- Kun for den sidste række af 24-brønds plade: kassere planktoniske celler.
- Skylles med 1 ml M63 den biofilm, som havde udviklet på bunden af pladen.
- Tør den åbne plade i 1 time ved 80 ° C.
- Der tilsættes 100 pi 20% krystalviolet i 2 minutter i hver brønd efterfulgt af omfattende vaske med vand for at visualisere overflade-bundne bakterier.
Tre uafhængige assays (plader) skal udføres for at sikre reproducerbarhed.
3. Visualiser adhærerende bakterier på Glass af Mikroskopi
- Få en fluorescerende chassis. E. coli SCC1 e stamme, som constitutively udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP) med ingen observerbar forskel fra moderstammen MG1655 20 er en egnet vært for det plasmid, der bærer det syntetiske curli operonen.
- Omdanne SCC1 med pIG2 plasmidet (= syntetisk curli operon indsat ved EcoRI / PstI-sitet af pUC57 plasmid) til opnåelse af S23-stammen. Omdanne SCC1 med et kontrolplasmid (pUC18) til opnåelse af kontrolstammen S24 21.
- Vokse natten prækulturer af S23 og til kontrol (S24)-stammer ved 30 ° C i M63-medium suppleret med glucose (0,2%) og ampicillin (100 μg.L -1).
- Inokulere 15 ml af det samme medium i petriskåle med 100 fil af prækulturer. Tilføj den passende koncentration af cobalt (dvs. 25 uM) og glem ikke den negative kontrol uden kobolt. Indføre 3 rektangulære dækglas i hver petriskål. Inkuber natten over ved 30 ° C uden omrystning.
- Fjerne dækglasset from petriskålen og omhyggeligt dræne det. Tør omhyggeligt nedre ansigt med en lille bomulds ting imprægneret med 70 ° ethanol ved at tørre ud hver bakteriel rest. Til konfokal observation, rense begge øvre ender på nogle få millimeter for at tillade yderligere fiksering af dækglasset.
- Adhærente bakterier kan visualiseres direkte, men hurtigt under fluorescensmikroskop, men omhyggeligt undgå udtørring af prøven.
- Til konfokal observation, deponere dækglas på et objektglas med den øvre flade er dækket af biofilmen placeret opad. Biofilmen dækkes derefter med et større dækglas, der er fastgjort til objektglasset med lak. Inverterer opsætning således, at biofilmen vil nu være på den nedre flade.
- Placer opsætning under konfokal laser-mikroskop. En højre Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokal laser-mikroskop blev anvendt ved Platim platformen f.
- Indstilling. Excite GFP ved 488 nm, og indsamle det bakterielle fluorescens i området fra 500 til 600 nm . Brug 40x olieimmersionslinse mål for erhvervelse af billeder i laserscanning konfokal mode. Scanne de samlede tredimensionale strukturer af biofilm fra den faste overflade til grænsefladen med vækstmediet under anvendelse af et trin med 1 um.
- Udfør tredimensionale fremskrivninger med Imaris software (Bitplane, Zürich, Schweiz). Bestem biofilm tykkelse ved analysen af den gennemsnitlige z-værdi langs statistiske langsgående sektioner. Kvantificering af biofilm biovolumes kan ekstraheres fra konfokal z-stakke som beskrevet andetsteds 22.
en RegulonDB giver mekanistisk information om operon organisation og deres nedbrydning i transkriptionsenheder, promotorer og deres sigma typen, gener og deres ribosombindingssteder, terminatorer bindingssites af specifikke transkriptionelle regulatorer, samt deres organisation i regulatoriske sætninger.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
b. EcoGene Databasen indeholder opdateret information om E. coli K-12 genom og proteomet sekvenser, herunder omfattende gen bibliografier. En større EcoGene fokus har været re-evaluering af translationsstart-sites. http://ecogene.org/
c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
e gave Chun Chau Sze, Nan Yang Tekniske Universitet, Singapore.
f Platim mikroskopisk platform UMS3444 BioSciences Gerland - Lyon Sud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In silico annotation af vildtype CSG-sekvensen af E. coli K12 forbundet med optimering af transkriptionelle og translationelle signaler har gjort det muligt at udforme enkelt syntetisk curli operon P RCN-CSG vist i figur 3 (fuld sekvens i supplerende data). Protokol nr. 2 og protokol 3, blev anvendt til at visualisere og kvantificere overholdelse er forbundet med curli produktion. Med krystalviolet farvning på 24-brønds polystyrenplader (protocole 2) biofilmdannelse i bunden af hver brønd hurtigt kan visualiseres og det fremgår, at vildtypestammen er mindre adhærerende end det konstruerede stamme som vist ved forskellen i lilla farveintensitet (fig. 4A). Denne kvalitativ forstærkes af kvantitativ måling, der viser, at andelen af vedhæftning er 1,5 gange højere hos det konstruerede stamme (figur 4B). Desuden nøjagtigheden af kvantitative tiv fremgangsmåde tillader måling af en væsentlig forøgelse af adhærens i nærvær af stigende koncentrationer af cobalt. Faktisk, i medier med cobalt koncentrationer på 0 pM, 25 pM eller 50 pM, når procenter af adhærente celler 25%, 30% og 40% (fig. 4B). Adhærens evner kan også sammenlignes ved hjælp af mikroskopi med GFP-mærkede bakterier dyrket på objektglas. Epifluorescens-mikroskopi observationer (grønne bakterier på sort baggrund) viser, at det konstruerede stamme danner en flere lag stor samlet betragtes som en biofilm der vildtypestammen danner kun meget små kolonier (figur 5). Konfokal mikroskopi analyse giver et samlet overblik over biofilmen tredimensionelle struktur og bekræfter, at konstruerede stamme er mere vedhængende, danner en tættere og tykkere biofilm (figur 6).
4176fig1.jpg "alt =" Figur 1 "/>
Figur 1. Curli vildtype-system. Curli er lavet af to monomerer kodet af de CSGB og csgA gener. Takket være deres signalpeptid, har det CsgA og CSGB curli monomerer translokeres gennem den cytoplasmiske membran via Sec-systemet. En specifik maskiner bestående af 3 hovedkomponenter, nemlig CsgE, CsgF og CsgG tillader translokation af curli monomerer over den ydre membran.
Figur 2. En stærk og cobalt inducerbar-promotor (BBa_K540001). Promotoren P rcnA styres af transskriptionsrepressor RcnR. The rcnR genet transskriberes fra dens endogene promotor P rcnR, divergerende fra P rcnA. Tilstedeværelsen af rcnR genet sikrer korrekt forhold mellem repressor kopier versus P rcnA regulerenderegion. I fravær af cobalt, binder RcnR til RcnR boksen DNA og forhindrer fuld transkriptionel aktivering af nedstrøms gener. Hvis den intracellulære koncentration af cobalt stiger, forhindrer bindingen af cobalt til RcnR protein optagelse af repressoren til promotoren og den transkriptionelle aktivitet af PrcnA stiger 19.
Figur 3. Den syntetiske curli operonen. Curli gener anbringes under kontrol af P rcnA. The rcnR genet udtrykt fra dets egen promotor bør give nok repressor til at kontrollere ekspressionen af curli gener i en cobalt-afhængig måde. For at undgå periplasmiske trafikprop grund curli monomer overproduktion (CSGB og CsgA), komponenterne i curli specifikke sekretion apparat (CsgE, CsgF og CsgG) skal overproduceres også. Tilsat traductional signaler er i dicated i grå (RBS = Perfect RBS). E = EcoRI X = Xba I S = SphI P = Pst I. Denne syntetiske del benævnt Bba_K540000 tillader manipuleret stamme for at blive klæbende til glas, sand eller plast via curli overproduktion.
Figur 4. Visualisering og kvantificering af de adhærerende bakterier på 24-godt polystyren plade. A. Crystal violet farvet biofilm dannet af adhærerende bakterier på polystyren. B. Procentdel af adhærens på polystyren af vildtypen og de konstruerede stammer med forskellige koncentrationer af cobalt. Statistiske forskelle mellem behandlinger er angivet med små bogstaver (variansanalyse og Fishers mindste signifikante forskel test, P <0,05).
76/4176fig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Epifluorescens mikroskopi billeder af vedhæftende GFP-mærkede bakterier på objektglas. Bakterier er grønt på en sort baggrund. Pile peger på mikrokolonier.
Figur 6. Konfokal microscropy bistået tredimensionelle rekonstruktioner af biofilm struktur på objektglas: A. Top View rekonstruktioner B. Side view rekonstruktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin
Det mest kritiske skridt i denne syntetisk biologi tilgang er gen design. Syntetisk gen design skal være omhyggelig for at sikre et effektivt system produktion. To gener, der koder fiber monomerer og tre gener, der koder proteiner involveret i deres sekretionssystem er samlet med en stærk og metal-inducerbar promotor for at skabe en ny funktionel enhed til en ny applikation: bio-dekontaminering af nuklear spildevand. Som planlagt og forudsagt, denne enhed fører til en forbedret høj curli produktion, som forstærkes af stigende mængde kobolt i mediet. Sådan en succes skyldes tilstedeværelsen af både de passende transskriptionelle signaler i den valgte promotor (P rcnA), og de effektive translationelle signaler tilføjes foran hvert sæt curli gener (csgBA og csgEFG) (se figur 3). Desuden, når man arbejder med et multikopiplasmid, opmærksomhed der skal betales til kopiantallet af regulatoren (er) er involveret i promotor-kontrol. Her blev multicopies af hovedregulatoren RcnR af den anvendte promotor (P rcnA) tilvejebragt fra det samme plasmid (fig. 3).
Begrænsninger, eventuelle ændringer
For at sikre en perfekt reproducerbarhed, vedhæftningen test har altid skal udføres i samme mærke polystyrenplader (se tabel). Fluorescensmikroskopi er nemmere med fluorescent-mærkede stammer, men dette krav kan overvindes ved anvendelse af fluorescerende farvestoffer, såsom Syto, eller plasmid, der bærer lac-GFP-fusioner 23. Bakteriel fastgørelse til abiotiske overflader, såsom polystyren og glas afhænger af ionstyrke eller osmolaritet af mediet. De bedste resultater opnås sædvanligvis i minimalt medium eller fortyndet LB 22, 24.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering denne teknik
indhold "> Den her beskrevne metode til at kvantificere bakteriel vedhæftning er hurtig og billig. For at karakterisere et stort antal stammer eller dyrkningsbetingelser, og / eller til opnåelse af en detaljeret strukturel karakterisering af biofilm, high throughput metode baseret på konfokal laserscanningsmikroskopi kombineret med anvendelsen af 96-brønds mikrotiterplader må betragtes 25.Den MBEC screeningssystem, tidligere Calgary Biofilm indretning 26 kan også anvendes. Dette system er baseret på anvendelsen af en mikrotiterplade med et aftageligt låg, der holder 96 pinde substrat tillader mikroskopiske observationer af biofilm struktur 27, eller kvantificering af celler i biofilm efter sprængning ved sonikering på et vandspejl sonikator (The MBEC Højkapacitetsforskning ( HTP) Assay, Innovotech, Edmonton, Canada). Et andet system, biofilmen Ring Test, overvåger hvor inerte paramagnetiske perler indeholdt i dyrkningsmediet immobiliseres under dannelsenaf biofilmen 28, og kan bruges til at kvantificere biofilmdannelse. MBEC og Biofilm Ring Test kræver specifikke materialer, der er dyrere end dagligvarer anvendt i denne undersøgelse.
Betydning af teknikken i forhold til eksisterende metoder
At oprette en enkelt uafhængig curli operon, forsøgte vi to metoder parallelt: et syntetisk fremgangsmåde beskrevet her, og en klassisk metode, der involverer mutagenese til fjernelse af interne Eco RI og Pstl-restriktionssteder, og PCR-trin efterfulgt af ligeringer. Begge fremgangsmåder blev igangsat på samme tid, men sekventeringsanalyse af operonen opnået ved den klassiske fremgangsmåde viste uønskede mutationer. Derfor er syntesen af indretningen er mere effektiv og hurtigere end klassisk kloning og mutagenese procedurer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker de øvrige medlemmer af Lyon Insa-ENS iGEM team (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy, Clémence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon og Valérie Desjardin), vores sponsorer for deres økonomiske støtte (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon og Department of Biosciences Insa-Lyon), F. Wisniewski-Dye for kritisk læsning af dette manuskript og Dr. CC Sze for stamme gave. B. drogue modtager en Ph.D. stipendium fra Région Rhône-Alpes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
