Använda BLT Humaniserad Pigg som en stamcell baserad genterapi tumörmodell

Summary

Alstringen och karakterisering av tumörspecifika T-celler med användning av humaniserade möss beskrivs här. Human tymusvävnad och genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller transplanteras till nedsatt immunförsvar möss. Detta resulterar i att rekonstituera en manipulerad mänskliga immunsystemet möjliggör in vivo-undersökning av anti-tumör immunsvar.

Abstract

Små djurmodeller såsom möss har i stor utsträckning använts för att studera mänskliga sjukdomar och att utveckla nya terapeutiska interventioner. Trots den stora mängd information som vunnits från dessa studier ledde de unika egenskaperna hos mus immunitet samt artspecificitet av virussjukdomar såsom humant immunbristvirus (HIV) till utveckling av humaniserade musmodeller. De tidigare modellerna involverade användningen av C. B 17 scid / scid möss och transplantation av humana fetala tymus och kallas foster lever din / liv (SCID-hu-) ^{1, 2} eller adoptiv överföring av humana perifera blodleukocyter (SCID-huPBL ) ^3. Båda modellerna huvudsakligen används för att studera HIV-infektion.

En av de viktigaste begränsningarna hos båda dessa modeller var bristen på stabila rekonstitution av humana immunceller i periferin för att göra dem mer fysiologiskt relevant modell för att studera HIV-sjukdom. För detta ändamål BLT humanized musmodell utvecklades. BLT står för benmärg / lever / tymus. I denna modell 6 till 8 veckor gamla NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) nedsatt immunförsvar möss får din / liv implantat som i SCID-hu-musmodell bara för att följas av en andra human hematopoetisk stamcellstransplantation ^4. Fördelen med detta system är den fullständiga rekonstitution av det humana immunsystemet i periferin. Denna modell har använts för att studera HIV-infektion och latens ^5-8.

Vi har skapat en modifierad version av denna modell som vi använder genetiskt modifierade humana hematopoetiska stamceller (hHSC) att bygga din / liv implantat följt av injektion av transducerade autologa hHSC ^{7, 9.} Detta tillvägagångssätt resulterar i genereringen av genetiskt modifierade linjerna. Ännu viktigare, anpassade vi detta system för att undersöka potentialen att generera funktionella cytotoxiska T-celler (CTL) som uttrycker en melanom specifik T-cellreceptor. Med hjälp av denna modell kunde vi bedöma funktionaliteten hos vår transgen CTL använder levande positronemissionstomografi (PET) avbildning för att bestämma tumörregression (9).

Målet med detta protokoll är att beskriva processen att skapa dessa transgena möss och bedöma effektivitet in vivo med levande PET imaging. Som en anteckning, eftersom vi använder mänskliga vävnader och lentivirusvektorer, våra anläggningar uppfyller CDC NIH riktlinjer för biosäkerhetsnivå 2 (BSL2) med särskilda försiktighetsåtgärder (BSL2 +). Dessutom är NSG mössen allvarligt nedsatt immunförsvar så måste deras boende och underhåll uppfyller de högsta hälsonormer ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Generering av BLT möss

Generering av BLT möss är uppdelad i tre (3) delar: (1) behandling av fostervävnad och beredning av CD34 humana hematopoetiska stamceller, (2) Transplantation av mänskliga vävnader, och (3) sekundär transplantation. För alla protokoll, har vi tillhandahållit Tabell 1 med reagens information.

1. Vävnadsbehandling och isolering av CD34 humana hematopoietiska stamceller

Färska fostervävnad eller vävnad levereras över natten på is från olika byråer organ upphandling kan användas. Ofta fostervävnad är inte steril, vilket framgår av produktion av 1.000 bakteriella kolonier på blodagar per milliliter omgivande medium. Vi tvättar rutinmässigt vävnaden två gånger i 40 ml steril PBS. Även om detta inte bort alla bakterier, kan det göra någon skillnad mellan en lyckad transplantation serie och ett resultat där de flesta av de mottagande mössen efter för bakteriell ifection. Som en extra steg, ytterligare desinficera vävnaden, vi kultur cellsuspensionen i närvaro av antibiotika.

1,1 Behandling av Fetal tymusvävnad

1. Tvätta tymus genom att hälla bort mediet i en bägare med blekmedel och använda skalpell för att förhindra vävnaden från att glida in i blekmedel. Fyll röret med PBS. Cap och vänd ett par gånger för att tvätta tymus. Dekantera supernatanten i blekmedel. Upprepa.
2. Placera tymus vävnaden i 8 ml RPMI + 10% fetalt kalvserum i en 60-mm skål och skjuvning i 1,5 till 2 mm bitar med två skalpeller. Klippning med skalpeller minimerar riva och skada vävnaden bitar. Skadad vävnad tenderar att bli svullen, klibbig och svår att dra in implantatet nålen. Antalet erhållna bitar är den första övre gränsen för transplanterbara möss.
3. Överför de suspenderade bitar med en 25 ml pipett (för att minimera vävnadsskada) i en T25-kolv. Lägg 70 il piptazo (Zosyn) till kolven och kultur över natten, 2. Detta minskar avsevärt kontaminerande bakterier. Om du vill göra vävnadstypning eller andra analyser fenotypning, ta ut 1 ml av celler.

1,2 Behandling av Fetal levervävnad

1. Tvätta levern som i steg 1.1.1.
2. Tillsätt 10 ml Iscoves medium och häll allt i en 100 mm petriskål.
3. Med två skalpeller, tärna levern i små (~ 3 mm) bitar. Om du stöter på vit bindväv, skrapa levern från den och kasta den i blekmedel.
4. Homogenisera vävnad genom att suga in den i en 12 ml spruta försedd med en 16 gauge trubbig nål 3 eller 4 gånger och överföra till en 50 ml rör.
5. Förbered enzymer för vävnad digerering som följer: Till 10 ml av Iscoves i en 50 ml rör, tillsätt 200 pl av varje: kollagenas typ IV (1 mg / ml), hyaluronidas (1 mg / ml), DNas I (2 U / ml).
6. Rita enzymer i en 12 ml spruta och montera den med en 0,22 μ filter. Filtrera enzymig / mediet direkt in cellsuspensionen.
7. Cap och försegla cellerna med Parafilm. Rotera vid 37 ° C under 90 minuter.
8. Inrätta ett 50 ml rör med en 100 μ cellfilter. Pipettera cellen smälta genom denna sil.
9. Lägg PBS till cellerna för att bringa volymen till 50 ml. Dela detta i två rör med 25 ml.
10. Underlag cellerna med 10 ml Ficoll. Snurra vid 2.400 rpm under 20 minuter utan broms.
11. Gränssnittet ska vara tjock. Suga ut med en 5 ml pipett och överföring till ett annat rör. Du bör ha två tuber av gränssnitt. 50 ml PBS till varje och centrifugering vid 1.200 rpm under 10 minuter.
12. Kombinera pellets i ett rör och tvätta tre gånger med PBS innehållande 2% FCS.
13. Slutligen avbryta i 50 ml RPMI + 10% FCS och räkna celler med hjälp av trypanblått. Beroende på storleken av vävnaden, kan du få från ¹⁰ augusti-10 SEPTEMBER totalt hepatocyter.
14. Överför cellerna till en T150-kolv och tillsätt 30 ml RPMI + 10% FCS och 0,8 ml piptazo.
15. Inkubera under 1 till 1,5 timmar vid 37 ° C för att avlägsna adherenta celler.

1,3 Sortering och transduktion av CD34 hematopoetiska stamceller

1. Efter fastsättning av celler i steg 1.2.15, agitera kolven fram och tillbaka försiktigt i en minut för att få bort lösa celler. Det kommer att finnas en hel del fibroblaster och sådant fastnat på ytan.
2. Räkna igen med en 1 till 20 utspädning och registrera det totala antalet celler. Spara några tiondels ml för senare färgning. Du bör ha ca 30% färre celler från dina första cellräkningar (steg 1.2.13).
3. Centrifugera ner och tvätta två gånger med 40 ml av MACS buffert.
4. CD34 celler sorteras med hjälp Miltenyi Biotechs CD34 Direkt Kit. Vi följer exakt tillverkarens protokoll med LS kolonner som tillhandahålls av samma företag.
5. Återvunna celler kommer att vara i 5 ml. Räkna och beräkna totala antalet celler. Din avkastning på CD34 + celler bör vara 3-5% av din totala cellantal. Detta varierar med the ålder fetal lever. Yngre fetala lever tenderar att ge ett högre utbyte av CD34 + celler.
6. Dividera antalet celler med 1x10 ^6. Detta ger den andra övre gränsen för transplanterbara möss.
7. Räkna CD34-fraktionen (flöde genom och tvättar) och reservera 6 x 10 ⁶ per mus som skall transplanteras. Kultur dessa celler över natten i 50 till 80 ml av RPMI + 10% fetalt kalvserum + 1% piptazo.
8. Omvandla de CD34 + celler natten med lentivirusvektor. Vi använder retronectin av Takara efter exakt tillverkarens anvisningar.
9. Nästa dag, skörd CD34-cellerna, de transfekterade CD34 + celler och räknas.
10. Dela upp CD34 + celler i halv: del A och del B.
11. Spinn ner Del A CD34 + omvandlade celler och suspendera i 4 till 6 ml av frysning medium (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterilfiltrerad). Sätt 1 ml portioner i frysning flaskor och märk med "huFetalCD34", antalet celler i flaskan, datum och dina initialer.
12. För varje mus blanda 0.5x10 ⁶ Del B CD34 transducerade celler och 4.5x10 ⁶ CD34-celler i en steril skruvkork mikrofugrör, pellets och hålla på is. Också tina ett rör av Matrigel (BD Biosciences) på is. Alla dessa rör måste hållas på is tills används (gå till steg 2,10).

2. Vävnadstransplantation

Målet med detta steg är att transplantera en mänsklig fetal tymus / lever organoid enligt NSG musen njurkapseln. Denna organoid härmar bättre processen humana T-celler urval och processer mognad som de humana hematopoetiska stamceller kommer att använda mänskliga tymus och inte musen som plats för sin differentiering till olika T-cell och andra lymfoida linjer. Användningen av CD34-celler i transplantationsområdet processen är att åter generera fetal lever stroma och möjliggör bättre transplantation och tillväxt av implantatet. Åldern på NSG använda möss är 6-8 veckor gamla.

1. Beredning av läkemedel för Surgery:
   1. Isofluran: Rulla ihop en 2 tums kompress och stoppa den i en 15 ml skruvlock centrifugrör. Häll i ca 1 ml isofluran direkt från flaskan.
   2. Ketamin / zylazine: Lägg 0,52 ml ketamin (Ketaset) (100 mg / ml) och 0,52 ml xylazin (Anased) (100 mg / ml) till en 20 ml flaska koksaltlösning för injektion. Etikett med utgångsdatum den tidigaste löper komponenten och hålla fryst vid -20 ° C tills det behövs.
   3. Karprofen (Rimadyl). Späd detta precis innan ett kirurgiskt ingrepp. Späd 1:100 genom indragning 0,1 eller 0,2 ml från flaskan med en 1 ml spruta och en 25G nål. Injicera in en 10 eller 20 ml saltlösning för injektion. Etikett och datum. Förvara i kylen en dag bara. Belastning i 3 ml sprutor med 25G nålar.
2. Ställ in bordet för operationer. Täck den med sterila blå kuddar och en steril handduk för varje kirurg. Varje kirurg får från sin låda steriliserade instrument: 4 "sax, böjda trubbiga pincett, behöverle-näsa tång, hemostat, 16G trubbiga trokar och sår klipp applikator. Dessutom behöver de en krökt nål Vicryl sutur, en bunt av isopropanol torka paket, en 35 mm petriskål med PBS och en 1 ml spruta fylld med PBS.
3. Beläget i mitten av bordet ett glas Coplin burk med 2 cm Betadine och 2 bomullspinnar. Häll tymus bitarna i en 60 mm petriskål.
4. Anestesi utförs på en separat tabell eller i en huva täckt med sterila blå kuddar. Ställ in två små rack och en elektronisk balans med en bägare för att hålla mössen. Använd en rack för att hålla 0,5 ml x 28g insulinsprutor laddade med ketamin / xylazin och den andra för att hålla 3 ml sprutor av karprofen. Också flytta biologiskt avfallsbehållare nära att hålla rakade päls.
5. Väg alla mössen (6-8 veckor gamla) i en bur för att få den genomsnittliga vikten och sprutor belastning med en dos av 15 | il / g ketamin / xylazin. Injicera alla möss i buren.
6. Efter att mössen blir trög raka sina LEFT-sidan från höften till axeln mellan mitten av ryggen och magen med en Oster klippmaskin med nr 40 blad. Notera sin vikt, och slå sina öron för numrering.
7. Injicera 0,3 ml karprofen subkutant över axeln.
8. Kontrollera anestesi nivån av musen genom att klämma en tass. Om musen flinches, administrera isofluran från ett rör för cirka 12 sek. Försök sedan tassen squeeze igen. Håll ge korta skott av isofluran tills tassen reflexen försvinner. Lägg musen på dess högra sida vänd vänster.
9. En 16-gauge cancer implantat nål, med den inlämnade spets rundan används för att infoga vävnaden. Spola ut trokar några gånger i skålen PBS. Håller den horisontellt med stången innanför spetsen. Lägg en bit tymus med spetsig pincett och suger in den
10. En hjälpare lägger 5 il kall Matrigel till ett rör av celler (steg 1.3.12) med en Eppendorf positiv förskjutning pipett, och blandar genom försiktig omrörning. Kirurgen holDS trokar horisontellt och drar stången sakta som hjälpare pipetter den Matrigel blandningen i trokar. Blandningen gelar vid rumstemperatur.
11. Pinnen på bar hud med Betadine. Torka sedan detta bort med en isopropanol torka. Upprepa.
12. Leta mjälten under huden. Det är den mörkaste punkten. Musens njure ligger ca 5 mm rygg med mjälten, som kan ses genom den rakade huden.
13. Plocka upp huden över denna plats med de trubbiga pincett och göra ett snitt parallellt med mjälten cirka 15 mm lång. Göra en liknande sänkning av bukhinnan muskeln lagret under. Hos män bör njurarna vara direkt synliga och du helt enkelt måste pressa buken så att det hoppar ut. Hos kvinnor kan du behöva plocka upp äggstocken med hemostat och dra ut njuren. Detta kan bidra till att bibehålla njuren utanför kroppen. För män, måste du hålla ett visst tryck på buken med vänster hand för att hålla njurarna exponeras.
14. Plocka ett litet hål i posterioR änden av njurkapseln. Det kan blöda lite.
15. Skjut trokar i detta hål och längs njuren tills öppningen av trokar är fullständigt täckt av njurkapseln. Sedan använda lillfingret på högerhanden, injicera vävnaden.
16. Skjut njurarna tillbaka försiktigt med den slutna hemostat. Sätt ett stygn i bukhinnan bundna med en dubbel vet. Pressa huden upp som en väska och sätta i två sårklämmor.
17. Lägg en droppe PBS på varje öga och lägg musen på sidan på buren sängkläder. Se till att alla mössen har återvänt till om på magen innan de lämnar dem.
18. Nästa dag, ge varje mus annan skott av karprofen.

3. Sekundär Transplantation

Målet med detta steg i skapandet av BLT möss är att fylla moue benmärgen med humana hematopoetiska stamceller. Den transplanterade implantatet från förfarande (2) är inte tillräckligt för att stödja full upplösning av the mänskliga immunsystemet i dessa möss. Under den sekundära transplantation, vi sub-dödligt bestråla mössen att utarma murina benmärgsceller vilket genererar "utrymme" för implantation av de humana CD34 + celler.

1. Fyra till sex veckor senare bestråla mössen med 2,7 Gy. Mössen injiceras samma dag med del A CD34 transducerade celler. Tidsramen är baserad på etablering och tillväxt av din / liv implantat transplanteras i steg 2. Vanligtvis under denna tid implantatet har vuxit kraftigt gör att vi kan gå vidare till nästa steg.
2. Tina upp Del A CD34 + omvandlade celler, tvätta och suspendera i medium till en koncentration av 5x10 ⁶ / ml.
3. Fyll 0,5 ml x 28g insulinsprutor med 0,1 ml celler (10 ⁵ till 5x10 ⁵ celler per 0,1 ml per mus) i en bur av möss (varje bur innehåller maximalt 5 möss) och lägg dem på galler vänd bort.
4. Söva en mus med en isofluran rör genom scruffing den och hålla dennäsan i rören för cirka 20 sekunder. Räkna att hålla reda på tiden.
5. Sedan står det till höger och dra i huden runt halsen tätt med tummen och pekfingret på vänster hand. Tryck under dess käke med din tredje Finder så att dess högra öga buktar ut. Håll sprutan parallellt med den långa axeln av musens huvud, lyft nålen bakom ögat och skjut den försiktigt tills det tar stopp. Tryck inte på någon längre, men injicera belastningen under cirka 2 sekunder.
6. Två till tre månader senare möss blödde retroorbitalt använder EDTA belagt glas pipetter. Du kan bara ta maximalt 200 ul blod per månad per mus. 50-100 pl blod bör vara tillräcklig för FACS-analys. Alternativa blödning strategier inkluderar ansikts ven blöder och svans blöder ven. Det senare kommer att ge dig mycket små volymer av blod som inte kan vara tillräckligt för flera analyser.
7. Blodprover färgades för expression av den humana lymfocyt markören CD45 för att bedöma rekonstituering. Bdärvarande sampel tillsätts till 1 ml röda blodkroppar lysbuffert (160 mM NH ₄ Cl, 100 mM KHCO _3, 0,01 mM EDTA) och inkuberades under 5 min vid rumstemperatur.
8. Tvätta cellerna i lysbuffert, 5 minuter vid 1.200 rpm, och upprepa om nödvändigt.
9. Centrifugera cellerna som i 3,8 och tvätta i PBS kompletterad med 3% fetalt kalvserum (FACS-PBS).
10. Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 100 | il FACS-PBS.
11. Lägg antikroppar för att bedöma human lymfocyt rekonstitution. Vi inkluderar typiskt följande CD45 (human lymfocyt markör), CD8, CD4, CD14 och CD16 för makrofager och monocyter, CD19 för B-celler och CD56 för NK-celler.
12. Inkubera vid 4 ° C under 30 minuter.
13. Tvätta som i steg 3,9 och återsuspendera celler i 2% paraformaldehyd för FACS-analys.
14. Om möss rekonstituerade, fortsätter vi med tumör injektioner. Rekonstituering nivåer av humana lymfocyter varierar från mindre än 1% till 40% av totala antalet blodkroppar. De nivåer och typer av lymphocyte härstamningar är jämförbara med vad man skulle förvänta sig från friska människor blodgivare. Men förvänta fluktuationer i antalet icke-T-cell linjer. Om siffrorna inte är acceptabla inom den 12-veckors tidsram kan du upprepa den sekundära transplantationen från steg 3,1.
15. Tumörcellinjer odlas enligt tillverkarens rekommendationer eller laboratorium. Celler skördas, tvättas och återsuspenderas i Matrigel i förhållandet 1:1 (50 ^ celler/50 | il Matrigel). Prover hålls på is vid alla tidpunkter.
16. Möss sövs och rakade vid området för injektionen. Området steriliseras med användning av en isopropanol dyna. En hjälpare laster cellsuspensioner i förskolan kyld 23G 1 ml sprutor. Tumörceller injiceras subkutant. Behandla injektionsstället med antibiotisk salva. Tumörer bör upprätta och börja växa i 4 veckor.

B. In vivo Positron Emission Tomography (PET)

För våra studier har vi examenine glukosupptag ^([18 F]-fluordeoxiglukos ^([18 F] FDG) så möss fastade 4-6 timmar före avbildning. MicroPET / CT skanningar görs med hjälp av microPET Inveon scannern (Siemens prekliniska Solutions) och MicroCATII datortomografen ( Siemens PreclinicalSolutions). Bildanalys sker med OsiriX (Pixmeo, Schweiz) mjukvara. Målet är att mäta den metaboliska aktiviteten av tumören och slutligen att använda PET-avbildning som ett alternativ till fysiskt mäta tumörregression. Såsom framgår av figur 2, vi har stött på tumörer som bygger på utseende och storlek är inte riktade, men levande PET imaging avslöjade omfattande vävnadsnekros. Denna metod kan fungera som en mer känslig och exakt indikator på tumörregression.

1. Utse en kammare för söva (2% isofluoran) mössen, och en kammare som 60 minuter upptaget av FDG innan PET scanning ("väntar kammare"). Placera blå kuddar i båda kamrarna.
2. Eftersom djuren är Anesthetized under en lång tid, bör de hållas varma vid 30 ° C med hjälp av vattenfyllda handskar som värms i en mikrovågsugn och placera burarna på värme kuddar.
3. Vrid isofluran flödet för denna kammare på. Låt isofluran att fylla anestetisering kammaren för ungefär 5-10 minuter innan placerar några möss in i kammaren. Se till att locket är låst och stängd tätt för att undvika läckage isofluran.
4. Placera den första musen till söva kammaren och låsa locket ordentligt. Tillåt 5-10 minuter eller tills musen är medvetslös.
5. Ta bort musen från den söva kammaren, etikett svansen av musen (annan färg per bur) och injicera intraperitonealt musen med ^[18 F] FDG (80 pCi). Ta del av tiden mus injicerades. Musen är sövda igen 50 min från denna tidpunkt, vilket i 10 min för att ställa upp för PET-kamerateknik (för totalt 60 min ^[18 F] FDG upptag före PET-scanning).
6. Placera den injicerade musen till den väntande kammaren, så ^[18 F] FDG upptag i 1 timme innan PET-scanning. Lås inte locket. Låt locket löst för att tillåta luftflöde.
7. Omedelbart placera nästa musen för FDG injektion i söva kammaren. Efterföljande möss injektioner bör vara placerade 10 minuter från varandra, eftersom processen av PET scanning är 10 min. Omedelbart efter en mus har skannats, kommer 60 minuter FDG upptag för nästa mus som ska skannas vara redo exakt 10 minuter isär.
8. Fortsätt söva och injicera möss som anges i steg 7-9.
9. Efter 50 minuter från den första musen injektionen tidpunkt, placera den första injicerade mus till söva kammaren igen (samtidigt fortsätter att söva och injicera möss).
10. Anslut musen sängen till syre och isofluran linjer och vrid isofluran flödet på för sängen. Placera en blå pad på sängen.
11. Placera musen redo för PET-kamerateknik på sängen, sträcker armarna ochben och hålla denna position med tejp. Placera smörjmedel över ögonen. Detta steg är det mest avgörande eftersom placeringen av djuret kan påverka kvaliteten på din avbildning.
12. Koppla bort isofluran och syre linjer och snabbt montera sängen på PET scanning maskin. Placera isofluran och syre linjer. Se till att isofluran flödet är på för PET-scanning maskin. Anslut kabeln PET-kamerateknik och börja skanningen.
13. När PET-undersökning är klar och sedan flytta djuret till CT-scannern. Efter denna avsökning flytta djuret till sin respektive bur.

Representative Results

Ett flödesschema av transplantationen processen visas i figur 1A. En bild av THY / LIV implantat visas i figur 1B. Tymusvävnaden utvecklas normalt och har en fysiologisk fördelning av humana CD4 och CD8 T-celler. Efter beredning djuren bär ett mänskligt immunförsvar med normal fördelning av CD4, CD8 T-celler och andra immun härstamningar cell.

Skillnaden mellan tumörstorlek och levande vävnad visas i figur 2. Medan datortomografi (grått område) visade en stor tumörtillväxt in vivo PET imaging visade att det var mestadels nekrotisk och ärrvävnad (Figur 2). Detta understryker nyttan av PET-avbildning som en mer känslig och exakt sätt att bedöma tumörregression och clearance.

Figur 1. (A) Ett schematiskt diagram på den modifierade BLT modell som används i dessa studier för generering av chimeriska möss som bär MART-1-specifika T-celler. Thy / Liv implantat rekonstruerades från transducerade och icke-transducerade CD34 celler som isolerats från en autolog fetal lever. En fraktion av de transducerade cellerna fryses och injicerades i bestrålade möss 4-6 veckor senare. (B) En representativ bild av THY / LIV implantat i humaniserade möss. Implantaten har en fysiologisk vävnadsdistribution och CD4/CD8 förhållanden som visas med IHC och flöde siffror cytometri. Klicka här för att se större bild .

Figur 2. En PET och CT-bild av en mus som bär en melanom tumör. Dengrå området indikerar den fysiska storleken av tumören, medan den röda färgen indikerar tumörens metabolisk aktivitet, som är mycket begränsad.

Discussion

Den modifierade BLT humaniserade musmodell tillsammans med in vivo PET imaging är kraftfulla verktyg för att studera kroniska sjukdomar hos människor. Detta system tar BLT musmodellen och förskott det utöver den begränsade räckvidden för HIV-forskning. Dessutom är det ett bra system där vi kan undersöka olika genterapiprotokoll samt diagnostiska tekniker innan de kan nå den kliniska miljön. Den senare är kopplad med den låga kostnaden för att använda möss kontra primater gör detta till en mycket användbar modell.

PET bildteknik tillät oss att bedöma effekten av vår strategi. Om vi ​​förlitat sig uteslutande på fysiska mätningar av tumören, skulle vi ha underskattat styrkan i antitumörsvar genereras av våra transgena T-celler. Den omfattande ärrbildning och nekrotisk vävnad gav utseendet av en stor tumör, som i verkligheten var död vävnad.

Sammanfattningsvis nyttan av den modifierade BLT mus mOdel kan utsträckas till andra sjukdomsmodeller. Medan vissa nackdelar kvarstår såsom kortare livslängd hos möss, kan detta vara ett mycket kraftfullt verktyg för in vivo-bedömning många aspekter av mänskligt immunitet, testa och utveckla nya terapeutiska ingrepp.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx