Mit der BLT humanisierte Maus als Stem Cell based Gene Therapy Tumormodell

Summary

Die Generierung und Charakterisierung von Tumor-spezifischen T-Zellen mit humanisierten Mäusen wird hier beschrieben. Menschliche Thymus-Gewebe und gentechnisch veränderten humanen hämatopoetischen Stammzellen in immungeschwächten Mäusen transplantiert. Hierdurch ergibt sich der Rekonstitution eines konstruierten menschliche Immunsystem so zur in vivo-Untersuchung von Anti-Tumor-Immunantwort.

Abstract

Kleine Tiermodelle wie Mäuse wurden ausgiebig genutzt, um menschliche Krankheiten zu untersuchen und neue therapeutische Interventionen zu entwickeln. Trotz der Fülle an Informationen aus diesen Studien führten die einzigartigen Eigenschaften von Maus-Immunität sowie der Spezies-Spezifität von Viruserkrankungen wie humanes Immundefizienz-Virus (HIV) für die Entwicklung von humanisierten Maus-Modellen. Die früheren Modelle betrifft die Verwendung von C. B 17 scid / SCID-Mäuse und die Transplantation von humanen fötalen Thymus und fötale Leber bezeichnet thy / liv (SCID-hu) ^{1, 2} oder adoptiven Transfer von menschlichem peripheren Blut Leukozyten (SCID-huPBL ) ^3. Beide Modelle wurden hauptsächlich zur Untersuchung von HIV-Infektionen verwendet wird.

Eine der wichtigsten Einschränkungen dieser beiden Modelle war das Fehlen einer stabilen Rekonstitution der menschlichen Immunzellen in der Peripherie, um ihnen eine weitere physiologisch relevanten Modell HIV-Erkrankung zu untersuchen. Zu diesem Zweck wird die BLT humeinblech Mausmodell entwickelt wurde. BLT steht für Knochenmark / Leber / Thymus. In diesem Modell, 6 bis 8 Wochen alten NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SZJ (NSG) immungeschwächten Mäusen erhalten die thy / liv Implantat im SCID-hu Mausmodell nur von einem zweiten menschlichen hämatopoietischen Stammzelltransplantation ⁴ folgen. Der Vorteil dieses Systems ist die vollständige Rekonstitution des menschlichen Immunsystems in die Peripherie. Dieses Modell wurde verwendet, um eine HIV-Infektion und Latenz ^5-8 studieren.

Wir haben eine modifizierte Version dieses Modells, in denen wir genetisch humanen hämatopoetischen Stammzellen (HHSC) geändert, um die thy / liv Implantat durch Injektion von folgten transduzierten autologen HHSC ^{7, 9} konstruieren erzeugt. Dieser Ansatz führt zu der Erzeugung von genetisch veränderten Linien. Noch wichtiger ist, passten wir dieses System die Möglichkeit einer Erzeugung funktioneller zytotoxischen T-Zellen (CTL) Expression eines Melanom-spezifische T-Zell-Rezeptors zu untersuchen. Mit diesem Modell konnten wir die Funktionalität unserer transgenen CTL nutzen Live-Positronen-Emissions-Tomographie (PET) zur Rückbildung des Tumors (9) bestimmen zu beurteilen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, den Prozess der Erzeugung dieser transgenen Mäusen und Beurteilung in vivo-Wirksamkeit mit Live-PET-Bildgebung beschreiben. Als Hinweis, da wir menschliche Gewebe und lentiviralen Vektoren zu verwenden, entsprechen unseren Einrichtungen auf CDC NIH Richtlinien für Biosafety Level 2 (BSL2) mit besonderen Vorsichtsmaßnahmen (BSL2 +). Darüber hinaus sind die NSG Mäusen stark geschwächtes Immunsystem so muss ihre Wohnung und die Wartung zu den höchsten Gesundheits-Standards (entsprechen http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Erzeugung von BLT Mäusen

(1) Verarbeitung Fötalgewebe und Vorbereitung von CD34 humanen hämatopoetischen Stammzellen, (2) die Transplantation von menschlichem Gewebe, und (3) sekundäre Transplantation: die Generierung von Mäusen BLT ist in drei (3) Teile geteilt. Für alle Protokolle haben wir Tabelle 1 mit Reagenz bereitgestellten Informationen.

Ein. Gewebe-Verarbeitung und Isolierung von CD34 menschlichen hämatopoetischen Stammzellen

Frische fetalen Gewebe oder Gewebe über Nacht auf Eis aus verschiedenen Organbeschaffung Agenturen ausgeliefert verwendet werden kann. Oft Fötalgewebe ist nicht steril, wie durch die Herstellung von 1000 Bakterienkolonien auf Blutagar pro Milliliter umgebenden Medium belegt. Wir routinemäßig reinigen das Gewebe zweimal in 40 ml steriler PBS. Während dies nicht entfernt alle Bakterien, kann es eine Differenz zwischen einer erfolgreichen Transplantation Serie und ein Ergebnis, in dem die meisten der Empfängermäuse erliegen bakteriellen inPerfektion. Als ein zusätzlicher Schritt zur weiteren desinfizieren Gewebe, wir Kultur der Zellsuspension in Gegenwart von Antibiotika.

1,1 Verarbeitung von Fetal Thymusgewebes

1. Waschen Thymus durch Abgießen des Mediums in einem Becherglas von Bleichmittel und Verwenden Skalpell, um das Gewebe vor dem Abrutschen in dem Bleichmittel verhindern. Füllen Sie das Rohr mit PBS. Cap und schwenken einige Male, um den Thymus zu waschen. Dekantieren Überstand in Bleichmittel. Wiederholen.
2. Legen Sie die Thymusgewebe in 8 ml RPMI + 10% fötalem Kälberserum in einer 60-mm-Schale und Scherung in 1,5 bis 2 mm Stücke mit zwei Skalpelle. Scheren mit Skalpellen minimiert Reißen und eine Beschädigung der Gewebe-Bits. Beschädigtes Gewebe neigt dazu, geschwollen, klebrig und schwer in den Implantatnadel ziehen. Die Anzahl von Bits erhalten wird, das erste obere Grenze transplantierbare Mäusen.
3. Übertragen Sie die suspendierten Bits mit einer 25 ml Pipette (zu Gewebeschäden zu minimieren) in eine T25-Flasche. Fügen Sie 70 ul piptazo (Zosyn) den Kolben und Kultur über Nacht 2. Dies reduziert kontaminierenden Bakterien. Wenn Sie Typisierung oder andere Phänotypisierung Assays wünschen, nehmen Sie 1 ml der Zellen.

1,2 Verarbeitung von Fetal Liver Tissue

1. Waschen Sie die Leber, wie in Schritt 1.1.1.
2. 10 ml Medium und dekantieren alles Iscoves in eine 100 mm Petrischale.
3. Mit zwei Skalpelle, würfeln die Leber in kleine (ca. 3 mm) Stück. Wenn Sie in weiße Bindegewebe laufen, kratzen die Leber von ihm und entsorgen Sie sie in der Bleiche.
4. Homogenisieren des Gewebes durch Saugen in eine 12 ml-Spritze mit einer 16-Gauge-Nadel stumpfen 3 oder 4 Mal und Überführen in ein 50 ml-Röhrchen versehen.
5. Bereiten Sie die Enzyme für Gewebe Verdauung wie folgt: Zu 10 ml Iscove in einem 50-ml-Tube, 200 ul jeder: Collagenase Typ IV (1 mg / ml), Hyaluronidase (1 mg / ml), DNase I (2 U / ml).
6. Zeichnen Enzyme in eine 12 ml-Spritze und passen sie mit einem 0,22 μ-Filter. Filtern Sie die enzyme / Medium direkt in die Zellsuspension.
7. Cap und dichten die Zellen mit Parafilm. Drehen bei 37 ° C für 90 min.
8. Einrichten einer 50 ml-Röhrchen mit einer 100 μ Zellsieb. Pipet die Zelle durch dieses Sieb verdauen.
9. Hinzufügen PBS an die Zellen, um das Volumen auf 50 ml zu bringen. Split dies in zwei Röhren 25 ml.
10. Unterlegen die Zellen mit 10 ml Ficoll. Spin bei 2.400 rpm für 20 min ohne Bremse.
11. Die Schnittstelle sollte dick sein. Saugen Sie es mit einem 5 ml Pipette und Transfer zu einem anderen Rohr. Sie sollten über zwei Rohre Schnittstelle. 50 ml PBS zu jedem und drehen sich mit 1.200 Umdrehungen pro Minute für 10 min.
12. Kombinieren Pellets in einem Röhrchen und wäscht noch dreimal mit PBS, enthaltend 2% FCS.
13. Schließlich werden in 50 ml RPMI + 10% FCS und Graf Zellen mit Trypanblau auszusetzen. Abhängig von der Größe des Gewebes, können Sie von ^10. AUGUST - 10. SEPTEMBER insgesamt Hepatozyten erhalten.
14. Übertragen Sie die Zellen zu einem T150 einwiegen und 30 ml RPMI + 10% FCS und 0,8 ml piptazo.
15. Inkubieren für 1 bis 1,5 Stunden bei 37 ° C, um anhaftende Zellen zu entfernen.

1,3 Sortierung und Transduktion von CD34 hämatopoetische Stammzellen

1. Nach Befestigung der Zellen in Schritt 1.2.15, bewegen den Kolben hin und her sanft für eine Minute, um lose Zellen zu entfernen. Es wird eine Menge von Fibroblasten und wie stuck an der Oberfläche sein.
2. Zählen erneut mit einer 1 bis 20-Verdünnung und Aufzeichnen der Gesamtzahl der Zellen. Speichern wenige zehntel ml für spätere Färbung. Sie sollten etwa 30% weniger Zellen von Ihrem ersten Zellzahlen (Schritt 1.2.13).
3. Spin-down und waschen zweimal mit 40 ml MACS-Puffer.
4. CD34-Zellen sortiert werden mit Miltenyi Biotech CD34 Direkte Kit. Wir folgen genau dem Protokoll des Herstellers mit LS Säulen von der gleichen Firma zur Verfügung gestellt.
5. Gewonnenen Zellen werden in 5 ml betragen. Zählen und rechnen insgesamt Zellen. Ihre Rendite von CD34 +-Zellen sollten 3-5% Ihrer gesamten Zellzahlen sein. Dies ändert sich mit thE Alter des fetalen Leber. Jüngere fötale Leber tendenziell eine höhere Ausbeute an CD34 +-Zellen zu ergeben.
6. Teilen Sie die Anzahl der Zellen, die durch 1x10 ^6. Dies ergibt die zweite obere Begrenzung auf transplantierbare Mäusen.
7. Zählen Sie die CD34-Fraktion (Durchströmung und Waschungen) und Reserve 6 x 10 ⁶ pro Maus transplantiert werden. Kultur diese Zellen über Nacht in 50 bis 80 ml RPMI + 10% fötales Kälberserum + 1% piptazo.
8. Transduzieren die CD34 + Zellen über Nacht mit Ihrem Lentivirusvektor. Wir verwenden Retronectin von Takara nach genau den Anweisungen des Herstellers.
9. Am nächsten Tag, Ernte werden die CD34-Zellen, die transfizierten CD34 +-Zellen und zählen.
10. Teilen Sie die CD34 +-Zellen in der Hälfte: Teil A und Teil B.
11. Spindown Teil einer CD34 +-Zellen transduziert und suspendieren in 4 bis 6 ml Einfriermedium (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterilfiltriert). Geben Sie 1 ml Aliquots in Einfrierröhrchen und Etikett mit "huFetalCD34", die Anzahl der Zellen in dem Fläschchen, das Datum und Ihre Initialen.
12. Für jede Maus mischen 0.5x10 ⁶ Teil B CD34 + transduzierten Zellen und 4.5x10 ⁶ CD34-Zellen in einem sterilen Schraubverschluss Mikrozentrifugenröhrchen, Pellet-und auf Eis. Auch auftauen ein Rohr aus Matrigel (BD Biosciences) auf Eis. Alle diese Rohre müssen auf Eis gehalten werden bis zur Verwendung (gehen Sie zu Schritt 2,10).

2. Tissue Transplantation

Das Ziel dieses Schrittes ist es, einer humanen fötalen Thymus / Leber organoide unter dem NSG Maus Nierenkapsel transplantiert. Diese organoiden besser imitiert den Prozess der humanen T-Zell-Auswahl und Reifungsprozessen wie die humanen hämatopoetischen Stammzellen die menschlichen Thymus und nicht die Maus als Standort für ihre Differenzierung zu verschiedenen T-Zell-Linien und anderen lymphatischen verwenden. Die Verwendung von CD34-Zellen im Transplantationsverfahren ist neu zu generieren die fetale Leber Stroma und damit diese besser Transplantation und Wachstum des Implantats. Das Alter der NSG Mäusen beträgt 6-8 Wochen alt.

1. Herstellung von Medikamenten für surgery:
   1. Isofluran: Roll eine 2-Zoll-Gaze ​​und stopfen sie in eine 15 ml mit Schraubverschluss Zentrifugenröhrchen. Gießen Sie in ca. 1 ml von Isofluran direkt aus der Flasche.
   2. Ketamin / zylazine: In 0,52 ml Ketamin (Ketaset) (100 mg / ml) und 0,52 ml Xylazin (Anased) (100 mg / ml) zu einem 20 ml Fläschchen Kochsalzlösung zur Injektion. Label mit dem Ablaufdatum der frühesten auslaufenden Komponente und halten bei -20 ° C eingefroren, bis sie benötigt.
   3. Carprofen (Rimadyl). Verdünnte dies kurz vor einem chirurgischen Eingriff. Verdünnte 1:100 durch Zurückziehen 0,1 oder 0,2 ml aus dem Fläschchen mit einer 1 ml Spritze und einer 25G Nadel. Inject in eine 10 oder 20 ml Kochsalzlösung zur Injektion. Label und Datum. Halten Sie in den Kühlschrank für nur einen Tag. Laden in 3 ml Spritzen mit 25G Nadeln.
2. Richten Sie die Tabelle für Arztpraxen. Decken Sie sie mit sterilen blauen Pads und einem sterilen Tuch für jeden Chirurgen. Jeder Chirurg bekommt von ihrem Kasten von sterilisierten Instrumenten: 4 "Schere, gebogen stumpfen Pinzette, müssenle-nose Zangen, hemostat, 16G stumpf Trokar und Wundklammer Applikator. Darüber hinaus müssen sie eine gebogene-Nadel Vicryl Naht, einen Stapel von Isopropanol reinigen Pakete, eine 35 mm Petrischale PBS, und eine 1 ml Spritze mit PBS gefüllt.
3. Stellen Sie in der Mitte des Tisches ein Glas Coplin mit 2 cm Betadine und 2 Wattestäbchen. Gießen Sie den Thymus Bits in eine 60 mm Petrischale.
4. Die Narkose wird auf einem separaten Tisch oder in einer Kapuze mit sterilen blauen Pads durchgeführt wurden. Richten Sie zwei kleine Racks und eine elektronische Waage mit einem Becher, um die Mäuse zu halten. Verwenden Sie ein Rack bis 0,5 ml X 28G Insulinspritzen mit Ketamin / Xylazin und das andere geladen, um die 3 ml Spritzen von Carprofen halten halten. Auch bewegen biohazard Abfallbehälter in der Nähe, um die rasierte Fell zu halten.
5. Wiegen alle Mäuse (6-8 Wochen alt) in einem Käfig, um die durchschnittliche Gewicht und Belastung Spritzen mit einer Dosis von 15 ul / g Ketamin / Xylazin erhalten. Injizieren alle Mäuse in den Käfig.
6. Nachdem die Mäuse träge geworden rasieren ihre left Seite von der Hüfte bis zur Schulter zwischen der Mitte des Rückens und des Bauches mit einem Oster Schermaschine mit Nr. 40 Klinge. Notieren Sie ihr Gewicht, und schlagen ihre Ohren für die Nummerierung.
7. Inject 0,3 ml Carprofen subkutan über die Schulter.
8. Überprüfen Sie die Anästhesie Ebene der Maus durch Zusammendrücken einer Pfote. Wenn die Maus zuckt, verwalten Isofluran aus einem Rohr für ca. 12 sek. Dann versuchen die Pfote Squeeze wieder. Halten Sie geben kurze Einstellungen von Isofluran, bis die Pfote reflex verschwindet. Legen Sie die Maus auf der rechten Seite nach links.
9. Eine 16-Gauge-Krebs Implantationsnadel mit der Spitze abgelegt Runde eingesetzt wird, um das Gewebe einzuführen. Spülen Sie die Trokar ein paar Mal in der Schale von PBS. Hält es horizontal mit der Stange nur in der Spitze. Fügen Sie ein Stück des Thymus mit den nadelspitzige Pinzette und saugen sie in.
10. Ein Helfer fügt 5 ul kaltem Matrigel, um ein Rohr von Zellen (Schritt 1.3.12) mit einer Eppendorf Verdrängerpumpen Pipette und mischt durch leichtes Rühren. Der Chirurg holds die Trokar horizontal und zieht die Stange langsam zurück, wie der Helfer Pipetten die Matrigel-Mix in den Trokar. Die Mischung geliert bei Raumtemperatur.
11. Tupfer die nackte Haut mit Betadine. Dann wischen diese aus mit einem Isopropanol abwischen. Wiederholen.
12. Suchen Sie die Milz unter der Haut. Es ist die dunkelste Stelle. Der Mäuse Niere ist etwa 5 mm dorsal der Milz, die durch die rasierte Haut ersichtlich befindet.
13. Pick-up die Haut über diesen Punkt mit den stumpfen Pinzette und machen einen Schnitt parallel zu der Milz etwa 15 mm lang. Machen Sie einen ähnlichen Schnitt im Peritoneum Muskelschicht unten. Bei Männern sollte die Niere direkt sichtbar und Sie müssen einfach den Bauch drücken, bis sie herausspringt. Bei Frauen, müssen Sie holen die Eierstöcke mit der Gefäßklemme und ziehen Sie die Niere. Dies kann helfen, behalten die Niere außerhalb des Körpers. Für Männer, müssen Sie etwas Druck auf den Bauch zu halten mit der linken Hand zu halten die Niere freigelegt.
14. Zupfen Sie ein kleines Loch in der posterior Ende der Nierenkapsel. Es kann bluten ein wenig.
15. Schieben der Trokar in dieses Loch und entlang der Niere, bis die Öffnung des Trokars wird vollständig durch die Nierenkapsel bedeckt. Dann mit dem kleinen Finger der rechten Hand, injizieren das Gewebe.
16. Schieben Sie die Niere wieder in sanft mit den geschlossenen hemostat. Setzen Sie einen Stich in das Bauchfell mit einem Doppel-Know gebunden. Drücken Sie die Haut wie eine Handtasche und legte zwei Wundklammern.
17. Geben Sie einen Tropfen PBS auf jedem Auge und legen Sie die Maus auf die Seite des Käfigs Betten. Stellen Sie sicher, dass alle Mäuse der Verlegung auf dem Bauch, bevor er sie zurück.
18. Am nächsten Tag, geben jeder Maus einen weiteren Schuss von Carprofen.

3. Sekundäre Transplantation

Das Ziel dieses Schrittes bei der Erzeugung von Mäusen BLT soll die moue Knochenmark mit humanen hämatopoetischen Stammzellen zu füllen. Das transplantierte Implantat aus dem Verfahren (2) ist nicht ausreichend, um vollständige Wiederherstellung th unterstützte menschlichen Immunsystems bei diesen Mäusen. Während der sekundären Transplantation, wir subletal bestrahlen die Mäuse auf murine Knochenmarkszellen abzureichern somit Erzeugen "Raum" zur Implantation der humanen CD34 +-Zellen.

1. Vier bis sechs Wochen später bestrahlen die Mäuse mit 2,7 Gy. Die Mäuse injiziert werden am selben Tag mit Teil A CD34 + transduzierten Zellen. Der Zeitrahmen ist auf die Errichtung und das Wachstum des thy / liv Implantat in Schritt 2 transplantiert basiert. Typischerweise wird während dieser Zeit das Implantat wesentlich ermöglicht es uns, die nächsten Schritte gehen gewachsen.
2. Auftauen Teil A CD34 + transduzierten Zellen, waschen und auszusetzen Medium auf eine Konzentration von 5x10 ⁶ / ml.
3. Geladen 0,5 ml X 28G Insulinspritzen mit 0,1 ml Zellen (10 ⁵ bis 5x10 ⁵ Zellen pro 0,1 ml pro Maus) für einen Käfig von Mäusen (jeder Käfig enthält maximal 5 Mäuse) und legen sie auf einem Gestell abgewandt.
4. Anästhesieren einer Maus mit einem Rohr durch Isofluran schnappen sie und Halten ihrerNase in den Rohren für ca. 20 sek. Count to Spur der Zeit zu halten.
5. Dann stellen Sie sie nach rechts, und ziehen Sie die Haut um den Hals fest mit dem Daumen und Zeigefinger der linken Hand. Drücken Sie unter der Kiefer mit Ihrem dritten finder, so dass seine rechte Auge wölbt. Halten Sie die Spritze parallel zur langen Achse der Maus den Kopf, rutscht die Nadel hinter dem Auge und schieben Sie sie vorsichtig, bis sie stoppt. Drücken Sie keine weiteren, aber spritzen die Last auf ca. 2 sek.
6. Zwei bis drei Monate später Mäuse retroorbital blutete unter Verwendung von EDTA beschichteten Glas-Pipetten. Sie können nur maximal 200 ul Blut pro Monat pro Maus. 50-100 ul Blut sollte ausreichend sein für FACS-Analyse. Alternative Blutungen Strategien gehören Vena facialis blutet und Schwanzvene blutet. Letzteres wird Ihnen sehr kleine Mengen von Blut, das nicht ausreichend sein kann für mehrere Assays.
7. Blutproben werden für die Expression des humanen Lymphocyten CD45 zur Rekonstitution beurteilen angefärbt. Blood Proben werden in 1 ml Erythrozyten-Lyse-Puffer (160 mM _NH4Cl, 100 mM KHCO _3, 0,01 mM EDTA) zugegeben und für 5 min bei Raumtemperatur.
8. Waschen Sie die Zellen in Lysepuffer, 5 min bei 1.200 rpm und bei Bedarf wiederholen.
9. Zentrifuge Zellen wie in 3,8 und Waschen in PBS mit 3% fötalem Kälberserum (FACS-PBS), ergänzt.
10. Überstand entfernen und wieder auszusetzen Pellets in 100 ul FACS-PBS.
11. Hinzufügen Antikörpern gegen humanes Lymphocyten Rekonstitution beurteilen. Wir schließen typischerweise die folgende CD45 (humanes Lymphozyten-Marker), CD8, CD4, CD14 und CD16 für Makrophagen und Monozyten, CD19 für B-Zellen und CD56 für NK-Zellen.
12. Inkubieren bei 4 ° C für 30 min.
13. Waschen, wie in Schritt 3.9 und resuspendieren Zellen in 2% Paraformaldehyd für FACS-Analyse.
14. Wenn Mäusen rekonstituiert werden, gehen wir mit Tumor-Injektionen. Rekonstitution Ebenen menschlichen Lymphozyten variieren, von weniger als 1% bis 40% der gesamten Blutzellen. Die Ebenen und Arten von lymphocYTE Linien sind vergleichbar, was man von gesunden menschlichen Blutspendern erwarten. Allerdings erwarten tun Schwankungen in der Anzahl von nicht-T-Zell-Linien. Wenn die Zahlen nicht innerhalb der 12-wöchigen Zeitraum akzeptable Sie könnten die sekundären Transplantation von Schritt 3,1 wiederholen.
15. Tumor-Zelllinien sind nach Angaben des Herstellers oder im Labor Empfehlungen kultiviert. Die Zellen werden geerntet, gewaschen und in Matrigel im Verhältnis 1:1 (50 ul Zellen/50 ul Matrigel). Die Proben werden auf Eis zu allen Zeiten gehalten.
16. Mäuse werden anästhesiert und rasiert am Ort der Injektion. Das Gebiet ist sterilisiert mittels eines Isopropanol-Pad. Ein Helfer Lasten Zellsuspensionen in pre abgekühlt 23G 1 ml Spritzen. Tumorzellen werden subkutan injiziert. Behandeln Sie die Injektionsstelle mit antibiotischen Salbe. Tumoren sollte etablieren und wachsen beginnen in 4 Wochen.

B. In vivo Positronen-Emissions-Tomographie (PET)

Für unsere Untersuchungen haben wir Prüfungine Glukoseaufnahme ^([18 F]-FDG ^([18 F] FDG) damit Mäuse werden 4-6 Stunden vor der Bildgebung. microPET / CT-Scans werden unter Verwendung der microPET Inveon Scanner (Siemens Präklinische Solutions) und MicroCATII CT-Scanner gefastet ( Siemens PreclinicalSolutions). Bildanalyse erfolgt mit OsiriX (Pixmeo, Schweiz) Software. Das Ziel ist, die metabolische Aktivität des Tumors zu messen und letztlich zu PET-Bildgebung als eine Alternative zu körperlich messen Tumorregression zu verwenden. Wie in 2 zu sehen, haben wir gestoßen Tumoren, die auf die körperliche Aussehen und Größe basieren nicht gezielt, sondern Live-PET-Bildgebung ergab eine weitgehende Gewebenekrose. Diese Methodik kann als sensibler und genauer Indikator der Tumorregression dienen.

1. Bestimmen Sie eine Kammer für betäubende (2% Isofluran) den Mäusen, und eine Kammer als 60 min Aufnahme von FDG vor PET-Scanning ("Warten Kammer"). Zeigen blaue Pads in beiden Kammern.
2. Wie Tiere sind Anesthetized über lange Zeiträume, sollten sie warm gehalten werden bei 30 ° C durch die Verwendung von Wasser gefüllten Handschuhen, die in einem Mikrowellenherd erwärmt werden und Platzieren der Käfige auf Heizkissen.
3. Schalten Sie die Isofluran-Flow für diese Kammer auf. Lassen Sie die Isofluran die betäubende Kammer für etwa 5-10 min, bevor Sie irgendwelche Mäuse in der Kammer zu füllen. Stellen Sie sicher, dass der Deckel verriegelt ist und dicht zu vermeiden undicht Isofluran.
4. Legen Sie die erste Maus in die betäubende Kammer und verriegeln Sie den Deckel fest. Lassen 5-10 min oder bis die Maus ist bewusstlos.
5. Entfernen Sie die Maus aus der betäubende Kammer Label der Schwanz der Maus (andere Farbe pro Käfig) und injizieren intraperitoneal die Maus mit ^[18 F] FDG (80 uCi). Nehmen Sie sich die Zeit wurde die Maus injiziert. Die Maus wird betäubt werden wieder 50 min von diesem Zeitpunkt, so dass für 10 min zur Einrichtung für PET-Scanning (für insgesamt 60 min ^[18 F] FDG-Aufnahme vor dem PET-Scanning).
6. Legen Sie die injiziert Maus in der Wartezeit Kammer, in welcher ^[18 F] FDG-Aufnahme für 1 Stunde vor PET-Scanning. Nicht verriegeln Sie den Deckel. Lassen Sie den Deckel lose um den Luftstrom zu ermöglichen.
7. Unmittelbar legen Sie die nächste Maus für FDG-Injektion in die betäubende Kammer. Nachfolgende Mäusen Injektionen sollten 10 min auseinanderliegen, weil der Prozess der PET-Scanning ist 10 min. Unmittelbar nach einem Mausklick gescannt wird, wird die 60 min FDG für die nächste Maus gescannt werden bereit sein, genau 10 min auseinander.
8. Weiter Betäubung und Injizieren Mäusen wie in den Schritten 7-9 angegeben.
9. Nach 50 min von der ersten Maus Injektion Zeitpunkt, platzieren Sie den ersten injiziert Maus in die betäubende Kammer wieder (trotzdem noch weiter zu betäuben und injizieren Mäuse).
10. Schließen Sie die Maus Bett auf den Sauerstoff und Isofluran Linien, und drehen Sie das Isofluran Strömung auf für das Bett. Legen Sie einen blauen Pad auf dem Bett.
11. Platzieren Sie die Maus bereit für PET-Scanning auf dem Bett, streckte die Arme undBeine und hält diese Position mit Klebeband. Zeigen Schmierstoff über den Augen. Dieser Schritt ist der wichtigste, da die Positionierung des Tieres die Qualität Ihrer Bildgebung auswirken können.
12. Trennen Sie die Isofluran und Sauerstoff Linien und schnell montieren das Bett auf der PET-Scanning-Maschine. Legen Sie die Isofluran und Sauerstoff-Linien. Stellen Sie sicher, dass der Isofluran-Flow ist für die PET-Scanning-Maschine. Schließen Sie das PET-Scanning-Kabel und starten Sie den Scanvorgang.
13. Sobald der PET-Scan abgeschlossen ist dann bewegen das Tier dem CT-Scanner. Im Anschluss an diese Prüfung zu bewegen das Tier in das jeweilige Käfig.

Representative Results

Ein Flussdiagramm des Transplantationsverfahren ist in 1A gezeigt. Ein Bild von der thy / liv Implantat wird in 1B gezeigt. Die Thymusgewebes entwickelt normal und hat eine physiologische Verteilung von menschlichen CD4-und CD8-T-Zellen. Nach der Rekonstitution tragen die Tiere einen menschlichen Immunsystems mit normalen Verteilung von CD4, CD8 T-Zellen und anderen Immunzellen Linien.

Die Diskrepanz zwischen Tumorgröße und lebendes Gewebe ist in Abbildung 2 gezeigt. Während die Computertomographie (Grauzone) zeigte eine große Tumorwachstum in vivo PET-Bildgebung zeigte, dass es meistens nekrotischen und Narbengewebe (Abbildung 2) betrug. Dies unterstreicht den Nutzen der PET-Bildgebung als empfindlicher und präziser Weg zur Rückbildung des Tumors und die Clearance zu beurteilen.

Abbildung 1. (A) eine schematische Darstellung auf dem modifizierten Modell BLT in diesen Untersuchungen für die Erzeugung von chimären Mäusen, MART-1 spezifischen T-Zellen verwendet. Die Thy / Liv Implantat rekonstruiert aus transduzierten und nicht-transduzierten CD34-Zellen aus einer autologen fötale Leber isoliert. Ein Bruchteil der transduzierten Zellen eingefroren und in den bestrahlten Mäuse injiziert 4-6 Wochen später. (B) A repräsentatives Bild der thy / liv Implantat in humanisierten Mäusen. Die Implantate haben eine physiologische Verteilung im Gewebe und CD4/CD8 wie von der IHC und Durchflusszytometrie Figuren gezeigt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 2. Ein PET-und CT-Bild einer Maus, die ein Melanom Tumor. DieGrauzone gibt die physikalische Größe des Tumors, während die rote Farbe zeigt des Tumors Stoffwechselaktivität, die sehr begrenzt ist.

Discussion

Die modifizierte BLT humanisierten Mausmodell mit in vivo PET-Bildgebung verbunden sind leistungsfähige Werkzeuge, um chronische Krankheiten zu studieren. Dieses System nimmt die BLT Mausmodell und Fortschritten, die sie über den begrenzten Spielraum für HIV-Forschung. Darüber hinaus ist es ein großes System, in dem wir verschiedene Gentherapieprotokollen sowie diagnostische Techniken untersucht werden können, bevor sie den klinischen Umgebung erreichen. Die letztere mit den niedrigen Kosten der Verwendung von Mäusen gegenüber Primaten gekoppelt ist dies ein sehr nützliches Modell.

Die PET-Imaging-Technologie erlaubt es uns, die Wirksamkeit unseres Ansatzes zu beurteilen. Wenn wir ausschließlich stützte sich auf physikalische Messungen des Tumors, würden wir die Potenz der Antitumor-Antwort von unseren transgenen T-Zellen generiert unterschätzt haben. Das umfangreiche Narben und Nekrosen gab das Aussehen eines großen Tumor, der in Wirklichkeit war totes Gewebe.

Abschließend das Dienstprogramm des modifizierten BLT Maus modell kann auch auf andere Erkrankungen Modelle erweitert werden. Während einige Nachteile noch wie die kürzeren Lebensspanne von Mäusen bestehen, kann dies ein sehr starkes Instrument, um in vivo zu beurteilen viele Aspekte des menschlichen Immunität, testen und entwickeln neue therapeutische Interventionen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx