Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей

Published: December 18, 2012 doi: 10.3791/4181
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 4, 1,2,3, 1,2,5
1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

Поколения и характеристику опухоли специфические Т-клетки использованием гуманизированных мышей описано здесь. Человека тимуса ткани и генетически измененных человеческих гемопоэтических стволовых клеток пересаживают в ослабленным иммунитетом мышей. В результате восстановление инженерных человеческой иммунной системы, позволяющей в естественных экспертизы противоопухолевого иммунного ответа.

Protocol

А. Генерация BLT мышей

Поколения BLT мышей разделили на три (3) части: (1) обработка ткани плода и подготовке CD34 человека гемопоэтических стволовых клеток, (2) трансплантации человеческих тканей, и (3) вторичные пересадки. Для всех протоколов, мы представили таблицу 1 с реагентом информации.

1. Обработка тканей и выделение CD34 человека гемопоэтических стволовых клеток

Свежий эмбриональной ткани или ткани отправлены на ночь на лед с различными учреждениями закупок органа могут быть использованы. Часто ткани плода не является стерильной, о чем свидетельствует производства в 1000 бактериальных колоний на кровяном агаре на миллилитр окружающей среды. Мы регулярно мыть ткань дважды в 40 мл стерильной PBS. Хотя это и не удалить все бактерии, он может сделать разницу между успешной серии пересадки и результат, в котором большинство получателей мышей поддаются бактериальнойинфекции. В качестве дополнительного шага для дальнейшей дезинфекции тканей, мы культуре суспензии клеток в присутствии антибиотиков.

1,1 обработке тканей эмбрионального тимуса

  1. Вымойте тимуса при заливке от среднего в стакан отбеливателя и использования скальпеля, чтобы предотвратить ткань от сползания в отбеливатель. Пополнить трубы с PBS. Cap и инвертировать несколько раз, чтобы вымыть тимуса. Слейте супернатант в отбеливатель. Повторить.
  2. Поместить ткань тимуса в 8 мл RPMI + 10% эмбриональной телячьей сыворотки в 60-мм блюдо и сдвига в 1,5 до 2 мм части с двумя скальпелей. Стрижка с скальпели свести к минимуму разрыв и повреждение тканей бит. Поврежденная ткань имеет тенденцию отекают, липкая, и трудно сделать в имплантат иглы. Количество битов, получил первый верхний предел трансплантации мышам.
  3. Передача приостановлено биты с 25 мл пипеткой (для минимизации повреждения тканей) в колбе T25. Добавить 70 мкл piptazo (Zosyn) в колбу и культуры в одночасье, 2. Это значительно снижает загрязнение бактериями. Если вы хотите сделать тканевого типирования или любые другие анализы фенотипирование, вынуть 1 мл клеток.

1,2 Обработка эмбриональной ткани печени

  1. Промыть печень, как на стадии 1.1.1.
  2. Добавить 10 мл среды и переливать все Искова в 100 мм блюдо Петри.
  3. С двумя скальпели, нарезать кубиками печень на небольшие (~ 3 мм) штук. Если вы столкнетесь с белой соединительной тканью, очистить печень от него и выбросить его в отбеливатель.
  4. Однородный ткани, высасывая его в 12 мл шприца, снабженного 16 калибра тупой иглой 3 или 4 раза и передачи в 50 мл трубки.
  5. Подготовить ферменты для ткани пищеварения следующим образом: К 10 мл Искова в 50 мл трубки, добавить 200 мкл каждого: коллагеназы типа IV (1 мг / мл), гиалуронидазы (1 мг / мл), ДНК-аз I (2 U / мл).
  6. Ничья ферментов в 12 мл шприц и установите ее с 0,22 μ фильтр. Фильтр enzyмне / средний непосредственно в клеточной суспензии.
  7. Cap и запечатать ячейки с Parafilm. Поворот на 37 ° C в течение 90 мин.
  8. Настройка 50 мл трубки с 100 фильтр ячейки μ. Внесите клетки перевариваются через этот фильтр.
  9. Добавить PBS в клетки, чтобы довести объем до 50 мл. Разделите ее на две трубы по 25 мл.
  10. Легли в основу клеток с 10 мл Ficoll. Спиновые при 2400 оборотов в минуту в течение 20 минут без тормозов.
  11. Интерфейс должен быть толстым. Сосать его с 5 мл пипетки и перевод на другую трубку. Вы должны иметь две трубки интерфейс. Добавить 50 мл PBS друг и спина при 1200 оборотов в минуту в течение 10 мин.
  12. Комбинат гранул в одной пробирке и вымыть три раза с PBS, содержащим 2% FCS.
  13. Наконец приостановить в 50 мл RPMI + 10% FCS и количество клеток с использованием трипанового синего. В зависимости от размера ткани, вы можете получить от 10 8 до 10 9 общую гепатоцитов.
  14. Передача клетки T150 колбу и добавляют 30 мл RPMI + 10% FCS и 0,8 мл piptazo.
  15. Инкубируйте в течение от 1 до 1,5 ч при 37 ° С для удаления прилипших клеток.

1,3 сортировка и передачу CD34 гемопоэтических стволовых клеток

  1. После прикрепления клеток в пункте 1.2.15, агитировать фляжку мягко в течение минуты, чтобы выбить свободные клетки. Там будет много фибробластов и такие прилипли к поверхности.
  2. Граф снова, используя от 1 до 20 разведения и запишите общее количество клеток. Сохранить несколько десятых мл для последующего окрашивания. Вы должны иметь приблизительно на 30% меньше клеток от вашего первоначального количества клеток (шаг 1.2.13).
  3. Спином вниз и мыть два раза с 40 мл буфера MACS.
  4. CD34 клетки сортируются с использованием CD34 Miltenyi Biotech Прямые Kit. Мы точно следуют протоколу производителя, используя LS столбцам той же компании.
  5. Восстановленные клетки будут в 5 мл. Граф и рассчитать общую клеток. Ваш выход CD34 + клеток должно быть 3-5% от общего количества клеток. Это зависит йE Возраст плода печень. Младший плода печень как правило, дают более высокий выход клеток CD34 +.
  6. Разделите количество ячеек, 1x10 6. Это дает второй верхний предел трансплантации мышам.
  7. Граф CD34-фракции (поток через и моет) и резервный 6 х 10 6 на мышь для пересадки. Культуры этих клеток в течение ночи в 50 до 80 мл RPMI + 10% эмбриональной телячьей сыворотки + 1% piptazo.
  8. Трансдукции CD34 + клеток в течение ночи с лентивирусов вектор. Мы используем retronectin от Takara точно следуя инструкциям производителя.
  9. На следующий день, сбора урожая CD34-клеток, трансфецированных CD34 + клеток и кол.
  10. Сплит CD34 + клеток пополам: часть А и часть Б.
  11. Спином вниз Часть CD34 + клеток и трансдуцированных приостановить 4 до 6 мл замерзания среды (RPMI + 10% FCS + 10% ДМСО, 0,22 μ стерильной фильтрации). Поместите 1 мл аликвоты в замораживании флаконы и этикетки с "huFetalCD34", число клеток во флаконе, дату и свои инициалы.
  12. Для каждой мыши смешивать 0.5x10 6 Part B CD34 + клеток и трансдуцированных 4.5x10 6 CD34-клеток в стерильных завинчивающейся крышкой пробирке, гранул и держать на льду. Также таять трубки Matrigel (BD Biosciences) на льду. Все эти трубы должны быть на льду до использования (перейдите к шагу 2,10).

2. Трансплантации тканей

Цель этого шага заключается в пересадке человеческого плода тимуса / печень органоид под NSG капсулу почки мыши. Этот органоид лучше имитирует процесс человеческого Т-клеточного отбора и процессы созревания, как человеческий гемопоэтические стволовые клетки будут использовать человеческий тимус, а не мышь в качестве площадки для их дифференциации различных Т-клеток и других лимфоидных линий. Использование CD34-клеток в процессе трансплантации, чтобы повторно генерировать плода стромы печени и позволяет лучше трансплантации и рост имплантата. Возраст NSG мышей использовали составляет 6-8 недель.

  1. Подготовка препаратов для суrgery:
    1. Isoflurane: Сверните 2 дюйма марлевым тампоном и запихивать его в 15 мл центрифужные пробирки завинчивающейся крышкой. Залить примерно 1 мл изофлуран прямо из бутылки.
    2. Кетамин / zylazine: Добавить 0,52 мл кетамина (Ketaset) (100 мг / мл) и 0,52 мл ксилазина (Anased) (100 мг / мл) в 20 мл флаконе физиологического раствора для инъекций. Этикетка с даты истечения срока действия истекает ранних компонентов и сохранить замораживали при -20 ° C до необходимости.
    3. Carprofen (Римадил). Разбавить это как раз перед хирургической процедуры. Развести 1:100, выведя 0,1 или 0,2 мл из флакона с 1 мл шприца и иглы 25G. Вводите в 10 или 20 мл физиологического раствора для инъекций. Этикетка и дату. Хранить в холодильнике в течение одного дня. Нагрузка в 3 мл шприцы с иглами 25G.
  2. Настройка таблицы для операции. Накройте его стерильным синие колодки, и стерильные полотенца для каждого хирурга. Каждый хирург получает от своей коробке стерилизованные инструменты: 4 "ножницы, изогнутые тупой пинцет, нужноле-нос щипцы, кровоостанавливающего, 16G притупляются троакар, и аппликатор раны клип. Кроме того, они должны изогнутой иглой Викрил шва, стек изопропанола протрите пакетов, 35 мм чашки Петри ФСБ, а 1 мл шприц с PBS.
  3. Отель располагается в центре стола стеклянную банку с Коплин 2 см Бетадин и 2 ватных тампонов. Залить тимуса бит в 60 мм чашки Петри.
  4. Анестезия выполняется на отдельном столе или в капот покрытый стерильной синие колодки. Установить два небольших стойках и электронные весы с стакан держать мышей. Используйте одну стойку провести 0,5 мл X 28G шприцев инсулина загружается с кетамином / ксилазина и другие провести 3 мл шприцев карпрофена. Также переместить контейнер для биологически опасных отходов вблизи провести бритые меха.
  5. Взвешивание всех мышей (6-8 недель) в клетку, чтобы получить средний вес и нагрузку шприцы с дозы 15 мкл / г кетамина / ксилазина. Inject всех мышей в клетке.
  6. После того, как мыши становятся вялыми брить ЛЕФт стороне от бедра до плеча между центром спины и живота с Остер клипер с № 40 лезвие. Запишите свой вес, и пробить их уши для нумерации.
  7. Вводят 0,3 мл подкожно карпрофена через плечо.
  8. Проверьте уровень анестезии мыши, сжимая лапу. Если мышь вздрагивает, администрирование изофлуран из трубы около 12 сек. Тогда попробуйте лапу сжатие снова. Продолжайте давать короткие выстрелы изофлурана, пока лапой рефлекс исчезает. Положите мышь на правый бок, стоящих перед слева.
  9. 16-калибровочного рака имплантата иглы, с наконечником подал круглый используется для вставки тканей. Промойте троакар несколько раз в блюдо PBS. Проведение его в горизонтальном положении со штангой только внутри чаевых. Добавить кусок тимуса с острогубцы щипцы и сосать его дюйма
  10. Помощник добавляет 5 мкл холодного Matrigel к одной трубке клеток (шаг 1.3.12) с положительным пипетки Eppendorf перемещения, и смешивается при осторожном перемешивании. Хирург праздникиDS троакар по горизонтали и вытягивает стержень назад медленно, как помощник пипец Matrigel смеси в троакар. Смесь гели при комнатной температуре.
  11. Тампоном голой кожи с Бетадин. Затем протрите это прочь с изопропанол салфеткой. Повторить.
  12. Найдите селезенки под кожу. Это темное пятно. Почке мыши находится примерно в 5 мм от спины к селезенке, которые можно увидеть через побрился кожи.
  13. Возьмите кожу над этим местом с тупым пинцетом и сделать разрез параллельно селезенки около 15 мм длиной. Сделать подобный разрез в брюшной полости слоем мышц ниже. У мужчин, почки должны быть непосредственно видимыми и вы просто должны сжать живот, чтобы вытолкнуть его. У женщин, возможно, придется подобрать яичника с кровоостанавливающего и перетащить из почек. Это может помочь сохранить почку вне тела. Для мужчин, вы должны будете держать некоторое давление на живот левой рукой держать почки подвергаются.
  14. Мужество небольшое отверстие в posterioГ конце почечную капсулу. Это могут кровоточить немного.
  15. Установите троакар в это отверстие и вдоль почек до отверстия троакара полностью покрыта капсулой почки. Затем, используя мизинец правой руки, вводят в ткани.
  16. Нажмите на почки еще в нежно с закрытыми кровоостанавливающего. Положите один стежок в брюшине связан с двойным знают. Сожмите кожу вверх, как кошелек и положил в двух клипов раны.
  17. Поместите каплю PBS на каждый глаз и заложить мыши на его стороне на клетке постельные принадлежности. Убедитесь, что все мыши вернулись к укладке на брюхе, прежде чем покинуть их.
  18. На следующий день, дать каждой мыши еще один выстрел из карпрофена.

3. Вторичный трансплантации

Цель этого шага в поколение BLT мышей для заполнения Moue костного мозга с человеческим гемопоэтических стволовых клеток. Пересаженных имплантатов из процедуры (2) не является достаточным для полного восстановления йэлектронной иммунной системы человека в этих мышах. Во вторичной пересадки, мы югу от смертельно облучения мышей, чтобы исчерпать мышиных клеток костного мозга создавая таким образом «пространства» для имплантации человеческого CD34 + клеток.

  1. От четырех до шести недель облучения мышей с 2,7 Гр. Мышам вводили в тот же день с частью CD34 + клеток трансдуцированных. Сроки на основе создания и развития твоего / жилая имплантат трансплантировали в шаге 2. Как правило, в это время имплантаты значительно вырос позволяет нам перейти к следующему шагу.
  2. Оттаять Часть CD34 + клеток трансдуцированных, вымыть и приостановить в среде до концентрации 5х10 6 / мл.
  3. Загрузите 0,5 мл X 28G шприцев инсулина с 0,1 мл клеток (10 5 до 5х10 5 клеток на 0,1 мл на мышь) для одной клетки мышей (каждая клетка содержит максимум 5 мышей) и положите их на стойку, обращенной в сторону.
  4. Anesthetize мыши с изофлуран трубки scruffing его и проводит своюНос в трубах в течение примерно 20 сек. Граф следить за временем.
  5. Затем лицо его вправо, и потяните кожу на шее туго с большим и указательным пальцами левой руки. Нажмите под его челюсти с вашим третьим поиска так, что его правый глаз выпирает. Держа шприц параллельно длинной оси голова мыши, скольжение иглы позади глаз и сдвиньте ее мягко, пока он не остановится. Не нажимайте дальше, но вводить нагрузки в течение примерно 2 сек.
  6. Два или три месяца спустя мышей кровь retroorbitally использованием ЭДТА покрытием пипетки стекла. Вы можете взять с собой максимум 200 мкл крови в месяц за мышь. 50-100 мкл крови должны быть достаточными для анализа FACS. Альтернативные стратегии кровотечение включать лица кровоточит вены и кровоточит хвостовую вену. Последний даст вам очень малых объемов крови, что не может быть достаточным для нескольких анализов.
  7. Образцы крови окрашивали для выражения человеческих лимфоцитов маркер CD45 для оценки восстановления. Сиlood образцы добавляли в 1 мл эритроцитов лизис буфера (160 мМ NH 4 Cl, 100 мМ KHCO 3, 0,01 мМ EDTA) и выдерживают в течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Вымойте клетки в буфере для лизиса, 5 мин при 1200 оборотах в минуту, и повторите, если необходимо.
  9. Центрифуга клетки, в 3,8 и мыть в PBS дополнен с 3% эмбриональной телячьей сыворотки (FACS-PBS).
  10. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 100 мкл FACS-PBS.
  11. Добавить антител к оценке человеческих лимфоцитов восстановления. Мы обычно включают в себя следующие CD45 (человеческие лимфоциты маркер), CD8, CD4, CD14 и CD16 на макрофаги и моноциты, CD19 на В-клеток и CD56 для клеток NK.
  12. Инкубировать при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
  13. Вымойте, как в шаге 3,9 и повторно приостановить клеток в 2% параформальдегидом для анализа FACS.
  14. Если мыши восстанавливают, мы переходим с опухолью инъекций. Восстановление уровня лимфоцитов человека варьироваться от менее чем 1% до 40% от общего числа клеток крови. Уровней и типов lymphocyte линий сравнимы с тем, что можно было бы ожидать от здоровых доноров крови человека. Однако, не ожидал флуктуации числа не-T клеточных поколений. Если цифры не являются приемлемыми в рамках 12-недельного срока вы можете повторить процедуру вторичного трансплантата из шага 3.1.
  15. Линий опухолевых клеток культивируют в зависимости от производителя или лаборатории рекомендации. Клетки собирают, промывают и ресуспендируют в матригель в соотношении 1:1 (50 мкл cells/50 мкл матригель). Образцы хранятся на лед во все времена.
  16. Мыши наркозом и побрился в области инъекции. Область стерилизовать с использованием изопропанола площадку. Вспомогательные нагрузки клеточной суспензии в предварительно охлажденный 23G 1 мл шприца. Опухолевые клетки вводят подкожно. Лечение в месте инъекции с мазь с антибиотиком. Опухоли должны установить и начать расти в течение 4 недель.

B. В естественных условиях позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)

Для нашего исследования мы экзаменнеравенства потребления глюкозы ([18 F]-фтордезоксиглюкозы ([18 F] ФДГ), таким образом мышей постился 4-6 часа до обработки изображений. MicroPET / КТ сканирование осуществляется с помощью microPET Inveon сканера (Siemens Доклинические Solutions) и MicroCATII КТ сканера ( Siemens PreclinicalSolutions). Анализ изображения осуществляется с помощью OsiriX (Pixmeo, Швейцария) программного обеспечения. цель заключается в измерении метаболической активности опухолей и в конечном счете использования ПЭТ в качестве альтернативы физическому измерению регрессии опухоли. Как видно на рисунке 2, мы столкнулись с опухолями, которые основаны на внешний вид и размеры не являются целевыми, но живых изображений ПЭТ показало обширный некроз тканей. Эта методика может служить более чувствительным и точным индикатором регрессии опухоли.

  1. Назначить одну камеру для обезболивающие (2% isofluorane) мышей, и одна камера, как 60 мин поглощения FDG перед ПЭТ ("ожидание камеры"). Поместите синие колодки в обеих палатах.
  2. Как животные Anesthetized в течение длительного периода, они должны быть теплыми при температуре 30 ° C с использованием воды заполнен перчатки, которые нагревают в микроволновой печи и размещение клетки на тепло колодки.
  3. Поверните изофлуран потока для этой камеры на. Разрешить изофлурана для заполнения обезболивающим камеры в течение примерно 5-10 минут до размещения любого мышей в камеру. Убедитесь, что крышка закрыта, и плотно закрыты, чтобы избежать утечки изофлурана.
  4. Поместите первую мышь в обезболивающих камеры и зафиксировать крышку плотно. Разрешить 5-10 мин или пока мышь находится в бессознательном состоянии.
  5. Отключив мышь от обезболивающих камеры, метки хвоста мыши (разные цвета в клетку) и вводят внутрибрюшинно мыши с [18 F] ФДГ (80 мкКи). Обратите внимание на время мыши вводили. Мышь будет наркозом снова 50 мин с этого момента времени, что позволяет в течение 10 минут, чтобы настроить для ПЭТ (на общую сумму 60 мин [18 F] ФДГ поглощение до ПЭТ).
  6. Поместите вводили мыши в ожидании камеры, что позволяет [18 F] ФДГ поглощения в течение 1 часа, прежде чем ПЭТ. Не блокируйте крышку. Оставьте крышку, чтобы позволить свободный поток воздуха.
  7. Немедленно поместите следующий мышь для инъекций ФДГ в обезболивающих камеры. Последующие инъекции мышам должны быть расположены 10 минут друг от друга, потому что процесс ПЭТ составляет 10 мин. Сразу же после одного щелчка сканируется, 60 мин ФДГ поглощения на следующий мыши, которые будут проверяться будет готов ровно 10 минут друг от друга.
  8. Продолжить обезболивающее и потребителей инъекционных мышей, как указано в шагах 7-9.
  9. Через 50 минут от первой временной точке инъекции мыши, поместите первой инъекции мыши в обезболивающих камеру снова (в то время как все еще продолжается, чтобы обезболить и придать мыши).
  10. Подключите мышь кровать с кислородом и ИФ линии, и поверните поток на изофлурана для кровати. Поместите синюю подушку на кровати.
  11. Наведите готовы к ПЭТ на кровать, вытянув руки иноги и держа эту должность с лентой. Место смазки на глаза. Этот шаг является наиболее важным, так как позиционирование животных может повлиять на качество вашего изображения.
  12. Отключите изофлурана и кислородных линий, и быстро монтировать кровать на ПЭТ-сканирование машины. Поместите изофлурана и кислородных линий. Убедитесь, что изофлуран потока в течение ПЭТ-сканирование машины. Подключите кабель ПЭТ и начать сканирование.
  13. После того, ПЭТ является полная затем переместить животное компьютерный томограф. После этой проверки перемещения животного к соответствующей клетке.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Блок-схема процесса трансплантации показано на рисунке 1а. Картину твоих / жилая имплантата показано на рисунке 1b. Тимуса ткани развивается нормально и имеет физиологическое распределение человеческих CD4 и CD8 Т-клеток. После восстановления, животные несут иммунной системы человека с нормальным распределением CD4, CD8 Т-лимфоцитов и других иммунных клеточных поколений.

Расхождение между размером опухоли и живые ткани показано на рисунке 2. В то время как компьютерная томография (серая зона) указали, большой рост опухоли, в естественных условиях ПЭТ показала, что это было в основном некротические и рубцовой ткани (рис. 2). Это свидетельствует о полезности ПЭТ как более чувствительный и точный способ оценки регрессии опухоли и оформления.

Рисунок 1 Рисунок 1. (A) схема на изменение BLT модели, используемой в этих исследованиях для создания химерных мышей, несущих MART-1 специфических Т-клеток. Твое / Liv имплантат был реконструирован из трансдуцированных и не трансдуцированных CD34 клеток, выделенных из аутологичных печени плода. Доля преобразованных клеток замораживают и вводят в облученных мышей, 4-6 недели позже. (B) представитель образа Твоего / жилая имплантата в гуманизированных мышей. Имплантаты имеют физиологическое распределение в тканях и CD4/CD8 отношения как показано на IHC и цифры проточной цитометрии. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2
Рисунок 2. ПЭТ и КТ изображение мышью проведения меланомы, опухоли.серая зона указывает на физический размер опухоли, а красный цвет указывает метаболической активности опухолей, которые очень ограничены.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Изменение BLT гуманизированные модель мыши в сочетании с в естественных условиях ПЭТ являются мощным инструментом для изучения хронических заболеваний человека. Эта система занимает BLT модели мыши и продвигает ее пределами ограниченные возможности для исследований ВИЧ-инфекции. Кроме того, это отличная система, в которой мы можем рассмотреть различные генной терапии протоколов, а также методы диагностики, прежде чем они могут достичь клинических условиях. Последнее в сочетании с низкой стоимостью использованием мышей по сравнению с приматами делает это очень полезную модель.

ПЭТ-технологий визуализации позволило нам оценить эффективность нашего подхода. Если бы мы полагались исключительно на физических измерений опухоли, мы бы недооценили активность противоопухолевого ответа порожденные нашим трансгенных Т-клеток. Обширных рубцов и некротических тканей дало появление большого опухоль, которая в действительности была мертвой ткани.

В заключение, утилита модифицированных мышей BLT мОдел может быть распространена и на другие модели заболевания. В то время как некоторые недостатки все еще ​​сохраняются такие как короткую продолжительность жизни мышей, это может быть очень сильным инструментом в естественных условиях оценить многие аспекты человеческого иммунитета, тестирования и разработки новых терапевтических вмешательств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы хотели бы поблагодарить Элвин и Ларри Уэлч Pang за техническую помощь. Эта работа была частично финансируется Национальным институтом здоровья (NIH) награды P50 CA086306, Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) гранты RC1-00149-1 и RS1-00203-1; CIRM Новый факультет премии RN2-00902-1 , Caltech-UCLA Объединенный центр Поступательное медицины, UCLA Центра исследований СПИДа (CFAR) NIH / NIAID AI028697, UCLA AIDS Institute, CIRM инструментов и технологий RT1-01126, и Научно-исследовательский UC Multicampus Программы и инициативы из Калифорнийского Центр противовирусных лекарственных препаратов (число MRPI-143226).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Invitrogen 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove's 12440061
Fetal Calf Serum 16000085
Collagenase type IV Sigma Aldrich C5138
Hyaluronidase H3506
DNAse I Roche Diagnostics 10104159001
Piptazo (Zosyn) Pfizer Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus) Ge Healthcare Life Sciences 17-1440-02
MACS Buffer Miltenyi Biotech See comments MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit 130-046-702
LS Columns 130-042-401
Retronectin Takara T100A
Matrigel BD Biosciences 354263
Isofluorane Baxter http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl) Pfizer Animal Health https://www.rimadyl.com/default.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
  3. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
  4. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  5. Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
  6. Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
  7. Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  8. V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
  9. Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).

Tags

Рак биологии выпуск 70 Stem Cell Biology иммунологии биомедицинской инженерии медицины биоинженерии генетике онкологии Humanized мышей трансплантация стволовых клеток стволовые клетки, Т-клетки рак животной модели
Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, … More

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, S. G., Levin, B., Liu, W., Radu, C. G., Kitchen, S. G., Zack, J. A. Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model. J. Vis. Exp. (70), e4181, doi:10.3791/4181 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter