Summary
يوصف تصميم ترميز OPERON الاصطناعية على حد سواء جهاز إفرازية ومونومرات الهيكلية من ألياف curli. الافراط في هذه اميلويدس والبوليمرات تمسكا يسمح مكسب للقياس الانضمام لل
Abstract
الطريقة الموضحة هنا يتمثل في إعادة تصميم E. خصائص الالتزام القولونية عن طريق تجميع الحد الأدنى لعدد الجينات curli تحت سيطرة أحد المروجين قوية والمعادن overinducible، وتصور وقياس في الربح الناتج من الالتزام البكتيرية. هذا الأسلوب ينطبق مبادئ الهندسة المناسبة من التجريد وتوحيد البيولوجيا التركيبية، والنتائج في Biobrick BBa_K540000 (أفضل جهاز Biobrick جديدة وهندستها، iGEM 2011).
الخطوة الأولى تتمثل في تصميم OPERON الاصطناعية المخصصة لفيض الإنتاج curli ردا على المعادن، وبالتالي في زيادة قدرات الانضمام للسلالة النوع البري. تم تعديل curli OPERON الأصلي في السيليكون من أجل تحسين إشارات النسخي ومتعدية والهروب من "الطبيعي" تنظيم curli. هذا النهج سمح لاختبار نجاح مع فهمنا الحالي للإنتاج curli. Moreoveص، وتبسيط تنظيم curli عن طريق التحول المروج الذاتية المعقدة (أكثر من 10 المنظمين النسخي المحددة) إلى المروج المعادن التنظيم بسيطة يجعل الالتزام أسهل بكثير للسيطرة.
الخطوة الثانية تشمل التقييم النوعي والكمي لقدرات التزام تنفيذ طرق بسيطة. هذه الأساليب تنطبق على طائفة واسعة من البكتيريا الملتصقة بغض النظر عن الهياكل البيولوجية المشاركة في تشكيل بيوفيلم. اختبار في لوحات البوليسترين الالتزام 24 جيد يوفر التصور السريع الأولية للبيوفيلم البكتيريا بعد تلطيخ البنفسجي الكريستال. ويمكن شحذ هذا الاختبار النوعي من تحديد مقدار النسبة المئوية للانضمام. هذه طريقة بسيطة جدا ولكن أكثر دقة من تلطيخ فقط البنفسجي الكريستال كما هو موضح سابقا 1 مع التكرار على حد سواء جيدة والتكاثر. التصور من البكتيريا GFP-الموسومة على الشرائح الزجاجية من قبل مضان أو أسيوط الليزرالمجهر ocal يسمح لتعزيز النتائج التي تم الحصول عليها مع لوحة الاختبار 24 جيد من قبل الملاحظة المباشرة لهذه الظاهرة.
Introduction
الانضمام إلى الدعم غير الحيوية البكتيرية تلعب دورا رئيسيا في خلايا الوقود المعالجة البيولوجية، أو التحفيز الأحيائي الميكروبية. عمليات المعالجة البيولوجية استخدام قدرات الكائنات الحية الدقيقة لتحلل المواد العضوية، أو لتعديل توزيع المعادن (الشلل، التطاير) أو انتواع. ويلاحظ في هذه الأنشطة المفيدة النظم الإيكولوجية المائية والأرضية، ولكن أيضا في النظم الاصطناعية وضعت لمعالجة المياه الملوثة من النفايات الصناعية والمنزلية. كثافة ونوعية للنشاط الميكروبي تعتمد على العوامل الفيزيائية والكيميائية، ولكن أيضا على نمط الحياة من الكائنات الحية الدقيقة (التعويم الحر أو تضمينها داخل بيوفيلم). ويرتبط تشكيل بيوفيلم مع الأيض تعزيز المقاومة لمبيدات الحشرات عن طريق آليات متنوعة. ولذلك يجب تشجيع هذه الظاهرة في معظم عمليات المعالجة البيولوجية. وعلاوة على ذلك، تم خلايا الإشريكية القولونية الهندسية للسيطرة على تشكيل بيوفيلم تطبيقها بنجاح علىشل خلية كاملة على أجهزة استشعار biochips 2-3.
التكيف من الكائنات الحية الدقيقة لتركيزات عالية من المعادن عن طريق آليات متنوعة يحدث مثل الامتزاز على مكونات المصفوفة خارج الخلية، تفعيل مضخة هروب رأس المال أو شبكات محددة قادرة على تركيز المعادن في الخلية. تعزيز هذه الأنشطة البكتيرية عن طريق الهندسة الوراثية يسمح العلاج الفعال والرخيص من التلوث بالمعادن في نطاق المختبر، وخاصة في حالة المعادن السامة جدا في ضعف الكمية كما وصفها راغو وآخرون 2008 4. المعالجة البكتيرية يمثل في هذه الحالة وسيلة إنقاذ تنافسية والتكلفة مقارنة العمليات الكيميائية الكلاسيكية باستخدام راتنجات التبادل الأيوني. وصف الكتاب وE. هيكل القولونية المعدلة وراثيا لامتصاص القشور والاحتفاظ الاولى ضرب الترميز الجينات هروب رأس المال مضخة ركونا، وبعد ذلك تحول مع نسخة متعددة البلازميد الإفراط في الإنتاج مما يسمح لأحدنقل مع امتصاص تفضيلية للالكوبالت. هذه السلالة يظهر كبديل فعال لراتنجات التبادل الأيوني لعلاج النفايات السائلة المشعة، ولكن القضية الرئيسية التي لم تحسم بعد التعافي من البكتيريا الملوثة في نهاية عملية 4. وكان الهدف من عملنا لذا لهندسة سلالة مصمم خصيصا قادرة على التمسك الدعم غير الحيوية مثل الزجاج أو البلاستيك.
من بين مجموعة كاملة من adhesins وخمل تمسكا المحددة في الغرام البكتيريا، اخترنا لتصميم نظام يسمح curli الإنتاج. Curli هي الألياف اميلويد رقيقة (2-5 نانومتر قطر) وحصري جدا أن تبرز من E. كولاي والسالمونيلا وسطح مصفوفة غير البلورية وغير قابلة للذوبان 5-7. وتشارك أيضا في Curli استعمار السطوح غير الحيوية، وتطوير الأغشية الحيوية 8. عرضت مؤخرا لربط أيونات Curli الزئبق 9. ومن المعروف بالفعل اميلويدس لامتلاك عاليةلأيونات المعادن تقارب مثل النحاس 2 +، 2 + الزنك والحديد 3 + 10. قد هذه الخاصية زيادة تحسين إزالة التلوث من النفايات السائلة الملوثة المعادن. الكتلة إداراته مسؤولة عن إنتاج الألياف curli وتشكل اثنين من operons المحولة divergently (الشكل 1). و، csgB csgA والجينات csgC تشكل OPERON المعنى، وهما ترميز الوحدات الصغرى curli، وCsgA CsgB. CsgC يبدو أن يشاركوا في أي نشاط الأكسدة داخل منظومة نشوء حيوي curli وتؤثر على السلوك CsgG المسام 11. ومع ذلك، فإن عدم وجود csgC في معظم البكتيريا المنتجة للcurli يشير إلى أن البروتين المقابل يوفر فقط على مستوى secundary من السيطرة على نشوء حيوي curli. لتبسيط النظام، وقد اخترنا العمل مع الحد الأدنى لعدد الجينات.
وcsgDEFG operonencodes البروتينات الضرورية في تنظيم وسائل النقلمن CsgA وCsgB إلى سطح الخلية. CsgD هو المنشط النسخي من OPERON csgBAC ويلعب دورا رئيسيا في السيطرة على تشكيل بيوفيلم عن طريق التحكم في إنتاج مكونات وخمل curli بيوفيلم أخرى مثل السليلوز 12 و من خلال منع انتاج السوط 13. CsgE، وCsgF CsgG تشكل جهاز إفرازية curli محددة في الغشاء الخارجي من خلالها، ويفرز الوحيدات curli الرئيسية CsgA البروتين وبروتين قابل للذوبان. البلمرة من CsgA يعتمد في الجسم الحي على CsgB غشاء محدد البروتين nucleator (تم استعراضها في 14). وقد ثبت مسارات التنظيمية المعقدة التي تنطوي على العديد من أنظمة ثنائية المكون للسيطرة على التعبير الجيني curli 15-16. هذه الأنظمة المعقدة تسمح للبكتيريا لتشكيل الأغشية الحيوية سميكة عن طريق إنتاج curli استجابة لمنبهات البيئة، ولكن يصعب التحكم في التطبيقات الصناعية. لتسهيل انتعاش الحدآل محشوة البكتيريا أثناء العملية الصناعية، تثبيت البكتيرية إلى دعم قوي يحتاج في الواقع إلى أن يسيطر عليها المعلمة واضحة المعالم (ق). وترتبط خصائص ملتصقة بهم من curli إلى 17 اميلويد الطبيعة، ويمكن استخدامها لتحسين عمليات المعالجة البيولوجية، ولكن جهاز أبسط والسيطرة عليها بسهولة لابد من خلق.
وقد تم اختيار هذه الجينات بين 7 18، ومجموعة من 5 مطلوب على الاطلاق الجينات لتخليق curli (csgB ومونومرات csgA الألياف الترميز) والتصدير (csgE csgF وcsgG، ترميز معقدة إفراز curli) لبناء OPERON الاصطناعية. هربا من "الطبيعي" تنظيم curli، وOPERON الاصطناعية تضم هذه الجينات إداراته 5 تحت سيطرة المروج قوية والكوبالت overinducible-(الشكل 2) تم تصميم وتوليفها. التحليل خطوة بخطوة في المنطقة curli ترميز وتصميم الإجراء لSYN الوظيفيةويرد وصف thetic OPERON. وأوضح طريقتين لتصور وقياس الالتزام البكتيرية إلى البوليسترين والزجاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Biobrick تصميم وتجميع OPERON Curli
- تحديد منظمة الوراثية وتوطين الإشارات الذاتية النسخي ومتعدية من الجينات curli. يتم جمع هذه المعلومات في قواعد البيانات المتخصصة مثل RegulonDB أو ب EcoGene والانتهاء من قراءة متأنية من المنشورات ذات الصلة. أجريت في إدارة البيانات وسيليكو preanalysis مع مدير استنساخ البرمجيات ج.
- تحديد متواليات ذات الصلة الترميز. وقد تم اختيار مجموعة من خمسة جينات حاجة على الاطلاق لتخليق curli (csgB ومونومرات csgA الألياف الترميز) والتصدير (csgE csgF وcsgG، ترميز معقدة إفراز كيرلين) لبناء OPERON الاصطناعية. استخراج تسلسل اختيارهم من قاعدة البيانات في شكل FASTA.
كما هو الكتلة csgGFE العقاقير في E. الجينوم القولونية، وتحويل هذا التسلسل في counterp في تكملة عكسالفن استنساخ باستخدام أدوات إدارة العمليات> جزيء عملية> عكس الجزيء. لصق تسلسل csgEFG وراء csgBA باستخدام وظيفة "Ligate" (استنساخ> Ligate). - إضافة المروج المناسبة. عن طريق وضع الجينات الخمس المختارة curli تحت سيطرة المروج P RCN، ومن المتوقع أن يكون أكثر من curli المنتجة في وجود الكوبالت والنيكل. موضع RCN بترميز مضخة مسؤولة عن هروب رأس المال وإزالة السموم ني شركة (ركونا) وما شابه ذلك من وفلزية المنظم-(rcnR). RcnR تسيطر على التعبير عن الجينات وركونا الخاصة استجابة لني والتعاون 19. تسلسل RCN تضم CDS rcnR، كانت المنطقة كلها RCN بين الجينات بالإضافة إلى النيوكليوتيدات 41 الأولى من ركونا placedin أمام تسلسل خيالي csgBAEFG (الشكل 1، وتقدم تسلسل بناء على كونه البيانات التكميلية).
- تحسين النسخيالاشارات. تمت إضافة موقع مثالي ملزمة الريبوسوم (أو الكمال RBS = AAGGAGGTATATA) أمام ATG الأول من تسلسل الحمض النووي csgBA. تمت إضافة RBS 2 مثالية أمام تسلسل csgEFG. تم الحفظ RBS الذاتية للcsgB والجينات وcsgF csgG.
- لتناسب المعايير iGEM، يجب يحيط الجهاز عن طريق بادئة BioBrick القياسية واللاحقة، التي تحتوي على مواقع لتقييد RI إيكو، PST I (اختصار) وجمعية مهندسي البترول وXba I I (لاحقة). لصق متواليات المقابلة في نهاية كل من د الجهاز.
- القضاء على أي RI إيكو، PST I، I جمعية مهندسي البترول وXba موقع الاعتراف I في الجهاز. لزيادة تسهيل عملية التجميع، قد الجزء BioBrick نفسها لا تحتوي على أي من هذه المواقع قيود. في تحليل تقييد سيليكون للجهاز كشف أحد الباسيفيكي I موقع في التسلسل csgA، موقع واحد I PST في تسلسل rcnRوموقع واحد RI منظمة التعاون الاقتصادي في الجين csgE. وتقع هذه المواقع على التوالي في المركز 80 (Mut1)، 1340 (Mut2) و1830 (Mut3) من تسلسل الجهاز (بيانات تكميلية) وجرى تعديل على النحو التالي من الطفرات الصامتة.
CTGCAG تغيير موقع Mut1 I PST في CGTCTG
CTGCAG تغيير موقع Mut2 I PST في CAGCAG
Mut3 موقع ايكو RI GAATTC تغير في GAATT - تشغيل من خلال المحاكاة باستخدام برنامج ترجمة استنساخ مدير (عملية> جزيئات عملية> جزيئات ترجم). استخدام برنامج المحاذاة تسلسل BLAST للتحقق من تماثل تام بين البروتين نوع curli البرية والبروتينات المشفرة بواسطة OPERON الاصطناعية.
- تأمر OPERON الاصطناعية. وكان شريكنا الخدمات التجارية توليف الجينات وتتوفر العديد من الشركات في جميع أنحاء العالم من، Genecust (لوكسمبورغ). وقد وردت 4 ميكروغرام من OPERON الاصطناعي (3165 BP) بعد أسابيع قليلة ومدرجة ضمن pUC57 (pIG2).
2. تصور وقياس البكتيريا تمسكا على البوليستيرين
- ملء كل بئر من لوحة البوليسترين 24-جيدا مع 2 مل من المتوسط M63 الحد الأدنى (الجلوكوز 0.2٪) وتطعيم كل بئر مع 106 الخلايا من ثقافة بين عشية وضحاها. تنمو البكتيريا في C ° 30 لمدة 18 إلى 48 ساعة دون أن تهتز. كل عمود (4 آبار) يمثل الطريقة. إضافة كمية مناسبة من الكوبالت (25 الى 100 ملم) والمضادات الحيوية (الأمبيسلين 100 μg.L -1) عند الحاجة. وتستخدم الصفوف 3 الأولى من لوحة 24-جيدا لتحديد البكتيريا الملتصقة عن طريق حساب متوسط التكرار 3، يستخدم اليسار الصف الأخير لتصور بيوفيلم.
- للصفوف 3 الأولى من لوحة 24 أيضا: لكل بئر، واستعادة طاف يحتوي على خلايا العوالق.
- شطف بعناية كل بئر مع 1 مل من M63 وحمام سباحة غسل 1 مل مع طاف الأولية التي تم الحصول عليها في 2.2). ويشار إلى هذه المجموعة باسم خلايا السباحة (= S).
- استرداد بيوفيلم في 1 مل سو M63 عن طريق كشط وpipetting صعودا وهبوطا (= B). دوامة 15 ثانية. تقدير عدد البكتيريا سطح المرفقة والسباحة من الكثافة البصرية في 600 نانومتر (OD600) لإعطاء نسبة الالتزام المقابلة لكل طريقة.
- يتم حساب النسبة المئوية للانضمام باستخدام الصيغة: Bx100 / (+ B 3xS).
- فقط لفي الصف الأخير من لوحة 24 أيضا: تجاهل الخلايا العوالق.
- شطف مع 1 مل من M63 في بيوفيلم التي وضعت على الجزء السفلي من اللوحة.
- تجف لوحة مفتوحة لمدة 1 ساعة عند 80 ° C.
- إضافة 100 ميكرولتر من الكريستال البنفسجي 20٪ لمدة 2 دقيقة في كل تليها يغسل جيدا من قبل واسعة مع الماء لتصور سطح البكتيريا المرفقة.
ثلاثة فحوصات مستقلة (لوحات) يجب أن يتم لضمان التكاثر.
3. تصور البكتيريا تمسكا على الزجاج بواسطة المجهر
- الحصول على هيكل الفلورسنت. وE. سلالة الإشريكية ه SCC1 التي constitutivelذ عن بروتين الفلورية الخضراء (GFP) لا فرق مع ملاحظتها من سلالة الأم MG1655 20 هو مجموعة مناسبة لتحمل البلازميد الاصطناعية curli OPERON.
- تحويل SCC1 مع pIG2 بلازميد (= OPERON curli الاصطناعية المدرجة في RI إيكو / الباسيفيكي I موقع البلازميد pUC57) للحصول على سلالة S23. تحويل SCC1 مع عنصر تحكم بلازميد (pUC18) للحصول على سلالة تحكم S24 21.
- تنمو بين عشية وضحاها من precultures S23، وعلى رقابة (S24) سلالات في 30 ° C في M63 المتوسطة تستكمل مع الجلوكوز (0.2٪) والأمبيسلين (100 μg.L -1).
- تطعيم 15 مل من المتوسط في نفس أطباق بتري مع 100 ميكرولتر من precultures. إضافة تركيز مناسب من الكوبالت (أي 25 ميكرومتر) و لا تنسى سيطرة سلبية دون الكوبالت. إدخال 3 ساترة الزجاج مستطيلة في كل طبق بتري. احتضان بين عشية وضحاها في C ° 30 دون أن تهتز.
- إزالة ساترة جيئة وذهابام في طبق بتري واستنزاف بعناية. بعناية تنظيف الوجه السفلي مع الاشياء الصغيرة القطن المشبع مع الإيثانول ° 70 من محو كل بقايا البكتيرية. لمراقبة مبائر، وتنظيف طرفي العليا على بضعة ملليمترات للسماح التثبيت مزيد من ساترة.
- ويمكن تصور البكتيريا الملتصقة مباشرة ولكن بسرعة تحت المجهر مضان، ولكن تجنب بعناية تجفيف العينة.
- لمراقبة مبائر، إيداع ساترة على شريحة زجاجية مع الوجه العلوي المشمولة بيوفيلم وضعها مواجهة. ثم يغطى بيوفيلم مع أكبر ساترة، فهو أمر ثابت إلى الشريحة الزجاجية مع الورنيش. عكس الإعداد بحيث سيكون بيوفيلم الآن على الوجه السفلي.
- وضع الإعداد تحت المجهر متحد البؤر الليزر. تم استخدام حق Axioplan2 LSM510 (زايس) مبائر المجهر الليزر في منصة و Platim.
- وضع. GFP تثير في 488 نانومتر، وجمع مضان البكتيرية في نطاق 500 حتي 600 نانومتر . استخدام الغمر 40X الهدف للحصول على النفط في الصور ليزر متحد البؤر المسح وضع. مسح الشامل الثلاثي الأبعاد هياكل الأغشية الحيوية من سطح صلب إلى واجهة مع النمو المتوسط، وذلك باستخدام خطوة من 1 ميكرون.
- أداء ثلاثي الأبعاد مع برنامج توقعات IMARIS (Bitplane، زيوريخ، سويسرا). تحديد سمك بيوفيلم من خلال تحليل القيمة Z متوسط طول المقاطع الطولية الإحصائية. ويمكن استخراج الكمي للbiovolumes بيوفيلم من مبائر Z-مداخن كما هو موضح في مكان آخر 22.
وRegulonDB يقدم معلومات عن تنظيم الآلية OPERON والتحلل من النسخ إلى وحدات، والمروجين نوعها سيجما والجينات ومواقعها ملزمة الريبوسوم، الغلق، ومواقع الربط المنظمين النسخي محددة، فضلا عن منظمتهم في العبارات التنظيمية.وآخرون = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
(ب) قاعدة بيانات تحتوي على معلومات EcoGene محدثة حول E. القولونية K-12 وتسلسل الجينوم بروتيوم، بما في ذلك المراجع الجينات واسعة النطاق. وثمة تركيز كبير على EcoGene إعادة تقييم مواقع بداية الترجمة. http://ecogene.org/
ج http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
د http://partsregistry.org/wiki/index.php؟title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
ه هدية تشون تشاو سزي، نان يانغ التقنية جامعة سنغافورة.
و Platim المجهرية منصة UMS3444 العلوم البيولوجية جيرلان - ليون الجنوب.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
في سيليكو الشرح من تسلسل نوع من إداراته البرية E. وقد سمح القولونية K12 المرتبطة الأمثل للإشارات النسخي ومتعدية لتصميم واحد الاصطناعية curli OPERON P-RCN إداراته هو موضح في الشكل 3 (تسلسل كامل في البيانات التكميلية). واستخدمت بروتوكول بروتوكول 2 و 3 لتصور وقياس الالتزام المرتبطة بإنتاج curli. يمكن استخدام الكريستال البنفسجي تلطيخ على لوحات البوليسترين 24-جيدا (protocole 2) تشكيل بيوفيلم في الجزء السفلي من كل جانب يمكن تصور بسرعة ويبدو أن سلالة النوع البري هو أقل تمسكا من سلالة هندسيا كما هو مبين من قبل الفرق في كثافة اللون الأرجواني (الشكل 4A). ويتعزز هذا النهج النوعي من القياس الكمي الذي يكشف أن نسبة الالتزام هو 1.5 أضعاف أعلى في الهندسة سلالة (الشكل 4B). وعلاوة على ذلك، دقة كميا tive نهج يسمح قياس لتعزيز الالتزام في كبيرة من وجود زيادة تركيزات الكوبالت. في الواقع، في وسائل الإعلام مع تركيزات الكوبالت من 0 ميكرومتر، ميكرومتر ميكرومتر 25 أو 50، النسب المئوية للخلايا ملتصقة تصل إلى 25٪، 30٪ و 40٪ على التوالي (الشكل 4B). ويمكن أيضا أن قدرات الانضمام مقارنة باستخدام المجهر مع GFP الموسومة البكتيريا نمت على شرائح زجاجية. الملاحظات المجهر Epifluorescence (البكتيريا الخضراء على خلفية سوداء) تكشف عن أن سلالة هندسيا تشكل الكلي عدة طبقات كبيرة تعتبر بيوفيلم في حين أن سلالة النوع البري يشكل فقط المستعمرات الصغيرة (الشكل 5). مبائر المجهر التحليل يوفر نظرة شاملة للهيكل ثلاثي الأبعاد بيوفيلم ويؤكد أن سلالة هندسيا هو أكثر الناس التزاما، وتشكيل كثافة وسمكا بيوفيلم (الشكل 6).
4176fig1.jpg "بديل =" الشكل 1 "/>
الشكل 1. مصنوعة Curli البرية من نوع النظام. curli واثنين من مونومرات المشفرة بواسطة الجينات csgB وcsgA. بفضل الببتيد إشارة الخاصة بهم، وعلى translocated CsgA ومونومرات CsgB curli عبر الغشاء السيتوبلازمي عبر نظام ثانية. A آلية محددة تتألف من 3 عناصر رئيسية، وهي CsgE، وCsgF CsgG يسمح للإزفاء من مونومرات curli عبر الغشاء الخارجي.
الشكل 2. يتم التحكم قوية والكوبالت محرض-المروج (BBa_K540001)، والمروج P ركونا من RcnR وقامع النسخي. وكتب الجين rcnR من المروج لها الذاتية P rcnR، divergently من ركونا P. وجود هذا الجين rcnR يضمن نسبة الصحيح من النسخ كاظمة مقابل P ركونا التنظيميةالمنطقة. في غياب الكوبالت، RcnR بربط مربع RcnR على DNA ويمنع تنشيط كاملة من الجينات النسخي المصب. إذا كان تركيز الخلايا من ارتفاع الكوبالت والربط من الكوبالت للبروتين RcnR يمنع تثبيت للقامع للمروج والنشاط الترانسكربتي من الزيادات PrcnA 19.
الشكل 3. وOPERON curli الاصطناعية. توضع الجينات Curli تحت سيطرة ركونا P. يجب أن الجين rcnR أعرب من المروج الخاصة توفر ما يكفي للسيطرة على كاظمة التعبير عن الجينات curli بطريقة تعتمد الكوبالت. لتجنب ازدحام المرور محيط بالجبلة بسبب الافراط مونومر curli (CsgB وCsgA)، ومكونات أجهزة إفراز curli محددة (CsgE، وCsgF CsgG) لا بد من مزيد إنتاج أيضا. إشارات traductional وأضاف في dicated في الرمادي (RBS = الكمال RBS). E = RI إيكو X = S = I Xba SPH I I. P = توقيت المحيط الهادي هذا الجزء الاصطناعية ويشار إلى Bba_K540000 يسمح للسلالة هندسيا لتصبح تمسكا الرمل والزجاج أو البلاستيك عن طريق الإفراط في الإنتاج curli.
الشكل 4. التصور وتقدير من البكتيريا الملتصقة على لوحة البوليسترين 24 أيضا. A. الملون البنفسجي الكريستال بيوفيلم البكتيريا الملتصقة التي شكلتها على البوليسترين. B. نسبة الالتزام في البوليسترين من نوع البرية والسلالات المهندسة مع تركيزات مختلفة من الكوبالت. يشار إلى فروق ذات دلالة إحصائية بين المعاملات مع الأحرف الصغيرة (تحليل التباين واختبار فيشر الأقل فرق كبير؛ P <0.05).
76/4176fig5.jpg "بديل =" الشكل 5 "/>
الشكل 5. الصور المجهري Epifluorescence من البكتيريا GFP-الموسومة البكتيريا على الشرائح الزجاجية. تمسكا خضراء على خلفية سوداء. الأسهم تشير في microcolonies.
الشكل 6. microscropy مبائر ساعدت إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لبنية بيوفيلم على الشرائح الزجاجية: A. الأعلى منظر جانبي اعادة البناء B. مشاهدة اعادة البناء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة
الخطوة الأكثر أهمية في هذا النهج البيولوجيا التركيبية هو تصميم الجينات. تصميم الجينات الاصطناعية يجب أن يكون دقيق لضمان إنتاج نظام فعال. وقد تم تجميع اثنين من الجينات ترميز أحادية الألياف والبروتينات ترميز الجينات الثلاثة المشاركة في نظام إفراز مع أحد المروجين قوية والمعادن محرض إلى إنشاء وحدة جديدة وظيفية لتطبيق رواية: إزالة التلوث الحيوي من النفايات السائلة النووية. كما كان مقررا وتوقع، وهذا الجهاز يؤدي إلى إنتاج عالية curli المعززة، التي عززت من خلال زيادة كمية من الكوبالت في المتوسط. وأضاف مثل هذا النجاح من النتائج وجود كل من النسخي إشارات المناسبة في اختيار المروج (P ركونا)، والإشارات كفاءة متعدية أمام كل مجموعة من الجينات curli (csgBA وcsgEFG) (انظر الشكل 3). وبالإضافة إلى ذلك، عند العمل مع الاهتمام، البلازميد multicopy يجب أن يدفع لعدد نسخة من منظم (ق) المشاركة في مراقبة المروج. هنا، وقدمت multicopies من RcnR المنظم الرئيسي للمروج المستخدمة (P ركونا) من (الشكل 3) البلازميد نفسه.
قيود أو تعديلات ممكن
لضمان reproductibility الكمال، واختبار الالتزام دائما إلى أن يؤديها من نفس الماركة من لوحات البوليسترين (انظر الجدول). المجهر مضان هو أسهل مع سلالات الفلورسنت الموسومة، ولكن يمكن التغلب على هذا الشرط باستخدام الأصباغ الفلورية مثل Syto، أو تحمل البلازميد لاك GFP اندماج 23. التصاق البكتيريا على الأسطح غير الحيوية مثل البوليسترين والزجاج يعتمد على قوة الأيونية أو الأسمولية من المتوسط. عادة يتم الحصول على أفضل النتائج في الحد الأدنى من المتوسط LB أو المخفف 22 و 24.
المستقبل التطبيقات أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
المحتوى "> ووصف طريقة لتحديد الالتزام هنا الجرثومي هو سريع ورخيص، ولكن لوصف عدد كبير من سلالات أو شروط الثقافة، و / أو للحصول على توصيف مفصل الهيكلية الأغشية الحيوية، وارتفاع الإنتاجية الأسلوب يعتمد على الفحص المجهري متحد البؤر المسح الضوئي ليزر جنبا إلى جنب مع استخدام وحات microtiter 96-جيدا لابد من النظر 25.ويمكن أيضا نظام الفرز MBEC، كالجاري سابقا جهاز بيوفيلم 26 يمكن استخدامها. ويستند هذا النظام على استخدام لوحة عيار مكروي مع غطاء قابل للإزالة التي تحمل 96 أوتاد التحتية السماح الملاحظات المجهرية هيكل بيوفيلم 27، أو الكمي من الخلايا في بيوفيلم بعد انقطاع عن طريق صوتنة على المياه sonicator الجدول (MBEC عالي الإنتاجية ( HTP) الفحص، Innovotech، ادمونتون، كندا). نظام آخر، واختبار حلقة بيوفيلم، يرصد كيف يتم يجمد الخرز ممغطس خاملة المدرجة في ثقافة المتوسط خلال تشكيلمن بيوفيلم 28، ويمكن أن تستخدم لتحديد تشكيل بيوفيلم. MBEC وبيوفيلم اختبار حلقة تتطلب مواد معينة التي هي أكثر تكلفة من المواد الاستهلاكية الأساسية المستخدمة في هذه الدراسة.
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب القائمة
لإنشاء واحدة مستقلة curli OPERON، حاولنا طريقتين في نفس الوقت: نهج الاصطناعية وصفها هنا، وطريقة كلاسيكية تشمل الطفرات لإزالة الداخلية RI البيئية والمواقع توقيت المحيط الهادي تقييد الأول، والخطوات تليها عمليات ربط PCR. وبدأت كلا النهجين في نفس الوقت، ولكن تحليل التسلسل من OPERON التي حصل عليها الأسلوب الكلاسيكي كشف الطفرات غير مرغوب فيها. ولذلك، تم تركيب الجهاز أكثر كفاءة وأسرع من استنساخ الكلاسيكية والإجراءات الطفرات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر أعضاء آخرين في فريق ليون iGEM INSA-ENS (فيفيان Chansavang، دوموند ماتيلد، ألكسندر دوبري، Geffroy ميلاني، Gonthier كليمنس، Jaulin مارجو، هاج أوريلي، Goki لي، Poinsot توماس، بيريل روير برتراند، Soula جولي، مايكل Vonzy بيار إيف زوندل، سفيان Bouhmadi، Brette أوليفييه، Chambonnier جايل، ايزارد لورا، Kroiss Aurianne، فيليب لوجون، رودريغ أنياس، Rondelet ارنو، وسيلفي Reverchon ديجاردان فاليري)، الرعاة على دعمهم المالي (BIOMERIEUX، ASSYSTEM، EDF، مؤسسة INSA، ENS ليون وإدارة العلوم البيولوجية INSA ليون)، F. Wisniewski صبغ للقراءة نقدية لهذه المخطوطة والدكتور CC سزي هدية التوتر. B. مرساة يتلقى دكتوراه الزمالة من منطقة الرون ألب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
