Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica

Summary

La generazione e la caratterizzazione di cellule T specifiche tumorali usando topi umanizzati è descritto qui. Umana tessuto timico e geneticamente modificate cellule staminali ematopoietiche vengono trapiantate in topi immunocompromessi. Ciò comporta la ricostituzione di un ingegnerizzato sistema immunitario umano consentendo in esame vivo delle risposte immunitarie anti-tumorali.

Abstract

Modelli animali di piccola taglia come i topi sono stati ampiamente utilizzati per studiare le malattie umane e per sviluppare nuovi interventi terapeutici. Nonostante la ricchezza di informazioni ottenute da questi studi, le caratteristiche uniche di immunità mouse nonché la specificità di specie di malattie virali come il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) ha portato allo sviluppo di modelli murini umanizzati. I modelli precedenti ha comportato l'utilizzo di C. B 17 scid / scid topo e il trapianto di timo fetale umano e nel fegato fetale chiamati tua / liv (SCID-hu) ^{1, 2} o il trasferimento adottivo di umani leucociti del sangue periferico (SCID-huPBL ) ^3. Entrambi i modelli sono stati utilizzati principalmente per lo studio dell'infezione da HIV.

Uno dei limiti principali di entrambi questi modelli era la mancanza di ricostituzione stabile di cellule immunitarie nella periferia di renderli un modello più fisiologicamente rilevante per studiare la malattia da HIV. A tal fine, il ronzio BLTmodello murino anized è stato sviluppato. BLT è l'acronimo di midollo osseo / fegato / timo. In questo modello, da 6 a 8 settimane di età NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) topi immunocompromessi ricevere il tuo / liv impianto come nella SCID-hu modello di topo solo per essere seguita da un secondo trapianto di cellule staminali ematopoietiche umane ^4. Il vantaggio di questo sistema è la piena ricostituzione del sistema immunitario umano in periferia. Questo modello è stato utilizzato per studiare l'infezione da HIV e latenza ^5-8.

Abbiamo generato una versione modificata di questo modello, in cui usiamo geneticamente modificato cellule staminali ematopoietiche (HHSC) per costruire la tua / liv impianto seguita da iniezione di trasdotte autologo HHSC ^{7, 9.} Questo approccio si traduce nella generazione di lignaggi geneticamente modificati. Ancora più importante, abbiamo adattato questo sistema per esaminare il potenziale di generare funzionali cellule T citotossici (CTL) che esprime uno specifico recettore di cellula T melanoma. Utilizzando questo modello siamo stati in grado di valutare la funzionalità del nostro CTL transgenico vivo utilizzando la tomografia ad emissione di positroni (PET) per determinare regressione tumorale (9).

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere il processo di generazione di questi topi transgenici e di valutare l'efficacia in vivo utilizzando l'imaging dal vivo PET. Come nota, dato che usiamo tessuti umani e vettori lentivirali, i nostri impianti sono conformi alle linee guida CDC NIH per livello di biosicurezza 2 (BSL2) con precauzioni speciali (BSL2 +). Inoltre, i topi del GFN sono gravemente immunocompromessi in tal modo, la loro custodia e la manutenzione devono essere conformi ai più elevati standard di salute ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Generazione di topi BLT

La generazione di topi BLT è diviso in tre (3) parti: (1) di trattamento di tessuto fetale e la preparazione di cellule CD34 staminali ematopoietiche, (2) i trapianti di tessuto umano, e (3) trapianto secondario. Per tutti i protocolli, abbiamo fornito Tabella 1 con informazioni reagente.

1. Tissue Processing e l'isolamento di CD34 cellule staminali ematopoietiche

Fresco tessuto fetale o tessuto PREZZO sul ghiaccio da varie agenzie di approvvigionamento di organi può essere utilizzato. Spesso tessuto fetale non è sterile, come dimostra la produzione di 1000 colonie batteriche su agar sangue per millilitro di mezzo circostante. Abbiamo regolarmente lavare il tessuto due volte in 40 ml di PBS sterile. Anche se questo non elimina tutti i batteri, può fare la differenza tra una serie trapianto di successo e un risultato in cui la maggior parte dei topi riceventi soccombono batterica inperfezione. Come passaggio aggiunto, per disinfettare ulteriormente il tessuto, abbiamo coltura sospensione di cellule in presenza di antibiotici.

1,1 Elaborazione di tessuto timico fetale

1. Lavare timo versando fuori il mezzo in un bicchiere di candeggina e l'utilizzo di bisturi per evitare che il tessuto di scivolare nella candeggina. Riempire il tubo con PBS. Chiudere e capovolgere un paio di volte per lavare il timo. Decantare il surnatante in candeggina. Ripeti.
2. Posizionare il tessuto del timo in 8 ml di RPMI + 10% siero fetale bovino in un piatto di 60 mm e taglio in 1,5-2 mm con due pezzi bisturi. Tranciatura con bisturi riduce al minimo strappo e danneggiare i frammenti di tessuti. Tessuto danneggiato tende a diventare gonfio, appiccicoso e difficile da tracciare in ago di impianto. Il numero di bit ottenuta è il primo limite superiore su topi trapiantabili.
3. Trasferire i bit sospese con una pipetta 25 ml (per ridurre al minimo i danni ai tessuti) in una beuta T25. Aggiungere 70 ml di piptazo (Zosyn) a pallone e cultura durante la notte, 2. Questo riduce notevolmente batteri contaminanti. Se si desidera fare la tipizzazione tissutale o di qualsiasi altro test fenotipizzazione, estrarre 1 ml di cellule.

1,2 lavorazione di tessuto epatico fetale

1. Lavare il fegato come al punto 1.1.1.
2. Aggiungere 10 ml di tutto a medio e decantare Iscove in una piastra di Petri 100 mm.
3. Con due bisturi, tagliare a dadini il fegato in piccoli (~ 3 mm) pezzi. Se si esegue in bianco tessuto connettivo, raschiare il fegato da esso e gettarlo nella candeggina.
4. Omogeneizzare il tessuto da succhiare in una siringa da 12 ml dotato di un ago calibro 16 blunt 3 o 4 volte e trasferimento in un tubo da 50 ml.
5. Preparare gli enzimi di digestione tessutale come segue: A 10 ml di Iscove in una provetta da 50 ml, aggiungere 200 microlitri di ciascun: collagenasi di tipo IV (1 mg / ml), ialuronidasi (1 mg / ml), DNasi I (2 U / ml).
6. Disegnare gli enzimi in una siringa da 12 ml e in forma con un filtro di 0,22 μ. Filtrare la enzyme / medie direttamente nella sospensione cellulare.
7. Tappare e sigillare le cellule con Parafilm. Ruotare a 37 ° C per 90 min.
8. Impostare un tubo da 50 ml con un filtro 100 μ cella. Pipettare cella digerire attraverso questo filtro.
9. Aggiungere PBS alle cellule per portare il volume a 50 ml. Dividere questo in due provette da 25 ml.
10. Sfondo delle cellule con 10 ml di Ficoll. Centrifuga a 2400 rpm per 20 minuti senza freno.
11. L'interfaccia dovrebbe essere di spessore. Succhiare con una pipetta da 5 ml e trasferimento ad un altro tubo. Si dovrebbe avere due tubi di interfaccia. Aggiungere 50 ml di soluzione salina in ogni e centrifuga a 1200 rpm per 10 min.
12. Combinare pellets in una provetta e lavare ancora tre volte con PBS contenente 2% di FCS.
13. Infine sospensione in 50 ml di RPMI + 10% FCS e cellule di conteggio con Trypan Blue. A seconda delle dimensioni del tessuto, è possibile ottenere da ¹⁰ Agosto-10 Settembre epatociti totale.
14. Trasferire le cellule in una beuta T150 e aggiungere 30 ml di RPMI + 10% FCS e 0,8 ml di piptazo.
15. Incubare per 1 a 1,5 ore a 37 ° C per rimuovere le cellule aderenti.

1,3 Ordinamento e trasduzione di cellule staminali emopoietiche CD34

1. Dopo il fissaggio delle cellule in fase 1.2.15, agitare il pallone avanti e indietro delicatamente per un minuto per staccare le cellule sciolti. Ci sarà un sacco di fibroblasti e bloccato tale superficie.
2. Contare nuovamente utilizzando una diluizione 1-20 e registrare il numero totale di cellule. Risparmiare pochi decimi di un ml per dopo colorazione. Si dovrebbe avere circa 30% di cellule meno dei tuoi conta delle cellule iniziali (punto 1.2.13).
3. Spin down e lavare due volte con 40 ml di tampone MACS.
4. Cellule CD34 vengono ordinati utilizzando Miltenyi Biotech CD34 Kit diretta. Seguiamo esattamente il protocollo del produttore utilizzando le colonne LS forniti dalla società stessa.
5. Cellule recuperate saranno in 5 ml. Contare e calcolare cellule totali. Il rendimento delle cellule CD34 + dovrebbe essere 3-5% dei tuoi conta cellulare totale. Questo varia con °dell'età e del fegato fetale. Giovani fegati fetali tendono a dare una maggiore resa di cellule CD34 +.
6. Dividere il numero di celle da 1x10 ^6. Questo dà il secondo limite superiore su topi trapiantabili.
7. Contare il CD34-frazione (flusso attraverso e lavaggi) e riserva 6 x 10 ⁶ per il mouse da trapiantare. Coltura queste cellule durante la notte in 50 a 80 ml di RPMI + 10% di siero di vitello fetale + 1% piptazo.
8. Trasdurre le cellule CD34 + durante la notte con il vettore lentivirale. Usiamo retronectin da Takara seguendo esattamente le istruzioni del produttore.
9. Il giorno dopo, raccogliere le cellule CD34-, le trasfettate cellule CD34 + e conteggio.
10. Dividere le cellule CD34 + a metà: parte A e parte B.
11. Spin down Parte A cellule CD34 + trasdotte e sospendere in 4-6 ml di terreno di congelamento (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterile filtrato). Mettere aliquote da 1 ml in fiale congelamento e l'etichetta con "huFetalCD34", il numero di cellule nel flacone, la data e le iniziali.
12. Per ogni topo miscelare 0.5x10 ⁶ Parte B CD34 + trasdotte cellule e 4.5x10 ⁶ CD34-cellule in un contenitore sterile con tappo a vite provetta per microcentrifuga, pellet e tenere in ghiaccio. Scongelare anche un tubo di Matrigel (BD Biosciences) su ghiaccio. Tutti questi tubi devono essere mantenuti in ghiaccio fino al momento (vai al punto 2.10).

2. Trapianto di tessuti

L'obiettivo di questa fase è quello di trapiantare un timo umano fetale / organoid fegato sotto la capsula NSG rene di topo. Questo organoid imita meglio il processo di selezione di cella T umane e processi di maturazione come le cellule staminali ematopoietiche utilizzerà il timo umano e non il topo come sito per la differenziazione di cellule T e di altri diversi lignaggi linfoidi. L'uso di cellule CD34-nel processo di trapianto è di rigenerare il fegato fetale stroma e consentendo una migliore trapianto e crescita dell'impianto. L'età dei topi utilizzati NSG è di 6-8 settimane.

1. Preparazione di farmaci per surgery:
   1. Isoflurano: Arrotolare un tampone di garza da 2 pollici e roba in un tubo da 15 ml tappo a vite centrifuga. Versare circa 1 ml di isoflurano direttamente dalla bottiglia.
   2. Ketamina / zylazine: Aggiungere 0,52 ml di ketamina (Ketaset) (100 mg / ml) e 0,52 ml di xilazina (Anased) (100 mg / ml) in una fiala 20 ml di soluzione iniettabile. Etichetta con la data di scadenza del primo componente di scadenza e tenere congelato a -20 ° C fino al momento dell'uso.
   3. Carprofen (Rimadyl). Diluire la prima di un intervento chirurgico. Diluire 1:100 ritirando 0,1 o 0,2 ml dal flaconcino con una siringa da 1 ml e un ago 25G. Iniettare in un 10 o 20 ml di soluzione iniettabile. Etichetta e la data. Conservare in frigorifero per un giorno solo. Carica in 3 ml siringhe con aghi 25G.
2. Impostare la tabella per interventi chirurgici. Coprire con tamponi sterili blu, e un asciugamano sterile per ogni chirurgo. Ogni chirurgo ottiene da loro scatola di strumenti sterilizzati: 4 "forbici, pinze curve smussate, hanno bisognole-naso pinze, hemostat, 16G trochar smussati, e clip di applicatore della ferita. Inoltre, hanno bisogno di una curva-ago di sutura Vicryl, una pila di isopropanolo pulire pacchetti, un piatto 35 millimetri Petri di PBS, e una siringa da 1 ml riempita con PBS.
3. Situato nel centro del tavolo un vaso di vetro Coplin con 2 cm di Betadine e 2 tamponi di cotone. Versare i bit timo in piastre da 60 mm Petri.
4. L'anestesia viene eseguita su una tabella separata o in una cappa sterile coperto con pastiglie blu. Impostare due rack per piccoli gruppi e una bilancia elettronica con una coppa per tenere i topi. Utilizzare un rack per contenere 0,5 ml siringhe da insulina 28G X carichi di ketamina / xilazina e l'altro di tenere le siringhe da 3 ml di carprofen. Anche spostare il contenitore dei rifiuti a rischio biologico nei pressi di tenere il pelo rasato.
5. Pesare tutti i topi (6-8 settimane di età) in una gabbia per ottenere il peso medio e siringhe carico con una dose di 15 microlitri / g di ketamina / xilazina. Iniettare tutti i topi nella gabbia.
6. Dopo i topi risultare lento radersi la leflato t da fianco a spalla tra il centro della schiena e la pancia con un clipper Oster con lama n ° 40. Registrare il loro peso, e pugni le orecchie per la numerazione.
7. Iniettare 0,3 ml per via sottocutanea carprofen sopra la spalla.
8. Controllare il livello di anestesia del mouse schiacciando un zampa. Se i indietreggia del mouse, amministrare isoflurano da un tubo per circa 12 sec. Quindi provare la stretta zampa di nuovo. Continua a dare colpi brevi isoflurano fino a quando il riflesso scompare zampa. Appoggiare il mouse sul lato destro rivolto verso sinistra.
9. A 16-gauge impianto cancro, con la punta tonda depositato viene utilizzato per inserire il tessuto. Sciacquare il trocar un paio di volte nel piatto di PBS. Tenendolo orizzontale con l'asta appena dentro la punta. Aggiungere un pezzo di timo con le pinze ad ago e succhiarlo trovi
10. Un aiutante aggiunge 5 ml di Matrigel freddo per un tubo di cellule (fase 1.3.12) con un positivo spostamento pipetta Eppendorf, e si mescola con leggera agitazione. Il chirurgo holds il trocar in orizzontale e tira l'asta indietro lentamente, come l'assistente pipette il mix Matrigel nel trocar. Il mix gel a temperatura ambiente.
11. Tampone sulla pelle nuda con Betadine. Quindi asciugare questa via con un panno isopropanolo. Ripeti.
12. Individuare la milza sotto la pelle. E 'il più scuro posto. Rene del topo è situato circa 5 mm dorsale alla milza, che può essere visto attraverso la pelle rasata.
13. Raccogliete la pelle sopra questo punto con le pinze smussate e fare un taglio parallelo al milza circa 15 mm di lunghezza. Effettuare un taglio simile nello strato muscolare peritoneo sottostante. Nei maschi, il rene dovrebbe essere direttamente visibili e devi semplicemente schiacciare l'addome per farla fuoriuscire. Nelle femmine, potrebbe essere necessario prendere l'ovaio con la pinza emostatica e trascinare fuori il rene. Questo può contribuire a mantenere il rene fuori del corpo. Per i maschi, si dovrà mantenere un po 'di pressione sul ventre con la mano sinistra per mantenere il rene esposto.
14. Pluck un piccolo buco nel posteror estremità della capsula renale. Può sanguinare leggermente.
15. Far scorrere il trochar nel foro e lungo il rene fino all'orifizio del trochar è completamente coperto dalla capsula renale. Poi, usando il mignolo della mano destra, iniettare il tessuto.
16. Spingere il rene indietro delicatamente con la pinza emostatica chiuso. Mettere un punto nel peritoneo legato con un know doppio. Stringere la pelle come una borsa e mettere in due clip ferita.
17. Mettere una goccia di PBS in ogni occhio e gettare il mouse su un fianco sul letto gabbia. Assicurarsi che tutti i topi sono tornati, che sul ventre prima di lasciarli.
18. Il giorno dopo, dare a ciascuno il mouse un altro colpo di carprofen.

3. Secondaria trapianto

L'obiettivo di questa fase nella generazione di topi BLT è quello di popolare il midollo osseo smorfia con cellule staminali ematopoietiche. L'impianto trapiantato dalla procedura (2) non è sufficiente a sostenere la piena ricostituzione del secoloe sistema immunitario umano in questi topi. Durante il trapianto secondaria, abbiamo sub-letale irradiare i topi per esaurire murine cellule del midollo osseo generando "spazio" per l'impianto delle cellule CD34 + umane.

1. Da quattro a sei settimane dopo irradiano i topi con 2,7 Gy. I topi vengono iniettate lo stesso giorno con Parte A cellule CD34 + trasdotte. Il calendario si basa sulla creazione e la crescita della tua / liv impianto trapiantato al punto 2. In genere, in questo periodo l'impianto è cresciuta in modo significativo che ci permette di procedere con i passaggi successivi.
2. Scongelare la parte A di cellule CD34 + trasdotte, lavare e sospendere in mezzo ad una concentrazione di 5x10 ⁶ / ml.
3. Caricare 0,5 ml siringhe da insulina 28G X con 0,1 ml di cellule (10 da ⁵ a 5x10 ⁵ cellule per 0,1 ml per topo) per una gabbia di topi (ogni gabbia contiene un massimo di 5 topi) e stenderli su una griglia nella direzione opposta.
4. Anestetizzare un mouse con un tubo da isoflurano scruffing e trattenendo ilnaso nei tubi per circa 20 sec. Contare per tenere traccia del tempo.
5. Poi faccia a destra, e tirare la pelle intorno al collo stretto con il pollice e l'indice della mano sinistra. Premere sotto la sua mascella con il finder terzo modo che il suo occhio destro sporge. Tenendo la siringa parallela all'asse lungo della testa del mouse, scivolare l'ago dietro l'occhio e farlo scorrere delicatamente finché non si ferma. Non premere ulteriormente, ma iniettare il carico per circa 2 sec.
6. Due o tre mesi dopo i topi sono dissanguati retroorbitally uso di pipette in vetro rivestito EDTA. Si può solo prendere un massimo di 200 ml di sangue al mese per il mouse. 50-100 ml di sangue dovrebbe essere sufficiente per l'analisi FACS. Strategie alternative includono sanguinamento sanguinamento delle vene del viso e sanguina vena della coda. Quest'ultimo darà volumi molto piccoli di sangue che può non essere sufficiente per saggi multipli.
7. Campioni di sangue vengono colorate per l'espressione del marcatore CD45 umano linfociti per valutare la ricostituzione. BLood campioni vengono aggiunti in 1 ml di tampone di lisi cellulare rosso sangue (160 mM NH ₄ Cl, 100 mM KHCO _3, 0,01 mM EDTA) e incubate per 5 min a temperatura ambiente.
8. Lavare le cellule in tampone di lisi, 5 min a 1.200 giri al minuto, e ripetere se necessario.
9. Centrifugare cellule come in 3,8 e lavare in PBS integrato con il 3% di siero fetale bovino (FACS-PBS).
10. Rimuovere il surnatante e risospendere pellet in 100 ul FACS-PBS.
11. Aggiungere anticorpi per valutare umana ricostituzione dei linfociti. Abbiamo tipicamente includono CD45 (marcatore linfocita umano), CD8, CD4, CD14 e CD16 per macrofagi e monociti, CD19 per cellule B e cellule NK CD56 per.
12. Incubare a 4 ° C per 30 min.
13. Lavare come nella fase 3,9 e risospendere le cellule in paraformaldeide al 2% per analisi FACS.
14. Se i topi sono ricostituiti, si procede con iniezioni tumorali. Livelli di ricostituzione dei linfociti umani variano da meno di 1% al 40% di cellule del sangue totale. I livelli e tipi di lymphoclignaggi YTE sono paragonabili a ciò che ci si aspetterebbe da sani donatori di sangue umano. Tuttavia, si aspettano le fluttuazioni del numero di non-T linee cellulari. Se i numeri non sono accettabili entro le 12 settimane di tempo che hai potrebbe ripetere la procedura di trapianto secondario dal punto 3.1.
15. Linee cellulari tumorali sono coltivate secondo il fornitore o raccomandazioni di laboratorio. Le cellule sono raccolte, lavate e risospese in matrigel con un rapporto 1:1 (50 microlitri cells/50 microlitri Matrigel). Campioni vengono conservati su ghiaccio in ogni momento.
16. I topi vengono anestetizzati e rasato la zona di iniezione. L'area è sterilizzato con un tampone isopropanolo. A sospensioni carichi di cellule di supporto in fase di pre raffreddato 23G siringhe da 1 ml. Le cellule tumorali vengono iniettate per via sottocutanea. Trattare il sito di iniezione con pomata antibiotica. I tumori dovrebbero stabilire e iniziare a crescere in 4 settimane.

B. In tomografia ad emissione di positroni vivo (PET)

Per i nostri studi abbiamo esameassorbimento di glucosio ine ^([18 F]-fluorodeossiglucosio ^([18 F] FDG), così i topi a digiuno 4-6 ore prima di imaging. MicroPET / CT scansioni vengono eseguite utilizzando la microPET Inveon scanner (Siemens Solutions preclinici) e MicroCATII CT scanner ( PreclinicalSolutions Siemens). L'analisi delle immagini viene eseguita utilizzando OsiriX (Pixmeo, Svizzera) software. L'obiettivo è quello di misurare l'attività metabolica del tumore e infine utilizzare imaging PET come alternativa fisicamente misurando regressione del tumore. Come si vede nella figura 2, abbiamo hanno riscontrato che i tumori basato su aspetto fisico e le dimensioni non sono mirati ma imaging PET vivo rivelato necrosi tissutale. Questa metodologia può servire come indicatore più sensibile e preciso di regressione del tumore.

1. Designare una camera per l'anestesia (2% isofluorano) i topi, e una camera come l'assorbimento di FDG 60 min prima scansione PET ("in attesa della camera"). Mettere pastiglie blu in entrambe le camere.
2. Poiché gli animali sono Anesthetized più lunghi periodi, devono essere tenuti al caldo a 30 ° C mediante l'uso di guanti riempiti con acqua che vengono riscaldati in un forno a microonde e posizionando le gabbie in pastiglie di calore.
3. Ruotare il flusso isoflurano per questa camera su. Lasciare che il isoflurano per riempire la camera anestetizzante per circa 5-10 minuti prima di effettuare qualsiasi topi nella camera. Accertarsi che il coperchio è bloccato e chiuso ermeticamente per evitare perdite isoflurano.
4. Posizionare il primo mouse nella camera di anestetizzante e bloccare il coperchio a tenuta. Consentire 5-10 minuti o fino a quando il mouse è inconscio.
5. Rimuovere il mouse dalla camera anestetizzante, etichetta la coda del topo (colore diverso per gabbia) e iniettare per via intraperitoneale il mouse con ^[18 F] FDG (80 uCi). Prendere nota del tempo è stato iniettato il mouse. Il mouse saranno anestetizzati ancora 50 min da questo timepoint, consentendo 10 minuti di istituire per la scansione PET (per il totale di 60 minuti ^[18 F] FDG prima della scansione PET).
6. Posizionare il mouse iniettato nella camera di attesa, consentendo ^[18 F] FDG per 1 ora prima della scansione PET. Non bloccare il coperchio. Lasciare il coperchio allentato per permettere la circolazione dell'aria.
7. Porre immediatamente il mouse per l'iniezione successiva FDG nella camera anestetizzante. Le successive iniezioni topi devono essere distanziate 10 minuti a parte, perché il processo di scansione PET è di 10 min. Subito dopo un mouse viene acquisito, il min 60 FDG per il mouse accanto a sottoporre a scansione sarà pronto esattamente 10 minuti di distanza.
8. Continua l'anestesia e l'iniezione i topi, come indicato ai punti 7-9.
9. Dopo 50 minuti dalla prima iniezione timepoint mouse, posizionare il primo mouse iniettato nella camera di anestetizzante nuovo (pur continuando ad anestetizzare e iniettare topi).
10. Collegare il letto del mouse per l'ossigeno e le linee isoflurano, e girare il flusso sul isoflurano per il letto. Inserire un disco blu sul letto.
11. Posizionare il mouse pronto per la scansione PET sul letto, allungando le braccia egambe e titolari di questa posizione con nastro adesivo. Posizionare lubrificante sopra gli occhi. Questa fase è la più importante in quanto il posizionamento dell'animale può influenzare la qualità della immagine.
12. Scollegare le linee di isoflurano e ossigeno, e rapidamente montare il letto sulla macchina scansione PET. Posizionare le linee di isoflurano e ossigeno. Assicurarsi che il flusso di isoflurano è per la macchina di scansione PET. Collegare il cavo di scansione PET e avviare la scansione.
13. Una volta che la scansione PET è completo quindi spostare l'animale allo scanner CT. A seguito di questa scansione spostare l'animale verso il rispettivo gabbia.

Representative Results

Un diagramma di flusso del processo di trapianto è mostrato nella Figura 1A. Una foto del tuo / liv impianto è mostrato in Figura 1B. Il tessuto timico sviluppa normalmente e ha una distribuzione fisiologica di CD4 umano e cellule T CD8. Dopo ricostituzione, gli animali portano un sistema immunitario umano con distribuzione normale di CD4, CD8 T e altre linee cellulari immunitarie.

La discrepanza tra dimensione del tumore e tessuto vivo è mostrato in Figura 2. Mentre la TAC (area grigia) indicata una grande crescita tumorale, in vivo hanno dimostrato che l'imaging PET era perlopiù necrotico e tessuto cicatriziale (Figura 2). Ciò sottolinea l'utilità della PET come un modo più sensibile e preciso per valutare la regressione del tumore e di liquidazione.

Figura 1. (A) Un diagramma schematico del modello BLT modificato utilizzato in questi studi per la generazione di topi chimerici trasportano MART-1 cellule T specifiche. Il tuo / Liv impianto è stato ricostruito da trasdotte e non trasdotte CD34 cellule isolate da un fegato fetale autologo. Una frazione delle cellule trasdotte è congelato e iniettato nei topi irradiati 4-6 settimane dopo. (B) Una immagine rappresentativa del tuo / liv impianto in topi umanizzati. Gli impianti hanno una distribuzione fisiologica dei tessuti e rapporti CD4/CD8 come dimostra l'IHC e figure di citometria a flusso. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Un'immagine PET e TC di un mouse portando un tumore melanoma. Ilarea grigia indica la dimensione fisica del tumore, mentre il colore rosso indica l'attività metabolica del tumore, che è molto limitata.

Discussion

La modifica modello di topo umanizzato BLT accoppiato con PET in vivo imaging sono potenti strumenti per studiare malattie croniche umane. Questo sistema prende il modello BLT del mouse e sposta in avanti di là della portata limitata per la ricerca sull'HIV. Inoltre, è un grande sistema in cui possiamo esaminare vari protocolli di terapia genica e le tecniche diagnostiche prima di poter raggiungere l'impostazione clinica. Quest'ultimo accoppiato con il basso costo di utilizzo di topi contro primati rende questo un modello molto utile.

La tecnologia di imaging PET ci ha permesso di valutare l'efficacia del nostro approccio. Se ci siamo basati esclusivamente su misure fisiche del tumore, avremmo sottovalutato la potenza della risposta antitumorale generato dalle nostre cellule T transgeniche. La cicatrizzazione esteso e tessuto necrotico ha l'aspetto di un tumore, che in realtà è tessuto morto.

In conclusione, l'utilità del BLT modificata del mouse model può essere estesa ad altri modelli di malattia. Mentre alcuni svantaggi persistono come la più breve durata della vita dei topi, questo può essere un potente strumento per valutare in vivo molti aspetti di immunità umana, testare e sviluppare nuovi interventi terapeutici.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx