蒸発フラックス法（EFM）を使用した照度と脱水に葉の通水コンダクタンスと気孔コンダクタンスとその応答の測定

Summary

我々は、葉の通水コンダクタンスの同時測定のための比較的急速（30分間）と現実的な方法を説明する（

Abstract

水は重要な資源であり、植物の水輸送システムは、最大の成長と耐乾性に制限を設定します。植物は光合成のCO _2を捕捉するために、高気孔コンダクタンス（G _s）を達成するための気孔を開いたときに、水が蒸散^1,2によって失われる。空域から蒸発する水は、茎と根の木部からターン図面で、葉脈の木部から水を描画順番に、細胞壁から置き換えられます。水がシステムを介して引っ張られるように、それはシステム全体の緊張と低い葉の水ポテンシャル（Ψ _葉 ） _を作成_し 、油圧抵抗が発生します。葉自体が植物油圧抵抗³の平均30％を占め、プラント全体のシステムの重要なボトルネックになっています。葉の通水コンダクタンス（K _葉 = 1 /リーフ油圧抵抗）が葉全体で水の電位勾配に水の流量の比であり、まとめ維管束鞘に葉柄を通って静脈のいくつかの注文を通って水が移動し、終了し、空域に蒸発させ、気孔から蒸散される前に、葉肉細胞を介して、または周りに渡し、K _葉は次のよう_に強い関心がある：複雑なシステムの挙動。種を比較するための重要な生理的形質、水輸送、および構造の変動との関係（ 例えば 、葉の葉脈アーキテクチャ）と光合成のガス交換に及ぼす影響に対して調査するキー変数の葉の構造と生理機能の有効性を定量化する。さらに、Kの _{葉は、K葉は}アクアポリン、膜^4を介して水の輸送に関与するタンパク質の発現および活性の変化により明らかに照度を劇的に増やすことができます。内部および外部の葉の環境³に強く応答し、Kの _葉は中に強く辞退DRキャビテーションおよび/ ​​または葉肉と維管束鞘細胞収縮または非活性化アクアポリン^5月10日のために超木部組織における木部導管、及び/又は透磁率の損失の崩壊に起因する、べきである。 Kの _葉がうまく骨抜き状態における種間や干ばつ時の_G Sと光合成速度を抑制する、したがって、全体のプラント性能を制限することができるので、干ばつの頻度と重症度^11から14に増加、特にとして、彼らはおそらく種の分布を決定することができる。

我々は、切除した葉のK _葉 と g _sの同時定量のための簡単な方法を提示する。蒸散葉はバランスの上水源に走るチューブにその葉柄によって接続される。バランスからの水の損失は葉を通る流量を計算するために記録されます。定常状態の蒸散（E、ミリモル•メートル^{-2•S -1）}に達した場合は、 グラム Kの _リーフ （ _葉 、K = E / - Δψ _葉 、MPa）を^15。

このメソッドは、別の放射照度と脱水^14,16,17へのKの _葉の脆弱性にK _葉の応答を評価するために用いることができる。

Protocol

1。和葉のためにリーフの通水コンダクタンス（K _max）を測定する

1. 好ましくは、木部の緊張が低くなるように、夕方や夜間での撮影を収集し、湿ったペーパータオルでいっぱいダークビニール袋に空気や場所にカット。ラボでは、水の下にすべての撮影の終わりから少なくとも2つのノードを再び切る。 Kの _葉測定_のために使用される純水で一晩、または他の溶液を再水和撮影しましょう。異なるソリューションの影響が要因として検討されるべき場合を除き、超純水は、フローソリューションとして推奨されています。
2. 部分的に脱気したフロー·ソリューションの下で新鮮なかみそりの刃でシュートから葉を切り取ります。異なるソリューションの影響が要因として検討されるべき場合を除き、超純水は、フローソリューションとして推奨されています。我々は、真空ポンプを用いてフラスコ内で一晩ソリューションを脱気をお勧めしますが、他の方法を用いることができる。
3. petioラップアラウンド予備延伸パラフィルム葉柄とチューブの間の良好なシール性を確保するためにル。余分なパラフィルムをラップする葉柄がチューブ内に収まるようにラウンドを助けるため、この手順は、非円形の葉柄では特に便利です。デンタルペーストは、葉柄の溝を埋めるためにパラフィルムを包む前に、葉柄に適用することができます。
4. システムに入る空気を防ぐために、超純水の下にシリコンチューブに葉を接続します。葉は水の源の上に持ち上げられるように、配管内の水が大気圧より低い圧力の下にあり、全く空気が測定中にチューブ内に引き込まれていない場合はこのようにシールが良いです。 Omnifit、ケンブリッジ、英国）、このアプローチは、特に複雑な形状の葉柄に有用であるか、草のブレードの代わりにシリコンチューブに直接葉柄をシールに、ゴム製のガスケットで圧縮継手（ 例えば 、（Omnifit A2227ボアアダプター使用することができます、そのガラス棒に巻き付けと圧縮フィッティングでシールすることができる。SIに直接葉柄を密閉可能であるときに、liconeチューブは迅速であること、透明である葉柄とチューブの接合部を残して、気泡がより簡単に見ることができるという利点を持っています。チューブは、コンピュータ（;メトラー·トレド社、Greifensee、スイスなどは 、 "貸借対照リンク"ソフトウェアを使用して）30秒ごとにデータをログに記録しバランス（±10μgの分解能）、上のメスシリンダーに稼働ハードチューブに葉を結ぶ葉を通る流量の計算のため。
5. 葉は若干のレベルを超えて、大きな箱のファンの上および光源（高照度測定用> 1,000モル•メートル^{2•s -1}の光合成有効放射）の下に釣り糸が張ら木製フレームに向軸面を上向きに保持する必要がありますメスシリンダのメニスカス。葉は同じように葉に移動し、その水は、蒸散により駆動され、重力による圧力の下葉に入っていないことを確認するためにメスシリンダーに水の上に配置する必要があります葉は、シリンダ内の水のメニスカスの下に置かれた場合のケースである。ぬれたペーパータオルで満たされた小さな容器は、このようなバランスで大気中に水源からの蒸発を避け、バランスの空気が水飽和であることを確認するバランスチャンバ内に配置されます。この可能性は、チューブ内の4方活栓バルブを使用して、葉に流れを停止し、バランス上の水シリンダーの質量が低下しないことをチェックすることによって確認することができます。
6. ランプの熱を吸収し、葉の上に水で満たされた透明なパイレックスの容器を置きます。
7. ヒートランプは下葉の周りの空気を暖めるために十分にパイレックスの容器を加熱しないように、パイレックス（登録商標）容器にさらに冷たい水を加えることにより、実験を通して23℃と28℃の間に葉の温度を維持する。
8. 従って高い照度に順応するのに十分な時間を与え、additi、少なくとも30分間装置上の蒸散に葉を許可onallyまで流量がない上向きまたは下向き傾向で、安定し、変動係数<30秒フロー間隔で行われ、少なくとも5月10日の測定では5％としています。この方法は安定したΨの_葉を前提としていますので流量が定常状態に到達することが不可欠です。これまでの研究では、これらの基準は流量（E）は、Ψ _葉とK _葉の安定化のための十分であることが判明し、安定した流れが確立された後に長い測定期間を用いた試験は、ワイドの7種の各々の測定時間にK _葉のない関係を示さなかった葉容量^17,18の範囲。安定化は、一般的には30分以下がかかりますが、いくつかの種で、いくつかの種のために一時間以上を必要とするかもしれません。

注 ：流量が非常に低い場合（<8μgのs ^-1）で、安定性は最後の5 30秒間隔の実行中の平均値を用いて決定することができる。

流れ突然突然気孔閉鎖のために、どちらかの変更、または粒子や気泡によるシステムのシールや閉塞から明らかに漏れた場合の測定値を破棄します。

フローが安定すると、熱電対で葉温を記録します。

素早くチューブから葉を削除し、DABは葉柄を乾燥させ、蒸散を停止するために、以前に吐き出されていた密閉式の袋の中に葉を配置します。

葉は少なくとも20分間、その袋の中に平衡化しましょう​​。

最後の10の流量測定値を平均。これはあなたのEの測定になります。

葉が平衡化された場合、圧力室との最終的な葉の水ポテンシャル（Ψ _最終 ） _を測定_します 。

フラットベッドスキャナと画像処理ソフトウェアで、または葉面積計で葉面積を測定します。

K _葉は E /-ΔΨ _葉 （ここΔΨ _葉 =Ψ _最後のように計算されます。 -2 s -1で-1 MPaのです。葉がちょうどメスシリンダー内の水位よりも上方に位置しているため、葉に入る水の圧力を減少させるのに重力の影響が常に> -0.1 MPaであるΨ _最終的に相対特に、無視できるでしょう。

水の粘度^15,19,20度の温度依存性によって誘導され、K _葉の変化を補正するために、以下の式を用いて、25°CにKの _リーフ値を標準化：

18. 気孔コンダクタンス_（G S） _が蒸気pressuに相当、葉に空気蒸気圧の差で割った、Eのように決定することができる葉に隣接する温度および相対湿度センサーを用いて決定し、再赤字（VPD）。 VPDは、以下の式^21を使用^して計算される

（;アーデン降圧式^（22）によると、温度の関数kPaで）、およびAP気圧（kPaで）RHは相対湿度である場合、VPは空気の飽和蒸気圧である。

2。乾燥葉を葉の通水コンダクタンスの測定

1. 好ましくは、木部の緊張が低くなるように、夕方や夜間での撮影を収集し、湿ったペーパータオルでいっぱいダークビニール袋に空気や場所にカット。ラボでは、水の下にすべての撮影の終わりから少なくとも2つのノードを再び切る。 K _ルに使用する純水、または他の溶液に一晩水分補給撮影しましょうAF測定。異なるソリューションの影響が要因として検討されるべき場合を除き、超純水は、フローソリューションとして推奨されています。
2. Ψ _の葉の値の範囲に異なる期間のためにファンが付いている超純水と脱水の撮影時に、少なくとも3つの葉を持つセグメントにシュートを切り取ります。
3. シュートの各葉の周り以前に吐き出されています）、その後湿紙と大型密閉式の袋に全体のシュートを配置、いったん芽が脱水され、密封可能な袋（ナスコ、フォートアトキンソン、ウィスコンシン、米国ワール-PAK）を置くタオル。
4. 撮影は少なくとも30分（強く脱水撮影のため長い平衡時間が必要になる場合があります）平衡化しましょう​​。
5. 平衡化した後、消費税最上部と最下部の葉と圧力室を使用して測定初期Ψ _{葉（=ΨO）。}
6. これら二つの葉のΨ _葉の差が0.1MPa（STRONためのより大きければシュートを破棄糖脱水葉は、この範囲）が0.3MPaに拡張することができます。
7. 第3葉は、その後、上記の手順1.2 -1.18以下、EFMのK _葉 と g _sを決定するために使用されます。特に、定常状態Eは気孔がまだ開いてクチクラコンダクタンス¹⁷より実質的に高い_G Sの値を生成するように、厳しく脱水葉であった葉であっても取得することができる。
8. 油圧脆弱性曲線を構築するには、手順1.16に示すようにΨ _決勝を用い_て Kの _葉を計算し、最も低い方に対してプロットKの _リーフ値_、ΨOまたはΨ _最後の 、 すなわち 、実験の間に葉が経験した最強の脱水（=Ψ _最も低い ）。同様に、葉の脱水に応じて_G Sの減少が_最も低い Ψに対して_G S _をプロット_することにより決定することができます。前の仕事は、shを持って自身その脱水は、K _葉と_G S ^14,16内に少なくとも部分的に不可逆的低下を誘導する。
9. 我々は、 _最低 Ψ（あなたが作業している種は脱水には本当に脆弱である場合は、この間隔は0.25 MPaに減少させることができる）の0.5メガパスカルの応力が発生する間隔ごとに少なくとも6 Kの _リーフ値を取得することをお勧めします。
10. あなたの脆弱性曲線²³から外れ値を除去するための_最低 Ψの各0.5MPaの水ポテンシャル区間のK _リーフ値にディクソン外れ値テストを実行します。
11. 種は脱水^14,16にK _葉 と g _sの彼らの応答が異なるため、それぞれの種のためにさまざまな機能を合わせて、最大尤度（最低AIC値、詳細については^14を参照）を選択します。我々は以前に文献で使用されるフ​​ィッティング少なくとも4つの機能をお勧めします：線形（PG "のfo：コンテンツの幅=" 1.4in "のfo：SRC =" / files/ftp_upload/4179/4179eq3highres.jpg "/>）、シグモイド（ ）、ロジスティック（ など）および指数（ ）。

3。代表的な結果

脱水と葉の通水コンダクタンスの低下が種（ 図1）の向こう側に強く変化します。干ばつ感受性の高い種は、高照度下で測定した場合、それ以上の干ばつ耐性種よりも小さい負の水ポテンシャルにおける強い低下を経験（PAR> 1,000ミクロモル^•M•-2 s ^-1）で。水mesicハーブヒマワリための通水コンダクタンスの80％損失（P _80）の電位はカリフォルニアチャパラルにネイティブHeteromeles arbutifoliaのそれよりも小さい負3MPaであった。 ヒマワリが非を認めたのに対し、Heteromeles arbutifoliaは 、水ポテンシャルの低下に直線的に回答し線形減少。

気孔コンダクタンス_（G S）と葉の通水コンダクタンス（K _葉 ）はどちらも、（ 図2）放射照度劇的に応答することができます。 オキナワシャリンバイインディカは、気孔コンダクタンスは高照度下で測定した葉の脱水と強く減少（PAR> 1,000ミクロモル^•M•-2 s ^-1）で、ラボの光の下では（PAR <6モル^•M•-2 s ^-1）で。高照度の下で、明るい草原のために典型的である水ポテンシャルに脱水したEFMで測定葉昼時無傷の植物にVESはポロメーター（ 図の星。2）で無傷の植物の葉で測定の場合と同様の_G S _を示した。特に、最大の水和の葉のために、K _葉は低照度（11対2.8ミリモルm ^{-2 s -1で}メガパスカル^-1）よりも高いにさらさ葉を4倍高かったので、Kの _葉は井の中の強い光反応を示したグラム _sよりも水和葉。また、高照度下では、K _葉は脱水と強く拒否した。 P _80は、低照度下でより高い0.93メガパスカル未満で陰性であった。

干ばつ敏感については、 図1。リーフ油圧脆弱性曲線（上）と干ばつトレラント（下）種^（14,24から）。各ポイントは、罪を表す蒸発フラックス法（EFM）を使用して、切断葉で葉の通水コンダクタンスの測定GLE（K _葉 ）。縦棒は、種が初期葉の通水コンダクタンス（P _80）の80％を失った時に水ポテンシャルを表しています。最尤法を使用してベストフィット機能は、両方の種のためにプロットされます。

図2： オキナワシャリンバイインディカに関して減少した葉の水ポテンシャルと気孔コンダクタンス_（G S）の葉と水コンダクタンス（K _葉 ）の応答は、高対低照度^（16から）下で測定。 （PAR> 1,000 <6ミリモル•メートル^{-2•S-1）。}各点はそれぞれ、ハイとローの照度下で測定した葉を表す白と黒のドットで、蒸発フラックス法（EFM）を使用して、切断葉上の単一の測定値を表す。高対低照度の気孔コンダクタンス曲線の式： と 。高対低照度の脆弱性曲線の式： と 。上部パネルにある灰色の星は平均値±STAを表し_G Sとポロメーターと昼で無傷の植物の葉の上で測定し、葉の水ポテンシャルのndardエラー。下部のパネルのグレーと黒の縦棒は、種がそれぞれ高、低照度下での初期葉の通水コンダクタンス（P _80）の80％を失った時に水ポテンシャルを表しています。

Discussion

ここに提示され、蒸発フラックス法では、気孔コンダクタンスの同時測定と実験室における葉の通水コンダクタンスの比較的迅速（30分）を決定することができる。

EFMは、これまでに最も密接に気孔¹⁵から葉の空域と拡散して水が蒸発することを考えると、葉に水の自然の経路を以下の方法である。 Kの _葉の決定のための他の実験方法の数は3つが特 ​​に一般的であることと^、25が存在^する 。 （1）高圧·フロー法（以下HPFM）において、水は高圧^15,26下葉を通って押し出される。しかし、脆弱性曲線が適用された正の圧力がリフィル塞栓を可能性があるため、このメソッドで取得し、葉肉組織を再水和することはできません。 （2）補水動態法（RKM）において、K _葉は chで脱水葉の水分補給の間のアナロジーを用いて算出される抵抗^27,28と直列に接続されたコンデンサのarging。この方法は迅速であるが、葉の自然蒸散経路のシステム全体を再現しないと、簡単に高照度に順応葉の測定を可能にするために変更されません。異なる強度の掃除機は、葉から葉^15,26の駆動水の損失に適用されている間（3）真空ポンプ方式（VPM）に葉をチャンバー内に配置され、その葉柄には、バランスの上水源に接続されています。この方法は時間がかかることがあります。すべての3つの方法を使用して測定値が一貫した結果を^15,28,29を与えることが判明している、したがって、EFMは頻繁にその蒸散水の動き、その相対的な速さに基づいていると、さまざまな条件下でのK _葉を測定_するために、その修正与え使用されています。

Kの _葉が ACC定量における不確かさのレベルを含んで決定するために使用される代表的な方法の全て蒸散²⁵に対応urately原動力。それはバルクΨ _葉に基づいているため、葉が圧力爆弾平衡化した後、EFMでは、Kの _葉を計算するために使用ΔΨの_葉は 、真の駆動力よりも低くなっています。水があるときは、この時点で、バルクΨ _葉は必ずしも油圧経路、水が蒸発するのではなく、低い水ポテンシャルの比較的少数の細胞のための出来高加重平均の終わりに細胞の水ポテンシャルを表すものではありません移動および蒸発させ、蒸散流から単離することができる高い水ポテンシャルのより多くの細胞のために。どのくらいのΨの_葉は、水が葉に蒸発されている場所によって異なりますので、真の原動力とは異なります。葉全体に水が蒸発すると、一括Ψ _葉に近い真の駆動力になる、とだけ比較的少ないcから水が蒸発している場合あり気孔近くellsは、バルクΨ _葉は、実質的_に真の原動力、 すなわち 、実際には非常に低くなる可能性があり、それらの細胞の水ポテンシャルを過小評価することができ、したがって、実際のKの _葉は、EFMと決定されたものよりも低くなるだろう。したがって、EFMにより決定Kの _葉が真のK _葉を表し_ている度合いはまだ十分に解明されていない水の流れ経路に敏感である。 EFM（上記を参照）、K _葉を測定_するための他の方法のものと一致するデータを提供しており、比較の使用に優れていながら、肉を通る水流経路における種の変化の可能性はさらに調査が必要である。確かに³¹も、与えられた種の葉のために、これらの水の経路が異なる放射照度と熱負荷^4,30の下や異なる水分状態の、 例えば 、異なる条件下で異なる場合があります（組織の収縮を与えられた）。さらに知識水輸送経路のこうして、EFMが全体の葉水力輸送上の変化経路の効果を解決するために使用されるのを許容するでしょう。

EFMにおける気孔コンダクタンスの測定は、照度と脱水に対する応答の決定を可能にし、Kの _葉と_G Sの一致応答を提供するという利点があります。さらに_、G Sに水分補給が続く直前のリーフ·脱水の効果は、このメソッドを使用して評価することができる。しかし、この方法には、2つの潜在的な欠点を持っています。まず、 この g _の測定はポロチャンバ内として切り出し葉の上ではなく、無傷の植物で作られ、そして第二に、気孔コンダクタンスの測定は、気候変動の測定に基づいている葉からいくつかの距離をではなく、葉に近い、ファンが付いている葉の換気は、空気を周囲の葉の表面を平衡が。いくつかの種では、摘出葉は無傷植物^16,32の葉のための異なる気孔の応答が表示される場合があります。しかし、いくつかの種のために_G S _は、EFMを使用すると、昼Ψ _葉 ^16（ 図2）の葉のためにポロと無傷の植物で測定された値と同様であったと推定した。

EFMは、K _葉 、構造や解剖学での基礎、および環境因子への応答の動態を調査し、生理的な洞察力、 すなわち適用することができる。さらに、この方法は、異なる条件下で増殖させ、所与の種の植物を比較したり、異なった年齢の、または異なる環境に適応した異なる種の植物を比較するために使用することができます。

葉の脆弱性曲線を構築することによって、人は干ばつに種公差のメカニズムへの洞察を得ることができます。渇水時には、キャビテーションと細胞崩壊は一部の葉の木部に発生することが示されている種、および脱水時における葉肉細胞収縮も^（14日に）水の動きに影響を与える可能性があります。今後の研究では、K _葉および気孔閉鎖の衰退を推進する上で、これらの各プロセスの相対的な重要性を決定するのに必要でしょう。

照度もK _葉に影響_を与える強力な要因であるとEFMは非常に高照度下での測定に適しています。放射照度と干ばつへのアクアポリンの組み合わせ応答は多くの関心を得る必要があります。高照度は、K _葉を減らす、減少の発現および/ ​​またはアクアポリンのデactivatationに脱水リードのに対し、Kの _葉を増やし、発現の増加および/ ​​または生細胞を介して高速に水の流れを可能にするアクアポリンの活性化につながる。 Kの _葉の上の放射照度と水の供給を合わせた影響はさらに調査^{4,10,16,33を}必要と^します 。

テントは">乾燥した地域からK _葉 、種を越えて、更に、その脆弱性が軽水炉や他のリソース^3,13,24の供給に関して、種の分布に関係している。種が直面している、油圧低下に大きな抵抗を示す傾向にあるもっと否定的土壌の水ポテンシャル、さらに負の水ポテンシャルで高K _葉を維持_することによって、彼らは高い_G S _を維持し、光合成^13,14をCO _2のキャプチャ_が続行できるので、葉水理特性の研究は、のレベルでの洞察を提供していますセル、葉、植物全体と環境への応答、およびすべてのスケールで数多くの重要な新しい発見をもたらす可能性があります。