Met behulp van de BLT Gehumaniseerd Muis als een Stem Cell gebaseerde Gene Therapy tumormodel

Summary

Het genereren en karakteriseren van tumorspecifieke T-cellen met gehumaniseerde muizen wordt hier beschreven. Human thymusweefsel en genetisch gemodificeerde humane hematopoietische stamcellen worden getransplanteerd in immunodeficiënte muizen. Dit resulteert in de bereiding van een op menselijke immuunsysteem waardoor in vivo onderzoek van anti-tumor immuunrespons.

Abstract

Kleine diermodellen zoals muizen zijn uitgebreid gebruikt om menselijke ziekte te bestuderen en nieuwe therapeutische interventies. Ondanks de vele informatie uit deze studies de unieke kenmerken van muis immuniteit en de soortspecificiteit van virale ziekten zoals humaan immunodeficiëntie virus (HIV) infectie leidde tot de ontwikkeling van gehumaniseerd muismodellen. De oudere modellen werd gebruik gemaakt van C. B 17 scid / scid muizen en transplantatie van humane foetale thymus en foetale lever genoemd thy / liv (SCID-hu) ^{1, 2} of de adoptieve overdracht van humaan perifeer bloed leukocyten (SCID-huPBL ) ^3. Beide modellen werden voornamelijk gebruikt voor de studie van HIV infectie.

Een van de belangrijkste beperkingen van beide modellen was het gebrek aan stabiele reconstitutie van humane immuuncellen in de periferie om ze een fysiologisch relevant model voor HIV ziekte te bestuderen. Hiertoe de BLT humanized muismodel ontwikkeld. BLT staat voor beenmerg / lever / thymus. In dit model, 6 tot 8 weken oude NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunodeficiënte muizen krijgen de thy / liv implantaat in het SCID-hu muismodel alleen worden gevolgd door een tweede humane hematopoietische stamcel transplantatie ^4. Het voordeel van dit systeem is volledig herstel van het menselijke immuunsysteem in de periferie. Dit model is gebruikt om HIV-infectie en latency ^5-8 bestuderen.

We hebben geleid tot een gewijzigde versie van dit model waarin we genetisch gemodificeerde gebruiken humane hematopoietische stamcellen (hHSC) aan de thy / liv implantaat gevolgd door injectie van getransduceerde autologe hHSC ^{7, 9} construeren. Deze benadering resulteert in het genereren van genetisch gemodificeerde lijnen. Belangrijker we aangepast dit systeem de mogelijkheid van het genereren functionele cytotoxische T cellen (CTL) expressie brengen van een melanoom specifieke T-cel receptor onderzocht. Met dit model konden we de functionaliteit van onze transgene CTL gebruik levende positron emissie tomografie (PET) beeldvorming tot tumorregressie (9) vast te beoordelen.

Het doel van dit protocol is het beschrijven van het proces van het genereren van deze transgene muizen en beoordelen van in vivo resultaten met behulp van live PET-beeldvorming. Als een notitie, omdat we gebruik maken van menselijke weefsels en lentivirale vectoren, onze faciliteiten voldoen aan CDC NIH richtlijnen voor Bioveiligheid Niveau 2 (BSL2) met speciale voorzorgsmaatregelen (BSL2 +). Bovendien de NSG muizen ernstig zijn dus immuungecompromitteerde moeten hun behuizing en onderhoud aan de hoogste gezondheidsnormen ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Generatie van muizen BLT

De BLT generatie muizen verdeeld in drie (3) delen: (1) verwerking van foetaal weefsel en de bereiding van CD34 humane hematopoietische stamcellen, (2) transplantatie van menselijk weefsel, en (3) secundaire transplantatie. Voor alle protocollen, hebben we Tabel 1 met reagens informatie.

1. Weefsel bewerken en isolatie van CD34 humane hematopoietische stamcellen

Verse foetaal weefsel of weefsel 's nachts verzonden op ijs van diverse orgaanverkrijging agentschappen kan worden gebruikt. Vaak foetaal weefsel niet steriel, zoals blijkt uit de productie van 1000 bacteriële kolonies op agar per milliliter omringende medium. We routinematig tweemaal wassen het weefsel in 40 ml steriel PBS. Hoewel dit niet verwijdert alle bacteriën, kan het een verschil maken tussen een succesvolle transplantatie serie en een uitkomst waarin de meeste van de ontvangende muizen bezwijken voor bacteriële inperfectie. Als extra stap verder desinfecteren weefsel cultuur we de celsuspensie in de aanwezigheid van antibiotica.

1.1 Verwerking van foetaal thymusweefsel

1. Was thymus door het afgieten van het medium in een bekerglas van bleekwater en het gebruik van scalpel om het weefsel te voorkomen glijden naar het bleekmiddel. Vul de buis met PBS. Cap en zwenken naar de thymus te wassen. Giet supernatant in bleekmiddel. Herhalen.
2. Plaats de thymus weefsel in 8 ml RPMI + 10% foetaal kalfsserum in een 60 mm schotel en afschuiving in 1,5 tot 2 mm stukken met twee scalpels. Shearing met scalpels minimaliseert scheuren en beschadiging van het weefsel bits. Beschadigd weefsel de neiging om gezwollen, kleverige en moeilijk te trekken in het implantaat naald. Het aantal bits verkregen eerste bovengrens voor transplanteerbare muizen.
3. Breng de opgehangen bits met een 25 ml pipet (om weefselbeschadiging te minimaliseren) in een T25 kolf. Voeg 70 ul van piptazo (Zosyn) naar kolf en cultuur 's nachts, 5% CO2. Dit vermindert besmettende bacteriën. Wilt u weefseltypering of andere fenotypering testen te doen, neem 1 ml van cellen.

1,2 Verwerking van foetaal leverweefsel

1. Was de lever als in stap 1.1.1.
2. Voeg 10 ml medium en decanteer alles Iscove's in een 100 mm petrischaal.
3. Met twee scalpels, snijd de lever in kleine (~ 3 mm) stukken. Als je in de witte bindweefsel, schraap de lever van het en gooi deze weg in het bleekmiddel.
4. Homogeniseer het weefsel door zuigen in een 12 ml spuit uitgerust met een 16 gauge stompe naald 3 of 4 keer en overbrengen naar een 50 ml buis.
5. Bereid de enzymen voor weefsel spijsvertering als volgt: 10 ml van Iscove's in een 50 ml buis, 200 ui van elk: collagenase type IV (1 mg / ml), hyaluronidase (1 mg / ml), DNase I (2 U / ml).
6. Teken enzymen in een 12 ml spuit en monteer deze met een 0,22 μ filter. Filter de enzyme / medium direct in de celsuspensie.
7. Cap en dicht de cellen met Parafilm. Draaien bij 37 ° C gedurende 90 minuten.
8. Het opzetten van een 50 ml buis met een 100 μ cel zeef. Pipet de cel verteren door deze zeef.
9. Voeg PBS om de cellen het volume met tot 50 ml. Opsplitsen in twee buizen van 25 ml.
10. Onderlaag van de cellen met 10 ml Ficoll. Spin bij 2.400 tpm gedurende 20 minuten zonder rem.
11. De interface moet dik. Suck it out met een 5 ml pipet en overplaatsing naar een andere buis. Je moet over twee buizen van de interface. Voeg 50 ml PBS aan elk en centrifugeren op 1200 rpm gedurende 10 minuten.
12. Combineer pellets in een buis en was drie keer met PBS met 2% FCS.
13. Tenslotte schorten in 50 ml RPMI + 10% FCS en count cellen met trypan blue. Afhankelijk van de grootte van het weefsel, kunt u van ¹⁰ augustus-10 september in totaal hepatocyten.
14. Breng de cellen een T150 kolf en voeg 30 ml RPMI + 10% FCS en 0,8 ml piptazo.
15. Incubeer gedurende 1 tot 1,5 uur bij 37 ° C om hechtende cellen te verwijderen.

1,3 Sorteren en Transductie van CD34 hematopoietische stamcellen

1. Na bevestiging van de cellen in stap 1.2.15, schud de kolf heen en weer zachtjes een minuut om losse cellen te verwijderen. Er veel van fibroblasten en deze vast aan het oppervlak.
2. Tellen opnieuw met een 1 tot 20 verdunning en noteer het totale aantal cellen. Sla een paar tienden van een ml voor later vlekken. Je moet ongeveer 30% minder cellen van uw eerste cellen (stap 1.2.13).
3. Spin down en was twee keer met 40 ml MACS buffer.
4. CD34 cellen gesorteerd met Miltenyi Biotech CD34 Direct Kit. We volgen exact protocol van de fabrikant met behulp van LS kolommen die door hetzelfde bedrijf.
5. Teruggewonnen cellen zullen in 5 ml. Tel en bereken het totale aantal cellen. Uw opbrengst van CD34 + cellen moeten 3-5% van uw totale celtellingen zijn. Dit varieert met the leeftijd van de foetale lever. Jongere foetale levers hebben de neiging om een ​​hogere opbrengst van CD34 + cellen te geven.
6. Verdeel het aantal cellen 1x10 ^6. Dit geeft de tweede bovengrens voor transplanteerbare muizen.
7. Tel de CD34-fractie (doorstroom en wasbeurten) en reserve 6 x 10 ⁶ per muis te transplanteren. Deze cellen overnacht cultuur in 50 tot 80 ml RPMI + 10% foetaal kalfsserum + 1% piptazo.
8. Transduceren de CD34 + cellen 's nachts met uw lentivirale vector. We gebruiken retronectin door Takara exact volgens de fabrikant.
9. De volgende dag oogst de CD34-cellen, CD34 + de getransfecteerde cellen en telling.
10. Splits de CD34 + cellen in de helft: deel A en deel B.
11. Spin down Part A CD34 + getransduceerde cellen en suspendeer in 4 tot 6 ml ijskoud medium (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ steriel gefiltreerd). Neem 1 ml fracties in invriezen flesjes en label met "huFetalCD34", het aantal cellen in de flacon, de datum en uw initialen.
12. Voor elke muis mengen 0.5x10 ⁶ Deel B CD34 + getransduceerde cellen en 4.5x10 ⁶ CD34-cellen in een steriele schroefdop microfugebuisje, pellet en blijf op ijs. Ook ontdooien een buis Matrigel (BD Biosciences) op ijs. Al deze buizen moeten worden gehouden op ijs tot gebruik (ga naar stap 2.10).

2. Tissue Transplantation

Het doel van deze stap is om een ​​humane foetale thymus / lever organoid transplantatie onder de NSG muis nier capsule. Dit bootst organoid beter het proces van menselijke T celselectie en rijping processen als menselijke hematopoietische stamcellen de menselijke thymus en niet de muis als de plaats voor hun differentiatie tot verschillende T cel en andere lymfoïde lijnen. Het gebruik van CD34-cellen in de transplantatie proces opnieuw genereren foetale lever stroma en waardoor betere transplantatie en groei van het implantaat. De leeftijd van de gebruikte NSG muizen is 6-8 weken oud.

1. Voorbereiding van geneesmiddelen voor surgery:
   1. Isofluraan: Rol een 2 inch gaasje en plak deze in een 15 ml schroefdop centrifugebuis spullen. Giet in ongeveer 1 ml van isofluraan rechtstreeks uit de fles.
   2. Ketamine / zylazine: Voeg 0,52 ml ketamine (Ketaset) (100 mg / ml) en 0,52 ml xylazine (Anased) (100 mg / ml) in een 20 ml flesje zoutoplossing voor injectie. Etiket met de vervaldatum van de eerste aflopende component en bewaar bij -20 ° C tot gebruik.
   3. Carprofen (Rimadyl). Verdun deze vlak voor een chirurgische procedure. Verdun 1:100 door intrekking 0,1 of 0,2 ml uit de flacon met een 1 ml spuit en een 25G naald. Injecteer in een 10 of 20 ml zoutoplossing voor injectie. Label en datum. Bewaren in de koelkast voor een dag. Belasting in 3 ml spuiten met 25G naalden.
2. Stel de tabel voor operaties. Bedek het met een steriele blauwe pads, en een steriele handdoek voor elke chirurg. Elke chirurg krijgt van hun doos van gesteriliseerde instrumenten: 4 "schaar, gebogen stompe tang, moetenle-neus tang, hemostat, 16G stomp trochar, en wond clip applicator. Bovendien moeten zij een gekromde naald Vicryl hechtdraad, een stapel afvegen isopropanol pakketten, een 35 mm petrischaal van PBS, en een 1 ml injectiespuit gevuld met PBS.
3. Ligt in het midden van de tafel een glazen Coplin pot met 2 cm van Betadine en 2 wattenstaafjes. Giet de thymus bits in een 60 mm petrischaal.
4. De anesthesie wordt uitgevoerd op een aparte tabel of in een kap afgedekt met steriele blauwe pads. Stel twee kleine rekken en een elektronische weegschaal met een beker om de muizen te houden. Gebruik een rack tot 0,5 ml X 28G insulinespuiten geladen met ketamine / xylazine en het andere aan het 3 ml spuiten van carprofen houden houden. Ook zet de biologisch gevaarlijk afval container in de buurt van de geschoren vacht te houden.
5. Weeg alle muizen (6-8 weken oud) in een kooi het gemiddelde gewicht en belasting te spuiten met een dosis van 15 ul / g ketamine / xylazine. Injecteer alle muizen in de kooi.
6. Na de muizen er langzamer scheren hun left kant van heup tot de schouder tussen het midden van de rug en de buik met een Oster tondeuse met nr. 40 blad. Noteer hun gewicht, en punch hun oren voor de nummering.
7. Subcutaan injecteren 0,3 ml carprofen over de schouder.
8. Controleer de narcose niveau van de muis door te knijpen een poot. Als de muis flinches, beheren isofluraan uit een tube voor ongeveer 12 sec. Probeer dan opnieuw de poot squeeze. Blijven geven korte shots van isofluraan totdat de poot reflex verdwijnt. Leg de muis op de goede kant naar links.
9. Een 16-gauge naald kanker implantaat en het uiteinde ingediend ronde gebruikt om het weefsel te voegen. Spoel de trochar een paar keer in de schotel van PBS. Vast te houden horizontaal met de stang net binnen de top. Voeg een stukje van de thymus met de neuspunt tang en zuigen het erin
10. Een helper voegt 5 ul van koude Matrigel om een buis van cellen (stap 1.3.12) met een Eppendorf verdringerpompen pipet, en mengt door voorzichtig roeren. De chirurg holds de trochar horizontaal en trekt de staaf langzaam terug als de helper pipets de Matrigel mengsel in de trochar. Het mengsel geleert bij kamertemperatuur.
11. SWAB de blote huid met Betadine. Veeg deze af met een isopropanol doekje. Herhalen.
12. Zoek de milt onder de huid. Het is de donkerste plek. De muis nier ligt ongeveer 5 mm dorsaal van de milt, die kan worden gezien door de geschoren huid.
13. Pak de huid over deze plek met de stompe pincet en maak een snede evenwijdig met de milt ongeveer 15 mm lang. Maak een soortgelijke verlaging van het buikvlies spierlaag hieronder. Bij mannen moet de nier direct zichtbaar en hoeft u alleen maar de buik knijpen om het pop out. Bij vrouwen, kan het nodig zijn op te halen de eierstok met de hemostat en sleep de nieren. Dit kan helpen behouden de nieren uit het lichaam. Voor mannen, moet u enige druk te houden op de buik met uw linkerhand te houden van de nier blootgesteld.
14. Pluk een klein gaatje in de posterior einde van de nier capsule. Het kan een beetje bloeden.
15. Schuif de trochar in dit gat en langs de nier tot de opening van de trochar volledig onder de nier capsule. Vervolgens met behulp van de pink van je rechterhand, injecteren het weefsel.
16. Duw de nieren weer voorzichtig met de gesloten hemostaat. Zet een steek in het buikvlies gebonden met een dubbele kennis. Knijp de huid op als een portemonnee en zette in twee wond clips.
17. Doe een druppel PBS op elk oog en leg de muis op zijn kant op de kooi beddengoed. Zorg ervoor dat alle muizen zijn teruggekeerd naar liggend op hun buik voor het verlaten van hen.
18. De volgende dag, geef elke muis een ander schot van carprofen.

3. Secundaire Transplantatie

Het doel van deze stap in de vorming van BLT muizen te bevolken moue beenmerg met humane hematopoietische stamcellen. De getransplanteerde implantaat procedure (2) is onvoldoende om een ​​volledige reconstructie van th ondersteunene menselijke immuunsysteem in deze muizen. Tijdens de tweede transplantatie, we sub-lethaal bestralen de muizen murine beenmergcellen afbreken waardoor het genereren van "ruimte" voor de implantatie van de humane CD34 + cellen.

1. Vier tot zes weken later bestralen de muizen met 2,7 Gy. De muizen worden geïnjecteerd op dezelfde dag, deel A, CD34 + getransduceerde cellen. Het tijdschema is gebaseerd op de oprichting en groei van de thy / liv implantaat getransplanteerd in stap 2. Typisch, in deze tijd van het implantaat is sterk gegroeid waardoor we door te gaan naar de volgende stappen.
2. Ontdooi de deel A CD34 + getransduceerde cellen, wassen en schorten in medium tot een concentratie van 5x10 ⁶ / ml.
3. Plaats 0,5 ml X 28G insulinespuiten met 0,1 ml van cellen (10 ⁵ tot 5x10 ⁵ cellen per 0,1 ml per muis) voor een kooi van muizen (elke kooi bevat maximaal 5 muizen) en leg ze op een rooster afgekeerde.
4. Verdoof een muis met een isofluraan buis door scruffing het en houdt haarneus in de buizen gedurende 20 sec. Tel tot het bijhouden van de tijd.
5. Dan eerlijk zijn om de juiste, en trek de huid rond haar nek vast met de duim en wijsvinger van de linkerhand. Druk onder zijn kaak met je derde finder zodat zijn rechter oog puilt uit. Houd de spuit parallel aan de lange as van het hoofd van de muis, zet de naald achter het oog en schuif het zo ver mogelijk. Druk op geen enkele andere, maar injecteer de belasting over ongeveer 2 sec.
6. Twee tot drie maanden later muizen retroorbitally bloedde met behulp van EDTA gecoat glas pipetten. U kunt alleen een maximum van 200 ul bloed per maand per muis. 50-100 pi bloed voldoende zijn voor FACS analyse. Alternatieve bloeden strategieën omvatten het gezicht ader bloedt en staartader bloedt. Deze zal u zeer kleine hoeveelheden bloed die niet voldoende voor meerdere assays.
7. Bloedmonsters gekleurd voor de expressie van de menselijke lymfocyten marker CD45 reconstitutie beoordelen. Blood monsters toegevoegd tot 1 ml rode bloedcellen lysis buffer (160 mM _NH4CI, 100 mM _KHCO3, 0,01 mM EDTA) en gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
8. Spoel de cellen in lysisbuffer, 5 min bij 1200 rpm, en herhaal indien nodig.
9. Centrifugeer cellen in 3,8 en wassen in PBS aangevuld met 3% foetaal kalf serum (FACS-PBS).
10. Verwijder supernatant en resuspendeer in 100 ul pellets FACS-PBS.
11. Toevoegen antilichamen tegen menselijke lymfocyt reconstitutie beoordelen. We meestal het volgende CD45 (menselijke lymfocyt marker), CD8, CD4, CD14 en CD16 voor macrofagen en monocyten, B-cellen CD19 en CD56 voor NK cellen.
12. Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
13. Was zoals in stap 3.9 en resuspendeer cellen in 2% paraformaldehyde voor FACS analyse.
14. Als muizen worden gereconstitueerd, gaan we met tumor injecties. Reconstitutie niveaus van menselijke lymfocyten variëren van minder dan 1% tot 40% van bloedcellen. De niveaus en types van lymphocyte geslachten zijn vergelijkbaar met wat men zou verwachten van gezonde bloeddonoren. Echter wel verwachten fluctuaties in het aantal niet-T cellijnen. Als de nummers niet aanvaardbaar zijn binnen de 12-weekse periode kon je herhaalt u de secundaire transplantatie procedure vanaf stap 3.1.
15. Tumorcellijnen worden gekweekt volgens fabrikant of laboratorium aanbevelingen. Cellen geoogst, gewassen en geresuspendeerd in matrigel bij een 1:1 verhouding (50 ul ul cells/50 matrigel). Monsters op ijs gehouden te allen tijde.
16. Muizen verdoofd en geschoren ter plaatse van injectie. Het gebied wordt gesteriliseerd met een isopropanol pad. Een helper belastingen celsuspensies in pre gekoeld 23G 1 ml spuiten. Tumorcellen subcutaan geïnjecteerd. Behandel de injectieplaats met antibiotische zalf. Tumoren moeten opstellen en beginnen groeien in 4 weken.

B. In vivo Positron Emissie Tomografie (PET)

Voor onze studie hebben we examenine glucose-opname ^{([18F]-fluorodeoxyglucose ([18F]} FDG) dus muizen gevast vier tot zes uur voorafgaand aan de beeldvorming. microPET / CT-scans worden gedaan met behulp van de microPET Inveon scanner (Siemens uit het preklinisch Solutions) en MicroCATII CT-scanner ( Siemens PreclinicalSolutions). Beeldanalyse gebeurt met OsiriX (Pixmeo, Zwitserland) software. Het doel is om de metabole activiteit van de tumor meten en uiteindelijk PET imaging als alternatief fysiek meten tumorregressie. Zoals gezien in Figuur 2, we hebben ondervonden tumoren die op basis van uiterlijk en grootte niet gericht maar levende PET geopenbaard uitgebreide weefselnecrose. Deze methode kan dienen als een gevoelige en nauwkeurige indicator van tumorregressie.

1. Wijst een kamer voor verlamming (2% isofluorane) de muizen, en een kamer als de 60 min opname van FDG voor PET-scanning ("wachten kamer"). Plaats blauwe kussentjes in beide kamers.
2. Aangezien de dieren Anesthetized over een lange periode, moeten zij warm gehouden op 30 ° C door middel van water gevulde handschoenen die verwarmd in een magnetron en plaatsen van de kooien op warmte pads.
3. Draai de isofluraan-stroom voor deze kamer op. Laat de isofluraan om de verlamming kamer voor ongeveer 5-10 minuten te vullen alvorens enig muizen in de kamer. Zorg ervoor dat het deksel is vergrendeld en goed gesloten houden om te voorkomen lekken isofluraan.
4. Plaats de eerste muis in de verlamming kamer en goed te vergrendelen het deksel. Laat 5-10 minuten of totdat de muis is bewusteloos.
5. Verwijder de muis uit de verlamming kamer, het etiket de staart van de muis (andere kleur per kooi) en intraperitoneaal de muis met injecteren ^[18 F] FDG (80 pCi). Let op de tijd dat de muis werd geïnjecteerd. De muis zal weer onder narcose 50 minuten van dit tijdpunt, waardoor gedurende 10 minuten in te stellen voor de PET-scanning (voor het totaal van 60 minuten ^[18 F] FDG-opname voor PET-scanning).
6. Plaats de muis geïnjecteerd in de wachtende kamer, waardoor ^[18 F] FDG opname gedurende 1 uur voor PET scanning. Niet op slot het deksel. Laat het deksel los om de luchtstroom mogelijk te maken.
7. Onmiddellijk plaatst u de volgende muis voor FDG injectie in de verlamming kamer. Latere muizen injecties moeten 10 min elkaar verdeeld, omdat het proces van PET scanning van 10 minuten. Onmiddellijk na een muis is gescand, zal de 60 min FDG-opname voor de volgende muis te scannen klaar precies 10 minuten uit elkaar.
8. Verder verlamming en injecteren muizen zoals in stappen 7-9.
9. Na 50 min van de eerste muis injectie tijdpunt, de eerste geïnjecteerde muis opnieuw plaatsen in de verlamming kamer (terwijl nog steeds blijven verdoven en muizen te injecteren).
10. Sluit de muis bed om de zuurstof en isofluraan lijnen, en zet de isofluraan doorstroming op voor het bed. Plaats een blauwe pad op het bed.
11. Plaats de muis klaar voor PET-scanning op het bed, het strekken van de armen enbenen en het houden van deze positie met tape. Plaats smeermiddel over de ogen. Deze stap is de meest cruciale omdat de positionering van het dier kan de kwaliteit van de beeldvorming.
12. Koppel de isofluraan en zuurstof lijnen, en snel het bed te monteren op de PET-scanning machine. Plaats de isofluraan en zuurstof lijnen. Zorg ervoor dat de isofluraan stroom is voor de PET-scanning machine. Sluit de PET-scanning-kabel en start u de scan.
13. Zodra de PET-scan is voltooid ga dan het dier naar de CT-scanner. Deze scan Naar aanleiding van het dier te verplaatsen naar de respectievelijke kooi.

Representative Results

Een stroomschema van transplantatie is weergegeven in figuur 1A. Een beeld van de thy / liv implantaat wordt getoond in figuur 1B. De thymusweefsel normaal ontwikkelt en een fysiologische distribueren van CD4 en CD8 T-cellen. Na reconstitutie de dieren dragen een menselijke immuunsysteem met normale distributie van CD4, CD8 T cellen en andere immuun cellijnen.

De discrepantie tussen tumorgrootte en levend weefsel wordt getoond in figuur 2. Terwijl de CT scan (grijze zone) gaf een groot tumorgroei in vivo PET imaging bleek dat het vooral necrotische en littekenweefsel (figuur 2). Dit onderstreept de bruikbaarheid van PET imaging als meer gevoelige en nauwkeurige manier om tumorregressie en klaring beoordelen.

Figuur 1. (A) Een schematisch diagram van het gewijzigde BLT model gebruikt in deze studies voor het genereren van chimere muizen die MART-1 specifieke T cellen. De Thy / Liv implantaat werd gereconstrueerd getransduceerde en niet-getransduceerde CD34 cellen geïsoleerd uit een autologe foetale lever. Een fractie van de getransduceerde cellen bevroren en geïnjecteerd in de bestraalde muizen 4-6 weken later. (B) Een representatief beeld van de thy / liv implantaat in gehumaniseerd muizen. De implantaten hebben een fysiologische weefseldistributie en CD4/CD8 ratio zoals blijkt uit de IHC en flowcytometrie figuren. Klik hier om groter bedrag bekijken .

Figuur 2. Een PET en CT-beeld van een muis die een melanoom tumor. Degrijze gebied geeft de fysieke grootte van de tumor en de rode kleur geeft de tumor metabolische activiteit, die zeer beperkt.

Discussion

De gewijzigde BLT gehumaniseerd muismodel combinatie met in vivo PET beeldvorming zijn krachtige hulpmiddelen om chronische ziekten bij de mens te bestuderen. Dit systeem neemt de BLT muismodel en verbeteringen die zij buiten de beperkte ruimte voor HIV-onderzoek. Bovendien is een groot systeem waarin we onderzoeken verschillende gentherapie en diagnostische technieken voordat ze de klinische instelling bereikt. Deze laatste combinatie met de lage kosten van het gebruik muizen versus primaten maakt dit een zeer bruikbaar model.

De PET-imaging technologie liet ons toe om de effectiviteit van onze aanpak te beoordelen. Als we zich uitsluitend op fysische metingen van de tumor, zouden we hebben onderschat de kracht van de antitumorale respons gegenereerd door onze transgene T-cellen. De uitgebreide littekens en necrotisch weefsel gaf de verschijning van een grote tumor, die in werkelijkheid was dood weefsel.

Tot slot, het nut van de gewijzigde BLT muis model kan worden uitgebreid tot andere ziektemodellen. Terwijl sommige nadelen nog steeds bestaan, zoals de kortere levensduur van muizen, kan dit een zeer krachtig instrument om in vivo te beoordelen vele aspecten van de menselijke immuniteit, testen en ontwikkelen nieuwe therapeutische interventies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx