Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול

Published: December 18, 2012 doi: 10.3791/4181
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 4, 1,2,3, 1,2,5
1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

הדור והאפיון של תאי T ספציפיים סרטניים באמצעות עכבריים מתואר כאן. רקמה הרתי אדם ותאי גזע hematopoietic מהונדס גנטי אדם מושתלת לעכברי מדוכאי חיסון. התוצאה הוא הכינון מחדש של מערכת חיסון אנושית מהונדסת מאפשרת בבדיקת vivo של תגובות חיסוניות אנטי סרטניות.

Abstract

מודלים של בעלי חיים קטנים כגון עכברים נעשו שימוש נרחב על מחלה אנושית ולפתח התערבויות טיפוליות חדשות. למרות השפע של מידע המתקבל ממחקרים אלה, המאפיינים הייחודיים של חסינות עכבר כמו גם את הספציפיות של מיני מחלות נגיפיות כמו נגיף כשל חיסוני אנושי (HIV) זיהום הובילו לפיתוח של מודלים עכבריים. הדגמים הקודמים כללו שימוש בג B 17 עכברים SCID / SCID וההשתלה של בלוטת התימוס האנושי עוברית וכבד עובריים מכונית / ליב (SCID-hu) 1, 2 או העברת המאמצת של לויקוציטים דם ההיקפי אדם (SCID-huPBL ) 3. שני הדגמים נוצלו בעיקר לצורך הלימוד של ההידבקות ב-HIV.

אחת המגבלות העיקריות של שני מודלים אלה היה חוסר יציבות הכינון מחדש של תאי מערכת חיסון אנושיים בפריפריה כדי להפוך אותם יותר מבחינה פיזיולוגית מודל רלוונטי על מחלת איידס. לשם כך, זמזום BLTמודל העכבר anized פותח. BLT עומד למח עצם / כבד / התימוס. במודל זה, 6-8 בן השבוע NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) עכברי מדוכאי חיסון יקבל את שתלך / ליב כמו במודל של עכברי SCID-hu רק כדי להיות אחרי השתלה שנית אדם גזע hematopoietic תא 4. היתרון של שיטה זו הוא הכינון מחדש המלא של מערכת החיסון האנושית בפריפריה. דגם זה נעשה שימוש כדי לחקור הדבקה ב-HIV והשהיה 5-8.

לנו שנוצרנו גרסה שונה של מודל זה שבו אנו משתמשים בשינוי גנטי בתאי גזע hematopoietic אדם (hHSC) כדי לבנות את שתלך / ליב אחרי ההזרקה של transduced עצמי 7 hHSC, 9. גישה זו גורמת לדור של שושלות מהונדסות גנטי. וחשוב יותר, התאמן במערכת זו כדי לבחון את הפוטנציאל של יצירת תאי T ציטוטוקסיים תפקודיים (CTL) מבטא רצפטור תא T ספציפי מלנומה. שימוש במודל זה היינו יכול להעריך את הפונקציונליות של CTL המהונדס ניצול חייה פליטת פוזיטרוני הדמית טומוגרפיה (PET) כדי לקבוע נסיגת גידול (9).

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את תהליך יצירת העכברים הטרנסגניים הללו והערכה ביעילות vivo שימוש בבדיקה PET חי. בתור הערה, שכן אנו משתמשים רקמות אדם ווקטורי lentiviral, המתקנים שלנו תואמים את הנחיות ה-CDC NIH לרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL2) עם אמצעי זהירות מיוחד (BSL2 +). בנוסף, עכברי NSG הם immunocompromised קשות וכך, הדיור ואחזקתם חייב לעמוד בסטנדרטים הגבוהים ביותר לבריאות (http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html).

Protocol

דור א 'של עכברי BLT

הדור של עכברי BLT מחולק לשלושה (3) חלקים: (1) עיבוד של רקמה והכנת CD34 תאי גזע עוברי אנושיים hematopoietic, (2) השתלה של רקמה אנושית, ו (3) השתלה משנית. לכל הפרוטוקולים, אנו מספקים טבלה 1 עם מידע מגיב.

1. עיבוד רקמות ובידוד של CD34 תאי גזע hematopoietic אדם

רקמה טריה או רקמה עוברית נשלחת לילה על קרח מסוכנויות רכש איברים שונות ניתן להשתמש. לעתים רקמה עוברית היא לא סטרילי, כפי שמעיד ייצור של 1000 מושבות חיידקים על אגר דם למ"ל של מסביב בינוני. אנחנו באופן שגרתי לשטוף את רקמות פעמים ב40 מ"ל של PBS סטרילית. אמנם זה לא מסיר את כל החיידקים, זה יכול לעשות את הבדל בין סדרה מצליחה השתלה ותוצאה שברוב עכברי הנמען נכנעה לחיידקים בfection. כצעד נוסף, כדי להמשיך לחטא את הרקמה, אנו תרבות השעית התא בנוכחות אנטיביוטיקה.

1.1 עיבוד של רקמה עוברית הרתי

  1. שטוף התימוס על ידי שפיכה את המדיום לכוס של אקונומיקה ובאמצעות אזמל כדי למנוע גלישה לרקמות מהאקונומיקה. מלא את הצינור עם PBS. כובע ולהפוך כמה פעמים כדי לשטוף את התימוס. supernatant למזוג לאקונומיקה. חזור.
  2. הנח את רקמת התימוס במיליליטר 8 מתוך RPMI + 10% נסיוב עגל העוברי בצלחת 60-מ"מ וגזירה ל1.5-2 מ"מ עם שני חתיכות אזמלים. הטיה באזמלים ממזערת קריעה ופגיעה בפיסות הרקמה. רקמות פגועות נוטות להיות נפוח ודביק, וקשה למשוך למחט השתל. מספר הביטים שהתקבלו הוא הגבול העליון הראשון בעכברים להשתלה.
  3. מעביר את החתיכות המושעות עם pipet 25 מ"ל (כדי למזער ניזק לרקמות) לT25 בקבוק. הוסף 70 μl של piptazo (Zosyn) לבקבוק ותרבות הלילה, 2. זה ניכר מפחית חיידקים מזהמים. אם ברצונך לעשות הקלדת רקמה או כל מבחני phenotyping אחרים, להוציא 1 מ"ל של תאים.

1.2 עיבוד של רקמת כבד עוברית

  1. שטוף את הכבד כמו בשלב 1.1.1.
  2. הוסף 10 מ"ל של כל המדיום ומזוג של Iscove לתוך צלחת פטרי 100 מ"מימ.
  3. עם שני אזמלים, קוביות כבדות לקטנות (~ 3 מ"מ) חתיכות. אם אתה נתקלת ברקמת חיבור לבנה, מגרד את הכבד ממנו ולהשליך אותו באקונומיקה.
  4. הומוגני רקמות על ידי מציצה אותו לתוך מזרק 12 מ"ל מצויד במחט מד בוטה 16 3 או 4 פעמים ומעבירים לצינור מ"ל 50.
  5. הכן את האנזימים לעיכול רקמה כדלקמן: כדי 10 מ"ל של Iscove של בצינור מ"ל 50, להוסיף 200 μl של כל: collagenase הסוג IV (1 מ"ג / מ"ל), hyaluronidase (1 מ"ג / מ"ל), DNase (2 U / מ"ל).
  6. צייר אנזימים לתוך מזרק מ"ל 12 ולהתאים אותו עם מסנן μ 0.22. סנן enzy/ בינוני ישירות לתוך השעית התא.
  7. כובע ולאטום את התאים עם Parafilm. סובב ב 37 מעלות צלזיוס למשך 90 דקות.
  8. הגדר את צינור מ"ל 50 עם מסננת תא μ 100. Pipet התא לעכל דרך המסננת הזו.
  9. הוסף PBS לתאים להביא עד 50 מיליליטר הנפח. פיצול הזה לשתי שפופרות של 25 מ"ל.
  10. רובד תחתון את התאים עם 10 מ"ל של Ficoll. הספין בסל"ד 2400 עבור 20 דקות ללא בלם.
  11. הממשק צריך להיות עבה. תמצוץ אותו החוצה עם pipet 5 מ"ל והעברה לצינור אחר. אתה צריך שני צינורות של ממשק. הוסף 50 מ"ל של PBS לכל אחד וספין בסל"ד 1200 למשך 10 דקות.
  12. שלב את הכדורים לתוך צינור אחד ולשטוף שלוש פעמים נוספות עם PBS המכיל 2% FCS.
  13. לבסוף להשעות ב50 מ"ל של RPMI + 10% תאי ספירה באמצעות trypan כחול FCS ו. בהתאם לגודל של הרקמה, אתה יכול לקבל מאוגוסט 10 - ספטמבר 10 hepatocytes כלל.
  14. להעביר את התאים לT150 בקבוק ולהוסיף 30 מ"ל של RPMI + 10% FCS ו 0.8 מ 'מערבל piptazo.
  15. דגירה ל1-1.5 שעות ב 37 ° C כדי להסיר תאי חסיד.

1.3 מיון ופרידמן ושל CD34 תאי גזע hematopoietic

  1. לאחר חיבור של תאים בשלב 1.2.15, להתסיס את הבקבוק בעדינות קדימה ואחורה לרגע כדי לסלק תאים רופפים. יהיה הרבה fibroblasts והדביק כזה על פני השטח.
  2. תספור שוב באמצעות 1-20 דילול ולרשום את המספר הכולל של תאים. לחסוך כמה עשירית מ"ל להמשך ההכתמה. צריך להיות לך כ 30% פחות תאים מספירת התאים הראשונית שלך (צעד 1.2.13).
  3. ספין למטה ולשטוף פעמים עם 40 מ"ל של חיץ MACS.
  4. CD34 תאים מסודרים באמצעות הערכה הישירה של Miltenyi יוטק CD34. אנו עוקבים בדיוק הפרוטוקול של היצרן באמצעות עמודות LS הניתנים על ידי אותה החברה.
  5. תאים ששוחזרו יהיו ב5 מ"ל. לספור ולחשב תאים בסך הכל. התשואה של CD34 + תאים שלך צריכה להיות 3-5% מכלל ספירת התאים שלך. זה משתנה עם הגיל דואר של הכבד העוברי. כבדי עובר צעירים נוטים לתת תשואה גבוהה יותר של תאי CD34 +.
  6. מחלק את מספר התאים על ידי 1x10 6. זה נותן את הגבול העליון השני בעכברים להשתלה.
  7. ספירת CD34-השבריר (זרימה דרך וכביסות) ו 6 מילואי x 10 6 לעכבר להיות מושתלים. תרבות תאים אלה יומיים בשנת 50-80 מ"ל של RPMI + 10% עגל סרום עוברי + piptazo 1%.
  8. Transduce את CD34 + תאי הלילה עם וקטור lentiviral. אנו משתמשים retronectin ידי TAKARA בעקבות בדיוק את הוראות היצרן.
  9. למחרת, קציר התאים CD34-, את transfected CD34 + התאים והספירה.
  10. לפצל את CD34 + תאים בחצי: חלק וחלק ב '
  11. ספין למטה חלק א CD34 + תאי transduced ולהשעות ב4-6 מ"ל של מדיום הקפאה (RPMI + 10% + 10% FCS DMSO, 0.22 μ סטרילי המסונן). שים 1 aliquots מ"ל לתוך צלוחיות ומקפיאות עם תווית "huFetalCD34", מספר התאים במבחנה, תאריך, וראשי התיבות של שמך.
  12. לכל עכבר לערבב 0.5x10 6 חלק ב 'CD34 + transduced תאים ו4.5x10 6 CD34-תאים במבחנה סטרילית microfuge פקק, גלולה ולשמור על קרח. גם להפשיר צינור של Matrigel (BD Biosciences) על קרח. כל הצינורות האלה חייבים להישמר על קרח עד שימוש (ללכת צעד 2.10).

2. השתלת רקמות

המטרה של שלב זה היא השתלה תימוס עוברי אנושי / organoid כבד תחת הקפסולה כליות עכבר NSG. organoid זה טוב יותר מחקה את התהליך של בחירה האנושית T תא ותהליכי הבשלה כתאי הגזע hematopoietic האדם ישתמשו בבלוטת התימוס האנושית ולא העכבר כאתר להתמיינותם לתאי T שונים ושושלות הלימפה אחרות. השימוש בתאי ה-CD34 בתהליך ההשתלה הוא להפיק מחדש את stroma הכבד העוברי ולאפשר להשתלה וצמיחה טובות יותר של השתל. גיל עכברי NSG משמשים הוא בן 6-8 שבועות.

  1. הכנה של תרופות לsurgery:
    1. Isoflurane: מרדד את תחבושת 2 אינץ ודוחף אותה לצינור צנטריפוגה screwcap מ"ל 15. יוצק כ 1 מ"ל של isoflurane ישירות מהבקבוק.
    2. קטמין / zylazine: הוסף 0.52 מ"ל של קטמין (Ketaset) (100 מ"ג / מ"ל) ו0.52 מ"ל של xylazine (Anased) (100 מ"ג / מ"ל) לבקבוקון 20 מ"ל של תמיסת מלח להזרקה. תווית עם תאריך התפוגה של הרכיב שפג תוקף המוקדם ולשמור קפוא ב -20 ° C עד צורך.
    3. Carprofen (Rimadyl). לדלל זה ממש לפני הליך כירורגי. דלל 1:100 ידי משייכת 0.1 או 0.2 מ"ל מהבקבוקון עם מזרק 1 מ"ל ומחט 25G. תזרים 10 או 20 מ"ל של תמיסת מלח להזרקה. תווית ותאריך. שמור במקרר ליום אחד בלבד. טען לתוך 3 מזרקי מ"ל עם מחטי 25G.
  2. להגדיר את הטבלה לניתוחים. כסה אותה עם תחבושת סטרילית כחולה, ומגבת סטרילית עבור כל מנתח. כל מנתח מקבל מתיבתם של מכשירים מעוקרים: 4 "מספריים, מלקחיים בוטים מעוגלים, צריכיםמלקחי le-אף, מלקחיים, trochar הקהה 16G, ומוליך קליפ פצע. בנוסף, הם צריכים תפר מעוגל-מחט Vicryl, ערימה של isopropanol לנגב מנות, צלחת פטרי 35 מ"מ של PBS, ומזרק 1 מ"ל מלא עם PBS.
  3. ממוקם במרכזו של שולחן צנצנת זכוכית Coplin עם 2 סנטימטר של פולידין ו2 ספוגיות כותנה. יוצק את ביטי התימוס לתוך צלחת פטרי 60 מ"מ.
  4. ההרדמה מתבצעת על שולחן נפרד או במכסת מנוע מכוסה בכתמי כחולים סטריליים. הקים שני מדפים קטנים ואיזון אלקטרוני עם כוס להחזיק בעכברים. השתמש במתלה אחד להחזיק 0.5 מיליליטר מזרקי אינסולין X 28g העמוסים קטמין / xylazine והאחר להחזיק את 3 מזרקי המ"ל של carprofen. גם להזיז את מכולת biohazard ליד להחזיק פרווה המגולחת.
  5. לשקול את כל העכברים (6-8 שבוע ישן) בכלוב כדי לקבל את המשקל הממוצע ומזרקי טעינה במינון של 15 μl / g של קטמין / xylazine. הזרק את כל העכברים בכלוב.
  6. אחרי העכברים הפכו איטיים לגלח LEFצד לא מן הירך לכתף שבין מרכז הגב והבטן עם גוזז אוסטר עם 40 להב המס. הקלט את המשקל שלהם, ולהכות את אוזניהם למספור.
  7. להזריק 0.3 המ"ל carprofen תת עורי על כתף.
  8. בדקו את רמת ההרדמה של העכבר על ידי סחיטת כפה. אם נרתע העכבר, לנהל isoflurane מצינור לשנייה על 12. ואז לנסות לסחוט כפה שוב. שמור נותנים יריות קצרות של isoflurane עד רפלקס הכפה נעלם. הנח את העכבר על הצד הימני שלה פונה שמאלה.
  9. מחט מד 16-סרטן שתל, עם סיבוב הקצה הגיש משמשת להוספת הרקמה. לשטוף את trochar כמה פעמים בצלחת של PBS. מחזיק אותו אופקי עם המוט רק בתוך הקצה. הוסף חתיכת התימוס עם מלקחי נידלנוז ולמצוץ אותו פנימה
  10. עוזר מוסיף 5 μl של Matrigel הקר לצינור של תאים אחד (צעד 1.3.12) עם pipet תזוזה חיובית אפנדורף, ומערבב על ידי ערבוב עדין. חול המנתחds trochar אופקי ומושך את המוט חזרה לאט כעוזר pipets תמהיל Matrigel לtrochar. תערובת הג'לי בטמפרטורת חדר.
  11. ספוגית העור החשוף עם פולידין. לאחר מכן לנגב את זה עם isopropanol לנגב. חזור.
  12. אתר את הטחול מתחת לעור. זהו המקום החשוך ביותר. הכליות של העכבר ממוקמות כ 5 מ"מ הגבה לטחול, אשר ניתן לראות דרך העור המגולח.
  13. להרים את העור במקום הזה עם מלקחיים הבוטים ולעשות במקביל לקיצוץ בטחול כ 15 מ"מ הארוך. לעשות חתך דומה בשכבת שריר הצפק להלן. אצל גברים, הכליות צריכות להיות גלויות וישירות אתה פשוט צריך ללחוץ על הבטן כדי לפוצץ אותו. אצל נשים, יכול להיות שתצטרך להרים את השחלה עם המלקחיים וגררו את הכליות. זה עשוי לעזור לשמור על הכליות מחוץ לגוף. עבור גברים, תהיה לך לשמור על לחץ מסוים על הבטן עם יד השמאל שלך כדי לשמור על הכליות חשופות.
  14. Pluck חור קטן בposterioסוף r של הקפסולה הכליות. זה עלול לדמם מעט.
  15. חלק את trochar לתוך החור הזה ולאורך הכליות עד הפתח של trochar מכוסה לחלוטין בכמוסת הכליות. ואז באמצעות האצבע הקטנה של יד הימין שלך, להזריק את הרקמה.
  16. דחוף את הכליות בחזרה בעדינות עם המלקחיים הסגורים. שים תפר אחד בצפק קשור עם ידע כפול. לסחוט את העור כמו ארנק ולשים בשני קליפים פצע.
  17. שים טיפה של PBS על כל עין ולהניח את העכבר על הצד שלה על מצעי כלוב. ודא שכל העכברים חזרו לנחת על גחונם לפני שעזב אותם.
  18. למחרת, תן לכל עכבר עוד זריקה של carprofen.

3. השתלה משנית

מטרתו של שלב זה בדור של עכברי BLT היא לאכלס את מח העצם המעוקם עם תאי גזע hematopoietic אדם. השתל המושתל מהליך (2) הוא לא מספיק כדי לתמוך בכינון מחדש מלא של הדואר מערכת חיסון אנושית בעכברים אלו. במהלך ההשתלה המשנית, אנו תת קטלניים להקרין את העכברים כדי לרוקן את תאי מח עצם Murine וכך ליצור "מרחב" להשתלה של אדם CD34 + תאים.

  1. כעבור ארבעה עד שישה שבועות להקרין את העכברים עם 2.7 Gy. העכברים מוזרקים באותו היום עם חלק א CD34 + תאי transduced. מסגרת הזמן מבוססת על ההקמה והצמיחה של שתלך / ליב הושתל בשלב 2. בדרך כלל, בתקופה זו גדל באופן משמעותי השתל מאפשר לנו להמשיך לשלבים הבאים.
  2. תפשיר חלק א CD34 + תאי transduced, לשטוף ולהשעות במדיום לריכוז של 5x10 6 / מ"ל.
  3. טענת 0.5 מזרקי אינסולין 28g מיליליטר X עם 0.1 מ"ל של תאים (10 5 ל5x10 5 תאים לכל 0.1 מ"ל לעכבר) לכלוב של עכברים אחת (כל כלוב מכיל מקסימום 5 עכברים) ומניח אותם על מדף פונה משם.
  4. הרדם עכבר עם צינור isoflurane ידי scruffing והחזקתהאף בצינורות לשנייה על 20. ספירה כדי לעקוב אחר הזמן.
  5. ואז פניו לימין, ומושך את העור מסביב לצוואר שלה חזק עם האגודל והאצבע של יד השמאל. לחץ מתחת ללסת שלה עם המאתר השלישי שלך, כך שעין הימין שלה מתבלטת החוצה. מחזיק את המזרק המקביל לציר הארוך של ראשו של העכבר, להחליק את המחט מאחורי העין וחלק אותו בעדינות עד שייעצר. אל תלחץ עוד, אבל להזריק את העומס מעל השנייה על 2.
  6. שניים עד שלושה חודשים לאחר מכן עכברים דממו retroorbitally באמצעות pipettes זכוכית המצופית EDTA. אתה יכול לקחת את מקסימום של 200 μl דם לחודש לכל עכבר בלבד. 50-100 μl דם צריך להיות מספיק לניתוח FACS. אסטרטגיות אלטרנטיביות כוללות דימום דימומי וריד פן ומדמם וריד זנב. האחרונים ינתנו לך כמויות קטנות מאוד של דם שעלולה לא להספיק למבחנים מרובים.
  7. דגימות דם הכתים לביטוי סמן הלימפוציטים האנושי CD45 להעריך כינון מחדש. Bדגימות עונג עילאי טבע דם מתווספות למאגר 1 מיליליטר תאי דם אדום תמוגה (160 4 Cl mM NH, 100 המ"מ 3 KHCO, 0.01 mM EDTA) וטופחו במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. לשטוף את התאים בחיץ תמוגה, 5 דקות ב1200 סל"ד, וחזור במידת צורך.
  9. צנטריפוגה תאים כמו ב3.8 ולשטוף בPBS בתוספת 3% עגל בסרום עוברי (FACS-PBS).
  10. הסרת supernatant וכדורים מחדש להשעות ב100 μl FACS-PBS.
  11. הוסף נוגדנים כדי להעריך ריאורגניזציה ימפוציטים האנושית. אנחנו בדרך כלל כוללים CD45 הבא (סמן הלימפוציטים אנושי), CD8, CD4, CD14 וCD16 למקרופאגים ומונוציטים, CD19 לתאי B וCD56 לתאי NK.
  12. לדגור על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  13. שטוף כמו בשלב 3.9 ומחדש תאים להשעות בparaformaldehyde 2% לניתוח FACS.
  14. אם עכברים מחדש, אנחנו ממשיכים עם זריקות סרטניות. רמות כינונה מחדש של לימפוציטים אדם להשתנות, פחות מ 1% עד 40% מכלל תאי דם. הרמות והסוגים של lymphocשושלות yte ניתן להשוות למה שניתן הייתה לצפות מתורמי דם בריאים אדם. עם זאת, מצפה תנודות במספר שושלות תאים הלא טי. אם המספרים אינם מקובלים במסגרת זמן 12-השבוע אתה יכול לחזור על תהליך ההשתלה המשנית של שלב 3.1.
  15. שורות תאי גידול מתורבתות בהתאם להמלצות יצרן או מעבדה. תאים נקצרים, שטפו וresuspended בmatrigel ב1:1 (50 μl cells/50 matrigel μl). דגימות נשמרות על קרח בכל העת.
  16. עכברים הם מורדמים וגלחו באזור ההזרקה. האזור מעוקר באמצעות משטח isopropanol. A השעיות סלולריות helper עומסים בטרום מקוררת 23 ז 1 מיליליטר מזרקים. תאים סרטניים מוזרקים מתחת לעור. טיפול במקום הזרקה במשחה אנטיביוטית. גידולים צריכים להקים ולהתחיל לצמוח ב4 שבועות.

ב 'בחי טומוגרפיה פוזיטרונים (PET)

למחקרים שלנו בחינהספיגת הגלוקוז ine ([18 F]-fluorodeoxyglucose ([18 F] FDG) וכך העכברים הם צמו 4-6 שעות לפני ההדמיה. סריקות MicroPET / CT נעשים באמצעות microPET Inveon הסורק (פתרוני סימנס Preclinical) וMicroCATII CT הסורק ( PreclinicalSolutions סימנס). ניתוח תמונה נעשה שימוש בתוכנת OsiriX (Pixmeo, שוויץ). המטרה היא למדוד את הפעילות המטבולית של הגידול וסופו של דבר לשימוש בבדיקת PET כחלופה למדידת נסיגת גידול פיזי. כפי שניתן לראות בתרשים 2, נתקל בגידולים שמבוססים על מראה וגודל פיסיים אינם ממוקד אך בבדיקת PET חייה חשפה נימק רקמות נרחבת. מתודולוגיה זו יכולה לשמש כמדד רגיש ומדויק יותר של נסיגת גידול.

  1. לייעד חדר אחד להרדמה (isofluorane 2%) את העכברים, וחדר אחד כספיגת 60 דקות של FDG PET לפני הסריקה ("מחכה קאמרי"). הנח כריות כחולות בשני בתים.
  2. כחי anesthetized מעל תקופות ארוכות, הם צריכים להיות כל זמן חם של 30 ° C באמצעות השימוש בכפפות מלאות מים שחוממו במיקרוגל והצבת הכלובים ברפידות חום.
  3. הפעל את זרימת isoflurane לחדר הזה הלאה. אפשר isoflurane מנת למלא את התא המאלחש לכ 5-10 דקות לפני ששם את כל עכברים לבית הבליעה. ודא את המכסה נעול וסגור היטב כדי למנוע דליפת isoflurane.
  4. הנח את העכבר הראשון לבית הבליעה המאלחש ולנעול את המכסה בחוזקה. אפשר דקות או עד 5-10 העכבר הוא מחוסר הכרה.
  5. הסר את העכבר מהתא המאלחש, תווית הזנב של העכבר (צבע שונה לכלוב) ולהזריק intraperitoneally העכבר עם [18 F] FDG (80 μCi). שים לב לזמן העכבר הוזרק. העכבר יהיה מורדם שוב 50 דקות מtimepoint זה, המאפשר 10 דקות כדי להגדיר לסריקת PET (לסך של 60 דקות [18 F] ספיגת FDG לפני סריקת PET).
  6. הנח את העכבר שהוזרק לתא ההמתנה, ומאפשר [18 F] ספיגת FDG ל1 שעה לפני סריקת PET. אל תנעל את המכסה. להשאיר את המכסה רופף כדי לאפשר זרימת אוויר.
  7. מייד למקם את העכבר הבא להזרקת FDG לתוך תא ההרדמה. זריקות עכברים הבאות צריכות להיות מחולקות 10 דקות זו מזו, משום שהתהליך של סריקת PET הוא 10 דקות. מייד לאחר אחת עכבר נסרק, ספיגת 60 דקות FDG לעכבר הבא לסריקה תהיה מוכנה בדיוק 10 דקות זה מזה.
  8. המשך הרדמה והזרקת עכברים כאמורים בצעדים 7-9.
  9. לאחר 50 דקות מהזרקת timepoint העכבר הראשון, הנח את העכבר המוזרק הראשון לבית הבליעה המאלחש שוב (ועדיין ממשיך להרדים ולהזריק עכברים).
  10. חבר את מיטת העכבר לחמצן וקווי isoflurane, ולהפוך את זרימת isoflurane במיטה. הנח כרית כחולה על המיטה.
  11. הנח את העכבר המוכן לסריקת PET על המיטה, מותח את הזרועות ורגליים ומחזיק בתפקיד זה בקלטת. הנח סיכה מעל העיניים. שלב זה הוא קריטי ביותר מאז מיצובו של בעל החיים יכול להשפיע על איכות ההדמיה שלך.
  12. ניתק את קווי isoflurane וחמצן, ולעלות למיטה במהירות במכונת סריקת PET. מניח את קווי isoflurane וחמצן. ודא את זרימת isoflurane היא על מכונת סריקת PET. חבר את כבל סריקת PET ולהתחיל בסריקה.
  13. לאחר סריקת PET היא מלאה ולאחר מכן להעביר את בעל החיים לסורק CT. בעקבות סריקה זו להעביר את בעל חיים לכלוב השייך לו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

תרשים זרימה של תהליך ההשתלה מוצג באיור 1 א. תמונה של שתלך / ליב מוצגת בתרשים 1B. הרקמה הרתי מתפתחת בדרך כלל ויש לו הפצה פיזיולוגית של אדם וCD4 CD8 תאי T. בעקבות כינון מחדש, החיות לשאת מערכת חיסון אנושית עם התפלגות נורמלית של CD4, CD8 תאי T ושושלות תאים אחרות של מערכת חיסון.

הפער בין גודל גידול ורקמת חיה מוצג באיור 2. בעוד בדיקת CT (אזור האפור) ציינה את צמיחת גידול גדולה, in vivo הדמית PET הראה כי זה היה בעיקר נימקים וצלקת רקמות (איור 2). זה מדגיש את התועלת של בדיקת PET כדרך רגישה ומדויקת יותר על מנת להעריך נסיגה ופינוי גידול.

איור 1 איור 1. () תרשים סכמטי על מודל BLT השונה המשמש במחקרים אלה עבור הדור של עכברים שנשאו chimeric מארט-1 תאי T ספציפיים. שתל Thy / ליב שוחזר מtransduced ולא transduced CD34 תאים מבודדים מכבד עוברי עצמי. שבריר של תאי transduced קפוא והזריק לעכברים המוקרנים כעבור 4-6 שבועות. (ב) נציג תמונה של שתלך / ליב בעכברי. השתלים יש רקמות הפצה פיזיולוגית וCD4/CD8 יחסים כפי שמוצג על ידי IHC ודמויות cytometry זרימה. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2
איור 2. תמונת PET CT ושל עכבר נושא גידול מלנומה.אזור האפור מציין את הגודל פיזי של גידול בזמן הצבע האדום מציין פעילות המטבולית של הגידול, שהוא מאוד מוגבל.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המודל השונה BLT אנושי העכבר בשילוב עם in vivo PET ההדמיה הם כלים רבים עצמה כדי לחקור מחלות אנושיות כרוניות. מערכת זו לוקחת את מודל עכבר BLT והתקדמותה אל מעבר להיקף המוגבל למחקר איידס. בנוסף, מדובר במערכת גדולה שבה אנו יכולים לבחון פרוטוקולים שונים ריפוי גנטיים, כמו גם טכניקות אבחון לפני שהם יכולים להגיע להגדרה הקלינית. האחרון בשילוב עם העלות הנמוכה של שימוש בעכברים לעומת קופים הופך מודל זה מאוד שימושי.

טכנולוגיית הדמית PET אפשרה לנו להעריך את היעילות של הגישה שלנו. אם הסתמכתי באופן בלעדי על מדידות פיסיות של הגידול, הייתי להמעיט בעוצמת תגובת antitumor שנוצרה על ידי תאי T המהונדסים שלנו. צלקות נרחבות ורקמות נמקית נתנו את המראה של גידול גדול, אשר במציאות היה רקמה מתה.

לסיכום, השירות של modified BLT העכבר מ 'אודל ניתן להרחיב למודלים למחלות אחרים. בעוד כמה חסרונות עדיין מתעקשים כגון תוחלת חיים הקצרה של עכברים, זה יכול להיות כלי מאוד חזק לin vivo להעריך היבטים רבים של חסינות אדם, מבחן ולפתח התערבויות טיפוליות חדשניות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לאלווין וולש ולארי פאנג לסיוע הטכני שלהם. עבודה זו מומנה בחלקו על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) בפרס P50 CA086306, קליפורניה המכון לרפואת הרגנרציה (CIRM) מענקי RC1-00149-1 וRS1-00203-1; פקולטת הפרס החדש CIRM RN2-00902-1 , מרכז קלטק-UCLA המשותף לTranslational רפואה, אוניברסיטת קליפורניה במרכז לחקר מחלת איידס (CFAR) NIH / NIAID AI028697, אוניברסיטת UCLA איידס המכון, כלי CIRM ופרס הטכנולוגיה RT1-01126, ותכנית מחקר Multicampus UC והיוזמות מקליפורניה מרכז לגילוי תרופות אנטי (המספר MRPI-143226).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Invitrogen 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove's 12440061
Fetal Calf Serum 16000085
Collagenase type IV Sigma Aldrich C5138
Hyaluronidase H3506
DNAse I Roche Diagnostics 10104159001
Piptazo (Zosyn) Pfizer Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus) Ge Healthcare Life Sciences 17-1440-02
MACS Buffer Miltenyi Biotech See comments MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit 130-046-702
LS Columns 130-042-401
Retronectin Takara T100A
Matrigel BD Biosciences 354263
Isofluorane Baxter http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl) Pfizer Animal Health https://www.rimadyl.com/default.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
  3. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
  4. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  5. Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
  6. Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
  7. Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  8. V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
  9. Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).

Tags

סרטן ביולוגיה גיליון 70 ביולוגיה של תאי גזע אימונולוגיה הנדסה ביו רפואית רפואה Bioengineering גנטיקה אונקולוגיה עכברי השתלת תאי גזע תאי גזע, תאי T סרטן מודל חיה
שימוש בעכבר האנושי של BLT כמודל לתאי גזע מבוסס Gene Therapy גידול
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, … More

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, S. G., Levin, B., Liu, W., Radu, C. G., Kitchen, S. G., Zack, J. A. Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model. J. Vis. Exp. (70), e4181, doi:10.3791/4181 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter