Summary
Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç sağlar
Abstract
Burada açıklanan yöntem, E. yeniden dizayn oluşmaktadır Güçlü ve metalden-overinducible promotörün kontrolü altında curli genlerin en az sayıda montaj göre, bakteriyel yapışmayı ve bunun sonucunda elde görüntülenmesi ve miktarlarının coli içinde yapışma özellikleri. Bu yöntem uygun mühendislik soyutlama ilkeleri ve sentetik biyoloji standardizasyonu ve BBa_K540000 BioBrick sonuçları (En yeni BioBrick cihazı, mühendislik, iGEM 2011) geçerlidir.
İlk adım, yabani tip soyla arasında yapışma yeteneklerinin arttırılması bu nedenle metal yanıt olarak curli aşırı ayrılmış sentetik operonunun tasarımı içerir, ve. Orijinal curli operon transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri optimize etmek ve curli "doğal" düzenleme kaçmak için siliko güncellenmiştir. Bu yaklaşım, başarı ile curli üretim bizim mevcut anlayış test etmek izin verdi. Moreover, basit bir metal-düzenlenmiş arttırıcının için endojen karmaşık organizatörü (10'dan fazla transkripsiyonel tanımlanır) geçerek curli yönetmelik basitleştirilmesi kontrol etmek çok daha kolay uyum sağlar.
İkinci adım basit yöntemlerin uygulanması ile uyum yeteneklerini kalitatif ve kantitatif değerlendirmesini içerir. Bu yöntemler, biyofilm oluşumunda rol oynayan biyolojik yapıların ne olursa olsun bakteri yapışık bir geniş aralık için de geçerlidir. 24-iyi polistiren plakalar Aderans testi kristal viyole boyandıktan sonra bakteriyel biyofilm hızlı bir ön görselleştirme sağlar. Bu niteliksel test yapışma yüzdesi ölçümü ile bilenmiş olabilir. Böyle bir yöntem çok basit ama iyi bir tekrarlanabilirlik ve yeniden hem de daha önce 1 açıklandığı gibi sadece kristal violet boyama daha doğru. Floresans ve lazer conf tarafından cam slaytlar GFP etiketli bakteri GörselleştirmeÖcal mikroskopi fenomen doğrudan gözlem ile 24 oyuklu plaka deney ile elde edilen sonuçlar güçlendirmek için izin verir.
Introduction
Abiyotik destek Bakteriyel yapışma biyoremediasyonunun, biyokataliz veya mikrobiyal yakıt hücreleri önemli bir rol oynar. Biyoremediasyon süreçleri organik maddelerin düşmeye veya metal dağılımı (immobilizasyon, buharlaşma) veya türleşme değiştirmek için mikroorganizmaların kapasiteleri kullanmak. Bu yararlı faaliyetler endüstriyel ve evsel atıkların kirli su tedavisi için geliştirilen yapay sistemleri de karasal ve sucul ekosistemlerde görülen, fakat. Mikrobiyal aktivite yoğunluğu ve kalitesi değil, aynı zamanda mikroorganizmaların yaşam tarzı (serbest yüzen veya biyofilm içine gömülü) üzerine, fiziko-kimyasal etkenlere bağlıdır. Biyofilm oluşumunu farklı mekanizmalar ile biyosit direnç teşvik bir metabolizma ile ilişkilidir. Bu olgu dolayısıyla en biyoremediasyonun süreçlerinde teşvik edilecektir. Ayrıca, biyofilm oluşumunu kontrol etmek için mühendislik Escherichia coli hücreleri başarıyla uygulanmışbioçipler 2-3 tam hücreli sensörleri hareketsiz.
Metallerin yüksek konsantrasyonu mikroorganizmaların adaptasyonu hücre içine metal konsantre çeşitli hücre dışı matris bileşenleri için bu gibi adsorpsiyon gibi mekanizmalar, akış pompasının aktivasyonu ya da spesifik taşıyıcılar aracılığıyla gerçekleşir. Genetik mühendisliği yoluyla bu bakteri etkinlikler Artıran özellikle Raghu ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi zayıf miktarda yüksek derecede toksik metaller halinde de, laboratuar ölçeğinde metal kirliliğinin etkili ve ucuz bir tedavi sağlar. 2008 4. Bakteriyel iyileştirme bu durumda, iyon değişim reçineleri kullanan klasik kimyasal işlemler ile karşılaştırıldığında, bir rekabetçi ve maliyet tasarrufu yöntemi temsil eder. Yazarlar E. tarif coli şasi genetik bir çok kopyasını dönüşümden sonra bir plazmid sağlayan aşırı akış pompası kodlama gen rcnA eledi ve tarafından kobalt alımını ve ilk saklama için tasarlanmıştırkobalt için tercihli alımını taşıyıcı. Böyle bir gerilme radyoaktif atık tedavi etmek için iyon değiştirme reçineleri için etkili bir alternatif olarak görünmektedir, ama önemli bir mesele çözümlenmemiş işlemi 4 sonunda kirlenmiş bakteri geri kazanılmasıdır. Çalışmalarımızın amacı, cam veya plastik gibi abiyotik destekleri ayrılmamak için özel tasarlanmış bir zorlanma mümkün mühendisi nedenle oldu.
Adhezinleri ve Gram-bakteri tespit yapışık fimbrialar bütünü Arasında, biz curli üretim sağlayan bir sistem tasarlamak için seçtim. Curli E. çıkıntı ince (2-5 nm çapında) ve yüksek agregatif amiloid lifler bir kristalin-olmayan ve çözünmeyen matris olarak 5-7 coli ve Salmonella yüzey. Curli aynı zamanda cansız yüzeyler ve biyofilmlerin 8 gelişme kolonizasyonu yer alırlar. Son zamanlarda Curli cıva iyonlarını 9 bağlamak için gösterilmiştir. Amiloidleri yüksek gerçekten sahip olduğu bilinenörneğin Cu 2 gibi metallerin iyonları için afinite +, Zn 2 + ve Fe 3 + 10. Bu özellik daha da metal kirli atık su arındırma artırabilir. CSG küme curli elyaf üretimi için sorumludur ve iki divergently transkripsiyonu operonlar (Şekil 1) teşkil edilir. ÇSGB, csgA ve csgC genlerin iki curli alt birimleri, CsgA ve ÇSGB kodlama, duygusu operon oluşturmaktadır. CsgC curli biyogenezi sistemi içinde redoks aktivite yer olması ve gözenek davranışı 11 CsgG etkileyecek gibi görünüyor. Bununla birlikte, curli üreten bakterilere çoğunda csgC yokluğunda da protein curli biyogenez üzerindeki kontrolü sadece bir sekunder seviyesi sağlar gösterir. Sistemi basitleştirmek için, biz gen az sayıda çalışmayı tercih edilmiştir.
CsgDEFG düzenleme ve ulaşım gerekli proteinlerin operonencodesCsgA ve ÇSGB hücre yüzeyi için. CsgD csgBAC operonunun bir transkripsiyon aktivatörü ve curli fimbriya ve bu tür selüloz 12 gibi diğer biyofilm parçaların üretimi kontrol ederek ve inhibe kamçı üretimi 13 ile biyofilmin oluşumunun kontrol edilmesinde önemli bir rol oynar. CsgE, CsgF ve CsgG büyük curli protein alt birim CsgA çözünür bir protein olarak salgılanır, üzerinden dış-membran içine bir curli-özgü salgı cihaz oluşturmaktadır. CsgA polimerizasyonu ile oluşan zar-bağlı protein nucleator ÇSGB (14 gözden) üzerine, in vivo olarak bağlıdır. Çeşitli iki-bileşenli sistemler içeren karmaşık bir düzenleyici yollar curli 15-16 gen ekspresyonunu kontrol etmek için gösterilmiştir. Bu karmaşık düzenlemeler bakteriler çevresel uyaranlara yanıt olarak curli üretimi yoluyla kalın biyofilmlerin formu sağlamak, fakat endüstriyel uygulamalar için kontrol etmek zordur. Met kurtarma kolaylaştırmak içinbir endüstriyel işlem sırasında bakteriler al-doldurulmuş, bir katı destek bakteri tespit aslında iyi tanımlanmış bir parametreye (ler) i tarafından kontrol edilmesi gerekmektedir. Curli ve yapışık özelliklerini kendi amiloid doğaya 17 ile bağlantılıdır ve biyoremediasyonun süreçlerini iyileştirmek için kullanılan olabilir, ama basit ve kolayca kontrol cihazı oluşturulmak zorundadır.
Bu 7 genlerin 18 arasında, 5 bir dizi kesinlikle curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, curli salgılanması karmaşık kodlama) için genler gerekli sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. Curli "doğal" düzenlemesi, tasarlanmış ve sentezlenmiştir güçlü ve kobalt-overinducible organizatörü (Şekil 2) kontrol altında bu 5 CSG genleri içeren sentetik operon kaçmak için. Curli kodlama bölgenin adım adım analiz ve fonksiyonel bir syn için tasarım prosedürüsempatik operon tarif edilmektedir. Polistiren ve cam bakteriyel yapışmayı görselleştirmek ve ölçmek için iki yöntem açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Curli Operon arasında BioBrick Tasarımı ve Sentezi
- Genetik organizasyon belirleyin ve curli genlerin endojen transkripsiyonel ve translasyonel sinyalleri yerelleştirilmesine. Bu bilgiler örneğin RegulonDB a veya b EcoGene gibi özel veritabanlarında toplanmış ve ilgili yayınların dikkatli bir okuma ile tamamlanmıştır. Veri yönetimi ve siliko preanalysis Clone Manager yazılımı c ile yapıldı.
- Ilgili kodlama dizileri seçin. Curli sentezi (ÇSGB ve csgA kodlama elyaf monomerler) ve ihracat (csgE csgF ve csgG, Curlin salgılanması karmaşık kodlama) için beş kesinlikle gerekli gen grubu sentetik operon oluşturmak için seçilmiştir. FASTA formatında veri tabanından seçilen dizileri ayıklayın.
CsgGFE küme E'de olduğu gibi anti-duyum coli genomunun haritalanması, onun ters tamamlayıcısı counterp içine bu dizisi dönüştürmek> Süreç molekül> molekülü Invert Klon Yöneticisi araçları Operasyon kullanarak sanat. Fonksiyonu "Arter" (Klon> Arter) kullanılarak csgBA arkasında csgEFG sekans yapıştırın. - Uygun bir promotörün ekleyin. Promotör P RCN kontrolü altında seçilen beş curli genler yerleştirerek, curli kobalt ve nikel varlığında aşırı üretilmiş olarak tahmin edilmektedir. RCN lokus Ni ve Co detoksifikasyon (rcnA) ve soydaş metallo-regülatör (rcnR) sorumlu bir akış pompası kodlar. RcnR rcnA ekspresyonu ve Ni ve Co 19, yanıt olarak, kendi gen kontrol eder. RcnR CDS ihtiva RCN dizisi, bütün RCN intergenik bölge ayrıca rcnA ve 41 birinci nükleotid sekansı csgBAEFG hayali (bütün yapının dizi ek veri olarak verilmiştir Şekil 1), bir ön placedin idi.
- Transkripsiyonel Optimizesinyalleri. Mükemmel bir ribozom bağlanma sitesi (ya da mükemmel RBS = AAGGAGGTATATA) csgBA DNA dizisinin ilk ATG önünde ilave edildi. İkinci bir mükemmel RBS csgEFG sıra önünde ilave edildi. ÇSGB ve csgF ve csgG genleri için endojen RBS muhafaza edildi.
- IGEM standartlara uyması için, cihazın Eco RI kısıtlama siteleri, Pst I (prefix) ve SPE I ve xba I (sonek) içeren standart bir BioBrick önek ve sonek ile çevrili olmalıdır. Cihaz d her iki ucunda karşılık gelen diziler yapıştırın.
- Herhangi Eco RI, Pst I, SPE I ve cihazın xba Ben tanıma sitesi eleyin. Daha fazla montaj işlemi kolaylaştırmak için, BioBrick parçası kendisi bu kısıtlama sitelerin herhangi içeremez. Cihazın siliko kısıtlama analizi bir Pst I csgA sırayla yer rcnR sırayla, bir Pst I site açığacsgE gen ve bir Eco RI sitesi. Bu siteler sırasıyla aygıtı sırasını (ek bilgi) pozisyonu 80 (Mut1), 1340 (Mut2) ve 1830 (Mut3) bulunur ve sessiz mutasyonların tarafından aşağıdaki gibi modifiye edilmiştir.
Mut1 Pst I site CGTCTG değişti CTGCAG
Mut2 Pst I site CAGCAG değişti CTGCAG
GAATT değişti Mut3 Eco RI sitesi GAATTC - Klon Manager yazılımı (Operasyon> Proses molekülleri> Tercüme moleküller) kullanarak çeviri simülasyon yoluyla çalıştırın. Yabani tip curli protein ve sentetik operon tarafından kodlanan proteinler arasında mükemmel bir homoloji doğrulamak üzere dizi hizalama programı BLAST kullanın.
- Sentetik operon ısmarla. Ticari gen sentezi hizmetleri dünya çapında çok sayıda şirket edinilebilir, bizim ortak Genecust (Lüksemburg) idi. Yapay operon (3165 bp) 4 mikrogram birkaç hafta sonra alınan ve pUC57 (pIG2) yerleştirildi.
2. Polistiren üzerine yapışkan bakteri görselleştirin ve sayısal
- M63 az orta (glikoz% 0.2) 2 ml ile 24 kuyu polistiren plakanın her doldurun ve bir gecede kültür 106 hücre ile her bir kuyunun aşılamak. Sallayarak olmadan 18 ila 48 saat boyunca 30 ° C'de bakteriler büyümek. Her sütun (4 kuyu) bir yöntemdir temsil eder. Gerektiğinde uygun kobalt miktarı (25 ila 100 mM) ve antibiyotik (ampisilin 100 μg.L -1) ekleyin. 24-plaka ilk 3 satır 3 tekrarlar ortalayarak yapışık bakteri ölçmek için kullanılan, son satırın sol biyofilm görselleştirmek için kullanılır.
- 24-plaka 3 İlk satır için: Her kuyucuk için, planktonik hücreleri içeren süpernatant kurtarabilirsiniz.
- Dikkatle 1 M63 ml ve havuz 2.2 'de elde edilen ilk süpernatant ile 1 ml yıkama) ile de her durulama. Bu yüzme havuz hücreleri (= S) olarak ifade edilir.
- 1 ml o da biyofilm Kurtarkazıma ve yukarı ve aşağı pipetleme f M63 (= B). Vortex 15 sn. Her modalite karşılık bağlılığı yüzdesini vermek için 600 nm (OD600) de optik yoğunluk gelen yüzey bağlı ve yüzme bakteri sayısını tahmin edin.
- Bağlılık yüzdesi formül kullanılarak hesaplanır: Bx100 / (3XS + B).
- Sadece 24-plaka son satır için: planktonik hücreler atın.
- M63 plakanın altındaki gelişen biyofilm 1 ml ile yıkayın.
- 80 de 1 saat süre ile açık bir plaka kurutun ° C.
- Iyi yüzey bağlı bakteri görselleştirmek için su ile yıkamalar geniş ardından, her içinde 2 dakika süreyle% 20 kristal menekşe renkli 100 ul ekle.
Üç bağımsız testler (plakalar) tekrarlanabilirlik sağlamak için yapılmak zorundadır.
3. Mikroskopi tarafından Camına Bağlanan Bakteri görselleştirin
- Bir floresan şasi alın. E. Hangi constitutivel coli SCC1 e suşuy MG1655 20 plazmid taşıyan sentetik operon curli için uygun bir konak olan üst suşundan gözlenebilir bir fark ile yeşil flüoresan proteini (GFP) ifade eder.
- S23 suşu elde pIG2 plazmid (Eco RI / Pst I pUC57 plazmid yerinde takılı = sentetik curli operon) ile SCC1 Transform. Kontrol suşu S24 21 elde etmek için plazmid bir kontrol (pUC18) ile SCC1 Transform.
- S23 ve kontrol gecede precultures (S24) 30 suşu ° M63 glikoz ile desteklenmiş orta (% 0.2) ve ampisilin (100 μg.L -1) C büyütün.
- Precultures 100 ul ile Petri kapları içinde aynı ortam, 15 ml inoküle. Kobalt (örn. 25 uM) ve uygun konsantrasyonda ilave edin ve kobalt olmaksızın negatif kontrol unutma. Her Petri kabındaki 3 dikdörtgen cam lamel tanıtın. Sallayarak olmadan 30 ° C'de bir gece inkübe edin.
- Fro lamel çıkarınPetri kabı ve dikkatlice boşaltın m. Her bakteriyel artıklarını silerek 70 ° etanol ile emprenye küçük bir pamuk malzeme ile alt yüzünü dikkatle temizleyin. Konfokal gözlem için, lamel daha fiksasyonu sağlamak için birkaç milimetre üzerinde hem üst biter temizleyin.
- Bağlanan bakteri flöresanlı bir mikroskop altında gözlemlenerek, doğrudan fakat hızla, ama dikkatlice örnek kurumasını önlemek edilebilir.
- Konfokal gözlem için, yüzü yukarı yerleştirilen biyofilm kapsadığı üst yüzü ile bir cam slayt üzerine lamel yatırmak. Biyofilm sonra reçine ile cam slayt sabitlenir daha büyük bir lamel ile kaplanır. Biyofilm şimdi alt yüzünde olacak şekilde kurulum Invert.
- Konfokal lazer mikroskop altında kurulum yerleştirin. Bir sağ Axioplan2 LSM510 (Zeiss) konfokal lazer mikroskop Platim platformu f kullanıldı.
- Ayarlama. Excite 488 nm'de GFP ve aralığında bakteriyel floresans 500 ile 600 nm toplamak . Konfokal tarama modu lazer görüntüleri almak için 40x yağ immersiyon objektif kullanın. 1 mikron bir adımı kullanarak katı yüzeyinden büyüme ortamı ile arayüz biyofilmlerin genel olarak üç boyutlu yapılar, tarama.
- IMARIS yazılımı (Bitplane, Zürich, İsviçre) ile üç boyutlu projeksiyonlar gerçekleştirin. İstatistiksel boyuna kesitler boyunca ortalama z değeri analizi ile biyofilm kalınlığı belirleyin. 22, başka bir yerde tanımlandığı gibi biyofilm biovolumes kantitasyonu konfokal z-yığınlarının elde edilebilir.
Bir RegulonDB transkripsiyon birimleri, proje ve sigma, genler ve ribozom bağlanma yerleri, sonlandırıcılar, spesifik transkripsiyonel bağlayıcı sitelerin yanı sıra, düzenleyici ifadeler içine kendi organizasyonu içine operon organizasyonu ve ayrışma ile ilgili mekanistik bilgi sağlar.et = "_blank"> http://regulondb.cs.purdue.edu/index.jsp
b EcoGene veritabanı E. hakkında güncel bilgiler içermektedir coli K-12 genom ve kapsamlı gen bibliyografya dahil proteom dizileri. Büyük bir EcoGene odağı çeviri başlangıç sitelerin yeniden değerlendirme olmuştur. http://ecogene.org/
c http://www.scied.com/dl_cmp9d.htm
d http://partsregistry.org/wiki/index.php?title=Help:BioBrick_Prefix_and_Suffix
Chun Chau Sze, Nan Yang Teknik Üniversitesi, Singapur e Hediye.
f Platim mikroskopik platformu UMS3444 BioSciences'ı Gerland - Lyon Sud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
E. vahşi tip CSG sırası siliko açıklama olarak transkripsiyonel ve translasyonel sinyallerin optimizasyonu ile ilişkili coli K12 tek sentetik curli operon P RCN-CSG Şekil 3 (tamamlayıcı veriler tam sırası) gösterilir tasarlamak için izin verdi. Protokol 2 ve 3 protokol curli üretimi ile ilişkili yapışma görselleştirmek ve ölçmek için kullanılmıştır. 24-iyi polistiren plakalar üzerinde kristal viyole boyama (protocole 2) her bir kuyunun dibinde biyofilm oluşumunu kullanarak hızla görüntülenebilmekte ve mor renk yoğunluk farkı ile gösterildiği gibi yabani tip suşu mühendislik gerginlik daha az yapışık olduğu görülmektedir olabilir (Şekil 4A). Bu nitel yaklaşım bağlılık yüzdesi mühendislik suşu (Şekil 4B) 1,5 kat daha yüksek olduğunu ortaya koymaktadır kantitatif ölçümü ile güçlendirilmiştir. Niceliksel bir Dahası, doğruluk tive yaklaşım kobalt artan konsantrasyonları varlığında yapışma önemli bir takviye ölçümünü sağlar. Gerçekten de, 0 uM, 25 uM ya da 50 uM konsantrasyonda kobalt ile ortamda, yapışık hücre yüzdeleri% 25,% 30 ve% 40, sırasıyla (Şekil 4B) ulaşır. Aderans kabiliyetleri de cam slaytlar üzerinde yetiştirilen GFP etiketli bakteri mikroskopi kullanılarak karşılaştırılabilir. Epifloresans mikroskobu (siyah zemin üzerinde yeşil bakteriler) mühendislik gerinim yabani tip suşu sadece mikro koloniler (Şekil 5) oluşturur ise biyofilm olarak kabul bir çok katman büyük agrega oluşturduğunu ortaya koymaktadır. Konfokal mikroskopi analizi biyofilm üç boyutlu yapısının genel bir görünümünü sağlar ve mühendislik gerginlik daha yoğun ve kalın bir biyofilm (Şekil 6) oluşturan, daha yapışık olduğunu doğrular.
4176fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
Şekil 1. Curli yabani-tip sistem. Curli ÇSGB ve csgA genler tarafından kodlanmış olan iki adet monomerlerden imal edilir. Onların sinyal peptit sayesinde CsgA ve ÇSGB curli monomerler saniyede sistemi yoluyla zar boyunca sitoplazmik transloke edilir. Yani 3 ana bileşenleri, CsgE, CsgF ve CsgG oluşan bir özel makinelerin dış zar boyunca curli monomerlerin translokasyonu izin verir.
Şekil 2. Güçlü ve kobalt-indüklenebilir promotör (BBa_K540001). Promotörü P rcnA transkripsiyonel repressör RcnR tarafından kontrol edilir. RcnR gen P rcnA dan divergently, andojen promotörü P rcnR dan transkripsiyonu edilir. RcnR genin varlığı P rcnA düzenleyici karşı repressör kopya doğru bir oranı sağlarbölge. Kobalt yokluğunda, RcnR DNA üzerinde RcnR kutu bağlanır ve aşağı doğru genlerin tam transkripsiyonel aktivasyonu önler. Kobalt yükselir hücre içi konsantrasyonunun ise, RcnR protein için kobalt bağlayıcı PrcnA artar 19 promotör ve transkripsiyonel aktivite repressör tespit önler.
Şekil 3,. Sentetik operon curli. Curli genlerin P rcnA denetimi altında yerleştirilir. Kendi promotörü, ifade rcnR bastıncı gen yeterli bir kobalt bağımlı bir şekilde curli genlerin ifadesini kontrol etmek için sağlamalıdır. Curli monomer aşırı (ÇSGB ve CsgA), curli spesifik salgı aygıtının bileşenleri (CsgE, CsgF ve CsgG) bağlı periplazmik trafik sıkışmasını önlemek için çok aşırı miktarlarda olması gerekir. Eklenen traductional sinyaller bulunmaktadır gri (RBS = Perfect RBS) olarak endikedir. E = Eco RI X = xba Ben S = SPH I P = Pst I. Bba_K540000 olarak adlandırılan bu sentetik bölümü mühendislik gerinim curli aşırı yoluyla cam, kum veya plastik yapışık olmayı sağlar.
Şekil 4. 24-kuyu polistiren plaka üzerinde yapışık bakteri Görselleştirme ve miktar. A. Kristal viyole ile boyanmış biyofilm polistren yapışık bakteriler tarafından oluşturulan. Vahşi tip ve kobalt çeşitli konsantrasyonları ile mühendislik suşların polistiren tutunmayı B. yüzdesi. Tedaviler arasında istatistiksel farklılıklar küçük harfler (p <0.05 varyans ve Fisher'in en küçük anlamlı fark testi analizi) ile gösterilir.
76/4176fig5.jpg "alt =" Şekil 5 "/>
Şekil 5,. Yapışık GFP etiketli cam slaytlar üzerinde bakteri. Bakterilerin Epifloresans mikroskobu görüntüleri siyah bir arka plan üzerinde yeşil. Oklar mikrokoloniler de işaret etmektedir.
Şekil 6. Konfokal microscropy cam slaytlar biyofilm yapısının üç boyutlu rekonstrüksiyon destekli: A. Üst Görünüm rekonstrüksiyonlar B. Yan görünüm rekonstrüksiyonlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritik adımlar
Bu sentetik biyoloji yaklaşımda en önemli adım gen tasarımıdır. Sentetik gen tasarım etkili bir sistem üretimi sağlamak için titiz olmak zorundadır. Nükleer atık ve biyo-dekontaminasyon: kendi salgı sisteminin içinde yer proteinleri kodlayan elyaf monomerler ve üç gen kodlayan iki gen bir roman uygulama için yeni bir işlevsel birim oluşturmak için güçlü ve metal-uyarılabilir kolaylaştırıcı ile monte edilmiştir. Planlı ve tahmin edildiği gibi, bu cihaz ortamda kobalt miktarını artırarak takviye geliştirilmiş yüksek curli üretimi, yol açar. Seçilen promotör (P rcnA) olarak uygun transkripsiyonel sinyalleri ve verimli translasyonel sinyallerin varlığının gelen bu tür bir başarı sonuçlar curli genlerin her bir seti (csgBA ve csgEFG) (bkz. Şekil 3) önünde eklendi. Buna ek olarak, bir ÇOKLU plazmid, dikkat çalışırken promotör kontrolü dahil regülatörü kopya sayısı (ler) için ödenecek vardır. Burada kullanılan promotör (P rcnA) ana düzenleyici RcnR arasında multicopies aynı plasmidi (Şekil 3) temin edilmiştir.
Sınırlamalar, olası değişiklikler
Mükemmel Yeniden Üretilebilirliği sağlamak için, bağlılık testi (bkz. Tablo) polistiren levhaların aynı marka içinde yapılması gereken her zaman vardır. Floresans mikroskop floresan etiketli suşlar daha kolaydır, ancak bu gereklilik, syto veya plazmid taşıyan lac-GFP füzyon 23 olarak floresan boyalar kullanılarak aşılabilir. Örneğin polistiren ve cam gibi abiyotik yüzeylere bakteriyel bağlanma orta iyonik kuvvet veya osmolarite bağlıdır. En iyi sonuçlar, genellikle en az orta ya da seyreltilmiş LB 22, 24 elde edilir.
Gelecekteki uygulamalar veya mastering sonra tarifi bu tekniğin
içerik "> yöntem bakteriyel yapışmayı hızlı ve ucuz olan ölçmek için burada açıklanan. Bununla birlikte, soyu veya kültür koşullarında çok sayıda karakterize etmek için, ve / veya biyofilmlerin ayrıntılı yapısal karakterizasyonu, konfokal tarama laser mikroskopisi göre yüksek verim elde etmek için yöntem 96-kuyu mikrotiter plakaların kullanımı ile kombine 25 göz önünde bulundurulmalıdır.MBEC tarama sistemi, önceden Calgary Biyofilm Cihaz 26, ayrıca kullanılabilmektedir. Bu sistem bir su tablası sonikatör (üzerine sonication tarafından karışıklıktan sonra biyofilm içinde biyofilm yapısı 27 veya hücre miktarının mikroskobik gözlemler sağlayan 96 mandal substratum tutun çıkarılabilir kapaklı bir mikrotitre plaka kullanımına dayanmaktadır MBEC Yüksek throughput ( HTP) Testi, Innovotech, Edmonton, Kanada). Başka bir sistem, biyofilm Ring Test, kültür ortamında bulunan atıl paramanyetik taneler, formasyon esnasında hareketsiz olan kullanılıpbiyofilm 28, ve biyofilm oluşumunu ölçmek için kullanılabilir. MBEC ve Biyofilm Ring Test Bu çalışmada kullanılan temel sarf daha pahalı özel malzemeler gerektirir.
Mevcut yöntem ile ilgili olarak teknik önemi
Sentetik bir yaklaşım burada açıklanan ve iç Eco RI ve Pst I restriksiyon siteleri ve yaklaşımların ardından PCR adımları kaldırmak için mutagenez içeren klasik bir yöntemi: Tek bir bağımsız curli operon oluşturmak için, biz iki paralel yöntemler denedi. Her iki yaklaşım aynı zamanda başlatılabilir, ancak klasik yöntemi ile elde edilen sentetik operon dizi analizi ile istenmeyen mutasyonları tespit edildi. Bu yüzden, cihazın daha verimli sentezi ve klasik klonlama ve mutagenez prosedürleri daha hızlı olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz Lyon INSA-ENS iGEM ekibi (Viviane Chansavang, Mathilde Dumond, Alexandre Duprey, Mélanie Geffroy'nın, Clemence Gonthier, Margaux Jaulin, Aurélie Haag, Goki Ly, Thomas Poinsot, Béryl Royer-Bertrand, Julie Soula, Michael Vonzy diğer üyeleri teşekkür , Pierre Yves Zundel, Soufiane Bouhmadi, Olivier Brette, Gaël Chambonnier, Laura Izard, Aurianne Kroiss, Philippe Lejeune, Agnès Rodrigue, Arnaud Rondelet, Sylvie Reverchon ve Valérie Desjardin), mali destek için sponsorlar (bioMérieux, Assystem, EDF, Fondation INSA, ENS-Lyon ve Biosciences INSA-Lyon Bölümü), kritik bu yazının okuma ve zorlanma hediye Dr CC Sze F. Wisniewski-dye. Drogue B. Doktora alır Région Rhône-Alpes bursu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pIG2 | pUC57(pMB1 ori, 2710 bp) with a 3165 bp EcoRI/PstI fragment containing the synthetic Prcn-csgBAEFG operon ; Ampr | ||
| pUC18 | Multicopy plasmid (pMB1 ori, 2686 bp), Ampr | ||
| S23 | SSC1 (= GFP-tagged MG1655, gift of C.C. Sze)/pIG2 | ||
| S24 | SSC1/pUC18 | ||
| CoCl2 | Sigma | 0,1M stock solution kept at Room Temperature | |
| M63 | 29 | ||
| 24-well plate | Nunc | 55429 | Polystyrene 24-well plates |
References
- O'Toole, G. A. Microtiter Dish Biofilm Formation Assay. J. Vis. Exp. (47), e2437 (2011).
- Melamed, S., Elad, T., Belkin, S. Microbial sensor cell arrays. Curr. Opin. Biotechnol. , (2011).
- Melamed, S. A printed nanolitre-scale bacterial sensor array. Lab Chip. 11, 139-146 (2011).
- Raghu, G., Balaji, V., Venkateswaran, G., Rodrigue, A., Maruthi Mohan, P. Bioremediation of trace cobalt from simulated spent decontamination solutions of nuclear power reactors using E. coli expressing NiCoT genes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 81, 571-578 (2008).
- Olsen, A., Jonsson, A., Normark, S. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organelles on Escherichia coli. Nature. 338, 652-655 (1989).
- Prigent-Combaret, C., et al. Developmental pathway for biofilm formation in curli-producing Escherichia coli strains: role of flagella, curli and colanic acid. Environ. Microbiol. 2, 450-464 (2000).
- Chapman, M. R., et al. Role of Escherichia coli curli operons in directing amyloid fiber formation. Science. 295, 851-855 (2002).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Hidalgo, G., Chen, X., Hay, A. G., Lion, L. W. Curli produced by Escherichia coli PHL628 provide protection from Hg(II). Appl. Environ. Microbiol. 76, 6939-6941 (2010).
- Garzon-Rodriguez, W., Yatsimirsky, A. K., Glabe, C. G. Binding of Zn(II), Cu(II), and Fe(II) ions to Alzheimer's A beta peptide studied by fluorescence. Bioorg. Med. Chem. Lett. 9, 2243-2248 (1999).
- Taylor, J. D., et al. Atomic resolution insights into curli fiber biogenesis. Structure. 19, 1307-1316 (2011).
- Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
- Pesavento, C., et al. Inverse regulatory coordination of motility and curli-mediated adhesion in Escherichia coli. Genes Dev. 22, 2434-2446 (2008).
- Dueholm, M. S., et al. Fibrillation of the major curli subunit CsgA under a wide range of conditions implies a robust design of aggregation. Biochemistry. 50, 8281-8290 (2011).
- Jubelin, G., et al. CpxR/OmpR interplay regulates curli gene expression in response to osmolarity in Escherichia coli. J. Bacteriol. 187, 2038-2049 (2005).
- Ogasawara, H., Yamamoto, K., Ishihama, A. Role of the biofilm master regulator CsgD in cross-regulation between biofilm formation and flagellar synthesis. J. Bacteriol. 193, 2587-2597 (2011).
- Mostaert, A. S., Higgins, M. J., Fukuma, T., Rindi, F., Jarvis, S. P. Nanoscale mechanical characterisation of amyloid fibrils discovered in a natural adhesive. J. Biol. Phys. 32, 393-401 (2006).
- Hammar, M., Arnqvist, A., Bian, Z., Olsen, A., Normark, S. Expression of two csg operons is required for production of fibronectin- and congo red-binding curli polymers in Escherichia coli K-12. Mol. Microbiol. 18, 661-670 (1995).
- Blaha, D. The Escherichia coli metallo-regulator RcnR represses rcnA and rcnR transcription through binding on a shared operator site: Insights into regulatory specificity towards nickel and cobalt. Biochimie. 93, 434-439 (2011).
- Miao, H., Ratnasingam, S., Pu, C. S., Desai, M. M., Sze, C. C. Dual fluorescence system for flow cytometric analysis of Escherichia coli transcriptional response in multi-species context. J. Microbiol. Methods. 76, 109-119 (2009).
- Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2172-2175 (1989).
- Perrin, C. Nickel promotes biofilm formation by Escherichia coli K-12 strains that produce curli. Appl. Environ. Microbiol. 75, 1723-1733 (2009).
- Bloemberg, G. V., Wijfjes, A. H., Lamers, G. E., Stuurman, N., Lugtenberg, B. J. Simultaneous imaging of Pseudomonas fluorescens WCS365 populations expressing three different autofluorescent proteins in the rhizosphere: new perspectives for studying microbial communities. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 1170-1176 (2000).
- Landini, P., Jubelin, G., Dorel, C. Biological Adhesives. Callow,, J., Smith, A. M. , Springer-Verlag. (2006).
- Bridier, A., Dubois-Brissonnet, F., Boubetra, A., Thomas, V., Briandet, R. The biofilm architecture of sixty opportunistic pathogens deciphered using a high throughput CLSM method. J. Microbiol. Methods. 82, 64-70 (2010).
- Ceri, H., et al. The Calgary Biofilm Device: new technology for rapid determination of antibiotic susceptibilities of bacterial biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776 (1999).
- Harrison, J. J., et al. The use of microscopy and three-dimensional visualization to evaluate the structure of microbial biofilms cultivated in the Calgary Biofilm Device. Biol. Proced. Online. 8, 194-215 (2006).
- Chavant, P., Gaillard-Martinie, B., Talon, R., Hebraud, M., Bernardi, T. A new device for rapid evaluation of biofilm formation potential by bacteria. J. Microbiol. Methods. 68, 605-612 (2007).
- Miller, J. E. Experiments in molecular genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, N.Y. (1972).
