Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые

doi: 10.3791/4178 Published: August 14, 2012

Summary

В патогенезе костных метастазов, ангиогенез является важным процессом и, следовательно, представляет собой мишень для визуализации и терапии. Здесь мы представляем крысиной модели конкретных участков груди метастазы рака костей и описать стратегии неинвазивно изображения кровеносных сосудов

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Культуре клеток

  1. Культура MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы (Американская коллекция типовых культур) в RPMI-1640 (Invitrogen, Германия) с добавлением 10% FCS (Sigma, Германия). Держите всех культур в стандартных условиях (37 ° C, увлажненной атмосфере 5% CO 2) и прохождение клеток 2-3 раза в неделю, чтобы держать их в логарифмического роста. Для животных моделях, описанных ниже, нет необходимости для использования в костной сублиний MDA-MB-231 клеток опухоли скорость взять более 90% 1.
  2. Урожай суб-сливной опухолевых клеток после использования 2 мМ ЭДТА в PBS-(фосфатно-солевом буфере без Са 2 + и Mg 2 +) и 0,25% трипсина (Sigma, Тауфкирхен, Германия). Граф MDA-MB-231 клеток в камере Нойбауэр и приостановить их в RPMI-1640 (5x10 5 клеток в 1 мл).

2. Обнаженная модель крысы костных метастазов

  1. Все эксперименты были одобрены ответственными правительственными анимал комитета по этике.
  2. Используйте обнаженной крыс в возрасте 6-8 недель и держать их на возбудителя без условий в соответствующей небольшой системы животного (например, мини-барьер системы). Держите животных в контролируемых условиях (21 + / - 2 ° C комнатной температуры, влажности 60% и 12 час свет-темнота ритма) и предлагают автоклавного корм и воду без ограничений объявление на крысах.
  3. Прежде чем животное операции, вводят обезболивающий препарат (например, Carprofen 4 мг / кг подкожно, в связи с его однократного введения и коротким периодом полувыведения (около 8 часов), carprofen не должны влиять на рост опухоли). Обезболить крыс смесью кислорода (0,5 л / мин) и ИФ (1-1,5% об.) И убедитесь, что крысы под наркозом правильно и регулярно вдыхает до начала следующей процедуры.
  4. Положите под наркозом животным под соответствующий операционный микроскоп бинокулярный (например, Leica) и работать с увеличением в 16 раз.
  5. Начало хирургического вмешательства путем разрезания кожи и подкожной клетчатки в ИнгуИнал области при длине 2-3 см с помощью ножниц (BC060r Iris ножницы 108 мм). Все артерии, отходящие в бедренную артерию (ФА) должны быть расчлененным в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА).
  6. Поместите клипы на бедренной артерии проксимальнее происхождения СЭО, а также на DGA, PA и SA на временно закрывают местный кровоток. Перевязывать моря в его дистальной части, чтобы открытие этого судна без кровотечения (рис. 1а).
  7. Разрежьте SEA с помощью ножниц (Vannas Micro-SCRS протектором STR 85 мм) из проксимальных перевязки (рис. 1б) и управления 1% папаверин решение на море, чтобы облегчить последующие вставки иглы за счет расслабления сосудов ( Рис 1С).
  8. Отрежьте примерно половина диаметра моря с ножницами и вставить иглу (0,3 мм и 42 мм длиной) в просвет на море, holdiнг разреза конца сосуда с пинцетом (рис. 1D, E). Если возможно, фиксировать иглу в внешнее устройство к снижению нелегальной движений, которые могут привести к перфорации стенки сосуда. Подключите шприц с иглой. Удалить клип из дистального Англии и разместить его на подкожной артерии (рис. 1F).
  9. Вводите MDA-MB-231 приостановлены клеток в 0,2 мл среды медленно в море. В силу клипы MDA-MB-231 клеток направлены на DGA и ПА. Вытащите иглу и перевязывать море, чтобы предотвратить кровотечение перед взлетом артерии клипов. Закройте рану с помощью хирургического клипы и прекратить ингаляционной анестезии.
  10. Для пост-процедура наблюдения, крысы, как правило, усыпляют 7-8 недели после прививки опухоли клетки, чтобы избежать тяжелых костных осложнений. За это время животные должны контролироваться ежедневно оценить размер опухоли и каких-либо признаков боли (например, поведенческие отклонения, потеря веса, двигатель дефекты). Если животные показать опухольразмер превышает допустимый предел этически или свидетельство о боли во время роста опухоли, они должны быть умерщвлены.
  11. Иммуно-дефицитные (ню) крыс были использованы для ксеногенной трансплантации человеческих MDA-MB-231 клеток рака молочной железы. Голая крысы не были выбраны, чтобы лучше представить себе растущую опухоль.

3. Магнитно-резонансная томография (МРТ)

  1. После прививки опухоли клетки, позволяющие приблизительно 25-30 дней роста опухоли до начиная с изображениями. Для МРТ использовать специальный сканер или экспериментальной системы человека MR с соответствующей катушкой животных. Мы использовали человеческие MR системы (симфонии, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации, выполненная в виде цилиндрического объема резонатора с внутренним диаметром 83 мм и полезная длина 120 мм (рис. 2A).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью крана е. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 0,1 ммоль / кг Gd-DTPA примерно 0,5 мл; Магневист, Bayer Schering-Германия).
  3. Положите крысу в системе MR поддержания ингаляционной анестезии. Начнем с последовательности морфологических MR, чтобы найти костных метастазов (например, Т2 взвешенное: турбо последовательности спинового эха, TR 3240 мс, TE 81 мс матрицей 152 х 256, угол обзора 90 х 53,4 мм 2, толщина среза 1,5 мм, 3 средних, сканирование Время 3:40 мин).
  4. Определить кусочек костных метастазов с большим диаметром и начать последовательность DCE-MRI (например, насыщенность восстановление турбо мигания, TR 373 мс, TE 1,86 мс матрицей 192 х 144, угол обзора 130 х 97,5 мм 2, толщина среза 5 мм, измерение 512, в среднем 1, время сканирования 6:55 мин). После примерно 30 секунд, начала вводить контрастное вещество в течение периода времени от 10 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения МРТ примерно 15-20 минут на одно животное.
Название "> 4. Объемная компьютерная томография (ДКТ)

  1. Выберите подходящую систему КТ, либо человека или экспериментальных сканера. Здесь мы использовали прототип плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (рис. 2В; Объем КТ, Siemens, Германия).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий контрастного вещества (например, 1 г йода на кг примерно в 0,5 мл; Imeron 400 Бракко, Германия).
  3. Положите крысу на сканере при ингаляционной анестезии. Используйте следующие параметры сканирования для ДКТ: трубки напряжение 80 кВ, ток трубки 50 мА, время сканирования 51 сек, скорость вращения 10 секунд, кадров в секунду, 120, матрицы 512 х 512 и толщина среза 0,2 мм. Вводите контрастное вещество во втором вращения плоской системы управления. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения ДКТ экспертизы составляет примерно 5-10 минут в анимдр..
  4. Реконструкция изображений с модифицированной FDK (Фельдкамп-Davis-Кресс) в конусе лучей алгоритм восстановления (ядро H80a, Афра, Германия).

5. Ультразвуковое исследование (США)

  1. Экспериментальные и клинические США системы для этой цели. Мы использовали клинические системе Acuson Sequoia 512 Ультразвуковая система с линейным датчиком 15L8 (рис. 2, Siemens-Acuson, Mountain View, CA).
  2. Обезболить крысы с кислородом и ИФ, как указано выше. Поместите катетер в вену хвоста и закрепить его на хвосте помощью ленты. Подключите шприц, содержащий микропузырьков контрастного вещества (например, 1,6 мл / кг около 0,5 мл; SonoVue, Бракко, Италия). Закрепите датчик США на соответствующей задней ноги штатива и применять гель США между датчиком и задние ноги.
  3. Выполните B-режиме (частота передачи: 17 МГц; механический индекс: 0.51) для определения наибольшего диаметра костных метастазов и установить датчик в тсвою позицию. Добавить доплеровский сигнал на В-режим изображения для получения информации о тканевой перфузии. Пожалуйста, имейте в виду, что только поражения, которые нарушают кортикальной кости доступны в США волн.
  4. Для динамической контрастности повышенной США (DCE-US), настройки устройства США в каденцию отличие импульса последовательности (CPS) режиме (частота передачи: 7 МГц; механический индекс: 0.18), вводят микропузырьков и записывать кино петля длиной 90 сек. Общее время для вышеупомянутых процедур для выполнения экспертизы США составляет примерно 10-15 минут на одно животное.

6. Постобработка данных изображений

  1. Использование морфологического информации от МРТ, ДКТ и США характеризуют мягкие ткани опухоли (МРТ, США) и скелетных уничтожения (ДКТ) костных метастазов и определения местоположения, размер повреждения и объем поражения с DICOM Viewer (например, Osirix Dicom Viewer).
  2. Для получения ветвления сосудов в метастазах в кости (ангиография), ДКТ данные могут быть использованы. Повторнопостроить 2D или 3D-изображения, используя информацию артериальной фазы с или без методов вычитания (например, Osirix Dicom Viewer).
  3. Для количественной оценки показателей васкуляризации от DCE-MRI, DCE-VCT и DCE-США, использовать программные средства для конкретных условий. Для DCE-MRI, определить амплитуду сосудистые параметры (связанные с объемом крови) и обменного курса к постоянной р (связанные с перфузии и судно проницаемости) в костных метастазов с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия) на основе двух- Отсек модель Brix 8,9. Альтернативные фармакокинетические модели для оценки имеются, например, Tofts модель 10.
  4. Для количественной оценки DCE-VCT данных, выполнять описательный анализ данных для расчета параметров, таких как площадь под кривой (AUC) и пик повышения (PE) с Dyna Lab (MEVIS исследований, Бремен, Германия).
  5. Количественной информации в режиме реального времени DCE-американского использования количественных программного обеспечения для анализа (например, Qontrasт, Бракко, Италия), анализируя кино-петли в соответствии с моделью осуществляется введение болюса. Поместите области интереса (ROI) в костных метастазов, определение или описательным такие факторы, как площадь под кривой или количественные параметры из цветных карт, например, региональные объема крови, регионального кровотока и время заполнения.

7. Представитель Результаты

После внутриартериального введения MDA-MB-231 клеток в море (рис. 1), сайт-специфические метастазы в кости развиваются в соответствующих задние ноги обнаженной крысы. Остеолитические поражение ограничивается бедра, голени и малоберцовой кости могут быть отображены неинвазивно с помощью МРТ, ДКТ и США (рис. 2), начиная примерно 25-30 дней после инъекции и после-до нескольких недель. При объединении МРТ, ДКТ и США, включая родных и контрастным усилением техники, дополнительная информация может быть оценен в костных метастазов, которые состоят из мягкой тканиопухоли (опухолевых клеток и стромы) и соответствующие поражения остеолитические (костной деструкции). Для сравнения соответствующих данных между методами, все три формы изображения могут быть использованы последовательно в том же крыса. МРТ показывает морфологии костного метастатического мягких тканей, что изначально ограничены полости костного мозга, а затем превышает кортикальной кости в процессе развития. Функциональные параметры, такие как региональные объем крови, перфузии и судно проницаемость может быть получена от DCE-MRI и количественно (рис. 3). Структура кости и, в частности остеолитические изменений в метастазах оценивается в высоком разрешении по ДКТ. В дополнение к МРТ, остеолитические поражения расположены рядом с интрамедуллярного рост опухоли. ДКТ ангиография выявляет измененные архитектуры macrovessel метастазов в кости, и DCE-VCT отображает соответствующие аспекты микроциркуляции (рис. 4). В связи с локального разрушения кортикальной кости в metastatiС поражением США применяется для оценки морфологических и функциональных особенностей мягких тканей опухоли с использованием B-режима и доплеровского методов. По заявлению микропузырьков, DCE и США позволяет в режиме реального времени изображения васкуляризации метастазы в кости (рис. 5).

Рисунок 1
Рисунок 1. Задние ноги обнаженной крысы готовы к опухоли клетки прививки изображение получено путем операции микроскопом. , Ветвящиеся структуры бедренной артерии (FA) в том числе поверхностный эпигастральной артерии (СЭО), нисходящей артерии коленными (DGA), подколенной артерии (ПА) и подкожной артерии (СА). Артериальная клипы размещены на СА, ПА и проксимальных Англии, а также перевязки МОРЕ, В, SEA была вырезана из проксимальных перевязки, C, мышечная релаксация море после того папаверина, D, разрез по СЭО (подхвачена щипцы), E, ​​введение иглы в море, F, фиксируется игла в море (внешний Fi xating устройства) и инъекции MDA-MB-231 опухолевых клеток по СЭО в DGA и ПА в силу клипов.

Рисунок 2
На рисунке 2, человеческая система MR (Симфония, Siemens, Германия) и самодельный катушка для радиочастотного возбуждения и регистрации помещен в сканер;. B, плоская панель оборудована объемной компьютерной томограф (КТ том, Siemens, Германия), C, клинической ультразвуковой системы Acuson Sequioa 512 (Siemens-Acuson, Mountain View, CA).

Рисунок 3
Рисунок 3. Осевая MR разделов. Левая панель, T2w МРТ, средняя панель, амплитуда (DCE-MRI), правая панель, обменный курс к постоянной р (DCE-MRI). Стрелки указывают на метастазы в кости. Цветовую карту для DCE-MRI данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).

78/4178fig4.jpg "/>
Рисунок 4. 3D реконструкции ДКТ в остеолитические метастазы кости (левая панель) и ангиография (средняя панель), а также DCE-VCT раздел ориентации осевой от повышения параметров пик (справа). Цветовую карту для DCE-VCT данных в диапазоне от красного (высокие значения) до синего (низкие значения).

Рисунок 5
Рисунок 5. США изображений в В-режиме (морфология, на левой панели), доплеровский (перфузии, средняя часть) и CEUS (на правой панели, максимальное повышение после инъекции микропузырьков в реальном масштабе времени изображений васкуляризации) из костных метастазов.

Справочная фильм 1. Щелкните здесь для просмотра дополнительных кино .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Метод вызывая экспериментальные метастазы в кости, представленные здесь, в сочетании с изображениями процедуры позволяют последующих остеолитические поражения в обнаженном крыс в продольном направлении. В нашей модели MDA-MB-231 человеческих клеток рака молочной железы вводят в море, которое анастомоза между подвздошной артерии через pudendoepigastric ствола и бедренной артерии. Таким образом, приток крови в область поставляется в коленном суставе сохраняется после перевязки СЭО. Преимущества этой модели по сравнению с установленным образцам костных метастазов являются сайт-специфические появление метастазов в кости по сравнению с моделью внутрисердечных инъекций 11 и включение патогенных процессов опухолевых клеток и кровоизлияние миграции в ткани-мишени по сравнению с Модель голени инъекций 12. Кроме того, в этой модели системной нагрузки опухоли, в частности, висцеральный распространения опущен, который позволяет для продольного исследования по себеveral недель, и таким образом позволяет снизить необходимую животных 1,13.

Роль ангиогенеза в качестве основных процесса, направленного на пролиферацию опухолевых клеток и вызывает резорбции костной ткани в патогенезе костных метастазов было ранее продемонстрировано в экспериментах исследования естественных 14,15. Здесь мы представляем в естественных методов визуализации для неинвазивно оценить ангиогенез в этих поражениях применением МРТ, ДКТ и США. Использование обнаженной модели крысы, дополнительную информацию, васкуляризации в том числе информацию о функциональных объема крови и проницаемость судно / перфузии (DCE-MRI, DCE-VCT), судно морфологии в высоком разрешении (ДКТ ангиография), перфузии (США Доплера) и в режиме реального времени визуализации васкуляризации (DCE-US) может быть получена 1-7,16.

Визуализация ангиогенных параметров с помощью МРТ, ДКТ и США позволяет выяснения патогенетической роли ангиогенеза в скелетных метастазов неинвазивным и в естественных условиях 3,4,6. Еще одно применение вышеупомянутых методов визуализации является исследование терапевтического эффекта в продольных исследованиях на антиангиогенного или стандартной терапии для скелетных метастазов. Для демонстрации фармакологический ответ, продольных исследований, охватывающих до 70 дней после прививки опухоли клетки с группой размеры от 8 до 17 крыс были выполнены для демонстрации противоопухолевой, анти-ангиогенеза и анти-резорбтивного эффекта 2-7,17. В связи с применением методов визуализации на сканеры для человека в животное клинически значимые модели, представленной процедуры высоких поступательных значение для оценки ответа на лечение у больных с метастазами в кости 16.

В заключение, используя этот сайт-специфические животных моделях рака молочной железы, метастазы в кости, морфологические и функциональные аспекты ангиогенеза могут быть отображены неинвазивным и в естественных условиях

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB-TR 23 и SFB-TR 79, туберкулезом и DK). Авторы хотели бы поблагодарить Ренате Bangert Карин Leotta и Лиза Зейлера за отличную техническую помощь.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MDA-MB-231 human breast cancer cells American Type Culture Collection HTB-26
RPMI-1640 Invitrogen 61870
FCS Invitrogen 10270
Trypsin-EDTA Invitrogen 25300
Carprofen Rimadyl Pfizer Pharma GmbH PZN 110208
Magnevist Bayer-Schering PZN 6961516
Imeron 400 MCT Bracco PZN 228654
SonoVue Bracco PZN 1567358
Papaverin Alfa Aesar L 04152
Isofluran Baxter Internationl Inc. HDG 9623
Symphony (Magnetic resonance imaging) Siemens AG
Volume CT (Volumetric computed tomography) Siemens AG
Acuson Sequioa 512 (Ultrasound) Siemens-Acuson

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bäuerle, T. Characterization of a rat model with site-specific bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells and its application to the effects of an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Cancer. 115, 177-186 (2005).
  2. Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W., Bäuerle, T. Sorafenib tosylate and paclitaxel induce anti-angiogenic, anti-tumor and anti-resorptive effects in experimental breast cancer bone metastases. Eur. J. Cancer. 47, 277-286 (2010).
  3. Bäuerle, T. Cilengitide inhibits progression of experimental breast cancer bone metastases as imaged noninvasively using VCT, MRI and DCE-MRI in a longitudinal in vivo study. Int. J. Cancer. 128, 2453-2462 (2011).
  4. Bäuerle, T., Merz, M., Komljenovic, D., Zwick, S., Semmler, W. Drug-induced vessel remodeling in bone metastases as assessed by dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging and vessel size imaging: a longitudinal in vivo study. Clin. Cancer Res. 16, 3215-3225 (2010).
  5. Bäuerle, T. Imaging anti-angiogenic treatment response with DCE-VCT, DCE-MRI and DWI in an animal model of breast cancer bone metastasis. Eur. J. Radiol. 73, 280-287 (2010).
  6. Bäuerle, T. Bevacizumab inhibits breast cancer-induced osteolysis, surrounding soft tissue metastasis, and angiogenesis in rats as visualized by VCT and MRI. Neoplasia. 10, 511-520 (2008).
  7. Merz, M., Komljenovic, D., Semmler, W., Bäuerle, T. Quantitative contrast-enhanced ultrasound for imaging anti-angiogenic treatment response in experimental osteolytic breast cancer bone metastases. Forthcoming (2012).
  8. Brix, G. Pharmacokinetic parameters in CNS Gd-DTPA enhanced MR imaging. J. Comput. Assist. Tomogr. 15, 621-628 (1991).
  9. Brix, G. Microcirculation and microvasculature in breast tumors: pharmacokinetic analysis of dynamic MR image series. Magn. Reson. Med. 52, 420-429 (2004).
  10. Tofts, P. S. Estimating kinetic parameters from dynamic contrast-enhanced T(1)-weighted MRI of a diffusable tracer: standardized quantities and symbols. J. Magn. Reson. Imaging. 10, 223-232 (1999).
  11. Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48, 6876-6881 (1988).
  12. Kjonniksen, I., Winderen, M., Bruland, O., Fodstad, O. Validity and usefulness of human tumor models established by intratibial cell inoculation in nude rats. Cancer Res. 54, 1715-1719 (1994).
  13. Bäuerle, T. Treatment of bone metastasis induced by MDA-MB-231 breast cancer cells with an antibody against bone sialoprotein. Int. J. Oncol. 28, 573-583 (2006).
  14. Andersen, T. L. A physical mechanism for coupling bone resorption and formation in adult human bone. Am. J. Pathol. 174, 239-247 (2009).
  15. Nyangoga, H., Mercier, P., Libouban, H., Basle, M. F., Chappard, D. Three-dimensional characterization of the vascular bed in bone metastasis of the rat by microcomputed tomography (MicroCT). PLoS One. 6, e17336 (2011).
  16. Bäuerle, T., Semmler, W. Imaging response to systemic therapy for bone metastases. European Radiol. 19, 2495-2507 (2009).
  17. Bretschi, M. Cilengitide inhibits metastastic bone colonization in a nude rat model. Oncol. Rep. 26, 843-851 (2001).
Мульти-модальных изображений ангиогенеза в обнаженной модели крысы из груди метастазы рака костей с помощью магнитного резонанса, компьютерной томографии Объемные и ультразвуковые
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound. J. Vis. Exp. (66), e4178, doi:10.3791/4178 (2012).More

Bäuerle, T., Komljenovic, D., Berger, M. R., Semmler, W. Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound. J. Vis. Exp. (66), e4178, doi:10.3791/4178 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter