Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Summary

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Abstract

Fare gibi küçük hayvan modellerinde yaygın insan hastalığı araştırmak için ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için kullanılmıştır. Bilgi zenginliği bu çalışmalarda elde rağmen, fare bağışıklık yanı sıra insan immün yetmezlik virüsü (HIV) enfeksiyonu gibi viral hastalıkların türlerin özgüllüğü benzersiz özellikleri insanlaşmış fare modellerinin gelişmesine yol açmıştır. Önceki modellere C. B 17 SCID / SCID farelerde ve adlandırdığı insan fetal timus ve fetal karaciğer transplantasyonu kullanımı dahil senin / liv (SCID-hu) ^{1, 2} ya da insan periferik kan lökositleri evlatlık transferi (SCID-huPBL ) ^3. Her iki model de ağırlıklı olarak HIV enfeksiyonu çalışma için kullanılmıştır.

Bu modellerin her ikisi de temel sınırlamalar biri onları HIV hastalığı araştırmak için daha önemli fizyolojik modeli yapmak için çevre, insan bağışıklık hücrelerinin kararlı sulandırma eksikliği oldu. Bu amaçla, BLT uğultuanized fare modeli geliştirilmiştir. BLT kemik iliği / karaciğer / timus anlamına gelir. Bu modelde, 6 ila 8 hafta eski NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG), bağışıklığı baskılanmış farelerde ikinci bir insan hematopoetik kök hücre nakli ⁴ tarafından takip edilmesi sadece SCID-hu fare modelinde olduğu gibi senin / liv İmplantı alacak. Bu sistemin avantajı, çevre, insan bağışıklık sisteminin tam sulandırılması olduğunu. Bu model, HIV enfeksiyonu ve gecikme ^5-8 incelemek için kullanılır olmuştur.

Biz genetik hHSC ^{7, 9} otolog transduced enjeksiyonu takiben thy / liv implant oluşturmak için insan hematopoietik kök hücreleri (hHSC) modifiye kullanımı olan bu modelin değiştirilmiş bir versiyonunu yarattı. Bu yaklaşım, genetiği değiştirilmiş soy nesil sonuçlanır. Daha da önemlisi, bir melanom spesifik T hücre reseptörü eksprese eden fonksiyonel sitotoksik T hücreleri (CTL) oluşmasına neden incelemek için bu sistem uyarlanmış. Bu modelini kullanarak tümör regresyonu (9) belirlemek için canlı pozitron emisyon tomografi (PET) görüntüleme kullanarak bizim transgenik KVK işlevselliğini değerlendirmek başardık.

Bu protokolün amacı bu transgenik farelerin üreten ve canlı PET kullanılarak in vivo etkinliği değerlendiren sürecini açıklamaktır. Biz insan doku ve lentiviral vektörler kullanın bu yana bir not olarak, tesislerimizde özel önlemler (BSL-2 +) ile Biyogüvenlik Seviyesi 2 (BSL-2) için CDC NIH yönergelere uygun. Buna ek olarak, NSG farelerde ciddi nedenle bağışıklığı baskılanmış, onların barınma ve bakım en yüksek sağlık standartlarına (uymalıdır http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

BLT fareler A. Üretim

Cenin dokusu ve insan CD34 hematopoietik hücrelerin hazırlanması (1) işleme, (2) insan doku transplantasyonu, ve (3) ikincil nakil: BLT farelerin üretimi üç (3) bölüme ayrılmıştır. Tüm protokoller için, reaktif bilgileri ile birlikte Tablo 1 sağladı.

1. CD34 İnsan Hematopoetik Kök Hücre Doku İşleme ve İzolasyon

Çeşitli organ tedarik acentelerden buz üzerinde bir gecede gelen taze cenin dokusu veya doku kullanılabilir. Orta çevreleyen mililitrede kanlı agarda 1.000 bakteri kolonilerinin üretim kanıtladığı gibi Genellikle fetal doku, steril değildir. Biz rutin steril PBS 40 ml iki kez dokunun yıkayın. Bu tüm bakteri kaldırmaz iken, bakteri için hangi alıcı fareler çoğu yenik başarılı nakli serisi ve sonuç arasında bir fark yaratabilirInfeksiyon. Ek bir adım olarak, daha fazla antibiyotik varlığında bu kültür hücre süspansiyonu, doku dezenfekte etmek için.

Fetal Timik Doku 1.1 İşleme

1. Çamaşır suyu bir behere orta dökülen ve çamaşır suyu içine kaymasını doku önlemek için neşter kullanılarak timus yıkayın. PBS ile tüp doldurun. Cap ve timus yıkamak için birkaç kez ters. Ağartıcı içine Durusu süpernatant. Tekrarlayın.
2. RPMI 8 ml timus dokusu + iki neşter ile 1,5 ila 2 mm parçalar halinde 60 mm çanak ve kayma% 10 Fötal Buzağı Serumu yerleştirin. Neşter ile Kırkım yırtılma ve doku bit zarar en aza indirir. Hasarlı doku implant iğne içine çekmek, şiş yapışkan ve zor olma eğilimindedir. Elde edilen bit sayısı transplante fareler üzerinde ilk üst sının teşkil eder.
3. Bir T25 şişesi içine 25 ml pipet (doku hasarı en aza indirmek için) ile askıya bit aktarın. Gecede şişesi ve kültürüne piptazo (Zosyn) 70 ul ekleyin, CO2. Bu önemli ölçüde kirlenmesine neden bakterileri azaltır. Eğer doku tipleme veya başka fenotipleme deneyleri yapmak istiyorsanız, hücre 1 ml çıkar.

Fetal Karaciğer Doku 1.2 İşleme

1. Adım 1.1.1 'de olduğu gibi karaciğer yıkayın.
2. 100 mm Petri kabı içine Iscove orta ve süzün her 10 ml ekleyin.
3. İki neşter ile, küçük (~ 3 mm) parçalar halinde karaciğer zar. Eğer beyaz bağ dokusu içine çalıştırırsanız, ondan karaciğer kazımak ve çamaşır atın.
4. Bir 16 gauge künt iğne 3 ya da 4 kez ve 50 ml tüp transferi ile donatılmış 12 ml şırınga içine emerek dokusu homojenize edilir.
5. Aşağıdaki gibi Doku sindirimi için enzim hazırlayın: kolajenaz tip IV (1 mg / ml), hiyaluronidaz (1 mg / ml), DNase I (2 U /: Iscove adlı bir 50 ml tüp içinde 10 ml etmek için, her biri 200 ul ekle ml) eklenmiştir.
6. 12 ml'lik şırınga içine enzimler çizin ve bir 0.22 μ filtre ile uyum. Enzy FiltreBana / hücre süspansiyonu doğrudan orta.
7. Cap ve Parafilm ile hücreleri mühür. 90 dakika için 37 ° C 'de döndürün.
8. 100 μ hücre süzgecinden ile bir 50 ml tüp ayarlama. Pipet hücre bu süzgecinden sindirmek.
9. 50 ml hacim getirmek için hücreler PBS ekleyin. 25 ml'lik iki tüp içine bu Böl.
10. Ficoll 10 ml hücreleri örtüsüdür. Frensiz 20 dakika için 2400 rpm'de Spin.
11. Arayüzü kalın olmalıdır. 5 ml'lik pipet ve başka bir tüpe transfer dışarı Suck. Eğer arayüz iki tüp olması gerekir. 10 dakika için 1200 rpm'de ve her dönüş için PBS içinde 50 ml ilave edilir.
12. Bir tüp içine pelet birleştirin ve PBS% 2 FCS içeren daha üç kez yıkayın.
13. Son olarak RPMI +% 10 FCS ve tripan mavisi kullanarak hücreleri sayımı, 50 ml içinde askıya. Doku ve boyutuna bağlı olarak, ^8, 10 ve 10 ⁹ toplam hepatositler için alabilir.
14. T150 bir şişeye aktarın ve hücreler RPMI +% 10 FCS, 30 ml ve 0.8 m eklemekpiptazo l.
15. 37 de 1 ila 1.5 saat süreyle inkübe ° C yapışık hücreleri çıkarmak için kullanılır.

1.3 Ayırma ve CD34 Hematopoetik Kök Hücre İletimi

1. Adım 1.2.15 hücrelerin eklenti sonra, gevşek hücreleri çıkarmak için bir dakika hafifçe ileri geri şişeyi çalkalayın. Fibroblastlar ve bu gibi yüzeyine yapışmış bir çok olacaktır.
2. Bir 1-20 seyreltme kullanılarak yeniden sayma ve hücrelerin toplam sayısını kaydedebilir. Daha sonra boyama için bir ml birkaç onda kaydedin. Sen ilk hücre sayımı (adım 1.2.13) yaklaşık% 30 daha az hücre olmalıdır.
3. Aşağı spin ve MACS tamponu 40 ml ile iki kez yıkayın.
4. CD34 hücreler Miltenyi Biotech en CD34 Doğrudan Kit kullanılarak sıralanır. Biz tam olarak aynı şirket tarafından sağlanan LS sütunları kullanarak üreticinin protokolünü izleyin.
5. Geri kazanılan hücreler 5 ml olacaktır. Sayın ve toplam hücreleri hesaplamak. CD34 + hücrelerin Sizin verimi toplam hücre sayısı% 3-5 olmalıdır. Bu th ile değişirFetal karaciğer e yaşı. Genç fetal karaciğerleri CD34 + hücrelerin daha yüksek verim vermek eğilimindedir.
6. 1x10 ⁶ ile hücrelerin sayısını bölün. Bu transplante fareler üzerinde ikinci üst sınır değerini verir.
7. CD34-fraksiyonu (akış ve yıkar) ve rezerv 6 fare başına x 10 ⁶ nakledilen kadar sayın. RPMI +% 10 Fetal Buzağı Serumu 50 ila 80 ml de gece boyunca kültür bu hücreler +% 1 piptazo.
8. Sizin lentiviral vektörü ile gecede CD34 + hücrelerde transdüksivonu. Biz tam olarak üreticinin yönergelerini izleyerek Takara tarafından retronectin kullanın.
9. Ertesi gün, hasat CD34-hücreleri transfekte CD34 + hücreleri ve sayımı.
10. Yarısında CD34 + hücreleri bölün: Part A ve Part B
11. Kısım A CD34 + transduced hücreleri aşağı spin ve dondurucu orta 4 ila 6 ml (RPMI +% 10 FCS 0.22 μ steril +% 10 DMSO, süzülmüş) olarak askıya. "HuFetalCD34", flakon hücrelerin sayısı, tarihi ve adınızın baş harflerini, donma şişeleri ve etiket içine 1 ml alikotları koy.
12. Her fare 0.5x10 ⁶ Parça karıştırmak için B CD34 + hücreleri ve 4.5x10 steril vida kapaklı mikrofuge'de tüp içinde ⁶ CD34-hücreleri, pelet ve buz üzerinde tutmak transduced. Ayrıca buz üzerinde Matrigel (BD Biosciences) bir tüp eritin. (Adım 2.10 gidin) kullanılıncaya kadar tüm bu tüpler buz üzerinde tutulmalıdır.

2. Doku Nakli

Bu adımın amacı NSG fare böbrek kapsülü altında bir insan cenin timüs / organoid karaciğer nakli için. Insan hematopoietik kök hücrelerin farklı T hücre ve diğer lenfoid soy onların farklılaşma için site olarak insan timus değil fare kullanmak gibi bu organoid iyi insan T hücre seçimi ve olgunlaşma süreçleri sürecini taklit eder. Transplantasyon süreç içinde CD34 hücrelerinin kullanılması yeniden oluşturmak fetal karaciğer stroma ve implant daha iyi transplantasyonu ve büyümesi için imkan sağlamaktır. Kullanılan NSG farelerin yaşı 6-8 hafta eski.

1. Su için ilaçların hazırlanmasırgery:
   1. İzofluran: 2 inç gazlı bezle sarın ve 15 ml screwcap santrifüj tüpü içine şeyler. Doğrudan şişeden izofluran yaklaşık 1 ml dökün.
   2. Ketamin / zylazine: enjeksiyon için salin 20 ml'lik bir şişeye ketamin (Ketaset) (100 mg / ml) 0.52 ml ve ksilazin (Anased) (100 mg / ml) ve 0.52 ml ilave edilir. Gerektiği kadar erken dolan bileşenin son kullanma tarihi ile Etiket ve tutmak -20 ° C'de donduruldu.
   3. Carprofen (Rimadyl). Sadece bir cerrahi girişim öncesinde bu seyreltin. Bir 1 ml şırınga ve 25G iğne ile flakondan 0.1 veya 0.2 ml çekerek 1:100 seyreltin. Enjeksiyon için tuzlu bir 10 veya 20 ml içine enjekte edilir. Etiket ve tarih. Sadece bir gün için buzdolabında saklayın. 25G iğne ile 3 ml şırınga içine yükleyin.
2. Ameliyatları için masa ayarlayın. Steril mavi yastıkları ve her cerrah için steril bir havlu ile örtün. 4 "makas, kavisli künt forseps, gerekir: Her cerrah sterilize araçların kendi kutusundan alırle-burun forseps, hemostat, 16G körelmenin trokar ve yara klip aplikatör. Buna ek olarak, kavisli bir iğne Vicryl dikiş, izopropanol bir yığın paketleri silin PBS bir 35 mm Petri kabı ve PBS ile doldurulmuş 1 ml şırınga gerekir.
3. Tablo Betadin 2 cm'lik pamuklu ve 2 ile bir cam kavanoz Coplin ortasında ayarlayın. 60 mm Petri kabı içine timus bit dökün.
4. Anestezi ayrı bir tablo üzerinde ya da steril mavi pedleri ile kaplı bir başlık içinde gerçekleştirilir. Iki küçük raflar ve fareler tutmak için beher elektronik bir denge kurun. Carprofen ve 3 ml şırınga tutun ketamin / xylazine ve diğer yüklü 0.5 ml X 28G insülin şırıngaları tutmak için bir raf kullanın. Ayrıca traş kürk tutmak için yakın biohazard atık konteyner taşımak.
5. Ketamin / xylazine 15 ul / g doz ile ortalama ağırlık ve yük şırıngalar almak için bir kafes içinde tüm fareler (eski 6-8 hafta) tartılır. Kafes içinde tüm fareler enjekte edilir.
6. Farelerde halsiz olmak sonra kendi lef tıraşkalça arka merkezi ve 40 numaralı bıçak ile bir Oster kesme makinesi ile göbek arasındaki omuz t tarafı. Kilolarını kaydedin ve numaralandırma için onların kulaklarını yumruk.
7. Omzunun üstünden subkutan 0.3 ml carprofen enjekte.
8. Bir pençe sıkarak fare anestezi seviyesini kontrol edin. Fare geri çekildiğinde ise, yaklaşık 12 saniye boyunca bir tüp izofluran yönetmek. Sonra tekrar pençe sıkmak deneyin. Pençe refleksi kaybolana kadar izofluran kısa çekim vererek tutun. Sol bakan sağ tarafı üzerine fare yatırın.
9. Ucu açılmış yuvarlak bir 16-gauge kanseri implant iğne, doku eklemek için kullanılır. Trokar PBS çanak birkaç kez yıkayın. Sadece ucu içine çubuk ile yatay Holding. Kargaburnu forseps ile timus bir parça ekleyin ve içine emmek
10. Bir yardımcı bir Eppendorf pozitif deplasmanlı pipet yardımıyla hücrelerin bir tüp (adım 1.3.12) soğuk Matrigel 5 ul ekler ve nazik karıştırma ile karıştırır. Cerrah holhelper trokar içine Matrigel karışımı pipetleri ds trokar yatay ve yavaşça geri çubuk çeker. Karışım oda sıcaklığında jeller.
11. Betadine ile çıplak cilt swabı. Sonra bir izopropanol bezle bu siliniz. Tekrarlayın.
12. Deri altında dalak bulun. Bu karanlık nokta. Farenin böbrek traş deri yoluyla görülebilir dalak dorsal 5 mm, hakkında yer almaktadır.
13. Künt forseps ile bu nokta üzerinde cilt Pick up ve yaklaşık 15 mm uzunluğunda dalak bir kesim paralel hale. Aşağıdaki periton kas tabakası benzer bir kesim olun. Erkeklerde böbrek doğrudan görünür olmalıdır ve sadece dışarı pop karın sıkmak zorunda. Kadınlarda, sen hemostat ile yumurtalık pick up ve böbrek dışarı sürüklemek zorunda kalabilirsiniz. Bu, vücut dışında böbrek tutmaya yardımcı olabilir. Erkek için, böbrek maruz tutmak için sol elinizle karın üzerinde baskı tutmak zorunda olacak.
14. Posterio küçük bir delik yiğitlikböbrek kapsülü r sonu. Bu biraz kanayabilir.
15. Trokar ve orifis tamamen böbrek kapsülü ile örtülüdür kadar bu deliğe ve böbrek boyunca trokar kaydırın. Sonra sağ elin küçük parmağı kullanarak, doku enjekte.
16. Kapalı hemostatla geri hafifçe böbrek itin. Bir çift biliyorum ile bağlı periton bir dikiş koyun. Bir çanta gibi cilt kadar sıkın ve iki yara klipleri koymak.
17. Her göz PBS bir damla koyun ve kafes yatak üzerinde yan fare yatıyordu. Tüm fareler onlara ayrılmadan önce karınlarını döşeme döndü emin olun.
18. Ertesi gün, her fare carprofen başka bir şans vermek.

3. İkincil Nakli

BLT farelerin üretimi de bu adımın amacı insan hematopoietik kök hücreleri ile moue kemik iliği doldurmak için. Prosedürü (2) den nakledilen implant inci dolu yapımın desteklenmesi için yeterli değildirBu farelerde e insan bağışıklık sistemi. İkincil nakli sırasında, alt-lethally böylece insan CD34 + hücrelerin implantasyonu için "boşluk" üreten murin kemik iliği hücreleri tüketmek için fareler ışın.

1. Dört ila altı hafta sonra 2.7 Gy ile farelerin ışın. Fareler Kısım A CD34 + hücreleri ile transdüksiyon ile aynı gün enjekte edilir. Süre 2. adımda nakledilen senin / liv implant kurulması ve büyüme dayanmaktadır. Tipik olarak, bu süre boyunca implant bize sonraki adımlara devam etmek için izin önemli ölçüde artmıştır.
2. Kısım A CD34 + transduced hücreleri çözülme, yıkayın ve 5x10 ⁶ / ml konsantrasyonunda orta ve askıya.
3. Farelerin bir kafes (her kafese 5 farelerin maksimum içeren) için hücre 0.1 ml (10 ⁵ fare başına 0.1 ml başına 5x10 ⁵ hücre için) 0,5 ml X 28G insülin şırıngaları yükleyin ve uzak bakan bir raf onları yatıyordu.
4. Bu Eksfoliyant ve tutarak bir izofluran tüp ile bir fare uyuşturyaklaşık 20 saniye tüpler burun. Zaman takip kadar sayın.
5. Sonra sağa yüz ve baş ve sol elin işaret parmağı ile sıkı boynunda deri çekin. Onun sağ gözü dışarı çıkıntı böylece üçüncü bulucu ile çene altında basın. Farenin başının uzun eksenine paralel şırınga Holding, göz arkasında iğne kayma ve durana kadar yavaşça kaydırın. Başka basın, ancak yaklaşık 2 sn üzerinde yük enjekte etmeyin.
6. İki üç ay sonra fareler EDTA kaplamalı cam pipetler kullanılarak retroorbitally kanadı vardır. Siz sadece fare başına aylık kan 200 ul azami alabilir. Kan, 50-100 ul FACS analizi için yeterli olmalıdır. Alternatif kanama stratejileri yüz ven kanamaları ve kuyruk ven kanamaları sayılabilir. İkincisi Birden deneyleri için yeterli olmayabilir kan çok küçük hacimlerde verecektir.
7. Kan örnekleri sulandırıldıktan değerlendirmek için insan lenfosit işaretleyici CD45 ifadesi için lekeli. Blood numuneleri 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu (160 mM _NH4CI, 100 mM KHCO _3, 0.01 mM EDTA) içine ilave edildi ve oda sıcaklığında 5 dakika için inkübe edilir.
8. Lizis tamponu, 1200 rpm'de 5 dk, ve tekrar gerekirse hücreleri yıkayın.
9. 3.8 'de olduğu gibi hücreler santrifüje ve% 3 fetal buzağı serumu (FACS-PBS) ilave edilmiş PBS ile yıkanır.
10. Süpernatantı ve 100 ul FACS-PBS içinde yeniden askıya granül.
11. Insan lenfosit sulandırıldıktan değerlendirmek için antikor ekleyin. Bu tipik olarak aşağıdaki CD45 (insan lenfosit işaretleyici), CD8, CD4, CD14 ve makrofajlar ve monositler için CD16, B hücreleri için, CD19 ve NK hücreleri için CD56 içerir.
12. 30 dakika süre ile 4 ° C'de inkübe edin.
13. Adım 3.9 olarak yıkayın ve FACS analizi için% 2 paraformaldehid hücreleri yeniden askıya.
14. Fareler rekonstitüe iseniz, tümör enjeksiyonları ile devam edin. İnsan lenfosit sulandırma seviyesi% 1'den az toplam kan hücrelerinin% 40 ile değişir. Lymphoc düzeyleri ve türleriYTE soy bir sağlıklı insan kan bağışında beklediğiniz karşılaştırılabilir. Ancak, do non-T hücre soylarının sayısında dalgalanmalar bekliyoruz. Sayıları 12 haftalık süre içinde kabul edilebilir değilse, adım 3.1 'den ikincil nakli prosedürünün tekrar olabilir.
15. Tümör hücre hatları üretici veya laboratuvar önerilerine göre kültüre. Hücreler, bir 1:1 oranında (50 ul cells/50 ul Matrigel), hasat yıkanmış ve Matrigel içinde tekrar süspanse edilir. Numuneler her zaman buz üzerinde tutulur.
16. Fareler anestezi uygulanmış ve enjeksiyon sahasında traş bulunmaktadır. Alanı bir izopropanol takımını kullanarak sterilize edilir. Önceden bir yardımcı yükler hücre süspansiyonları 23G 1 ml şırınga soğutulur. Tümör hücreleri deri altına enjekte edilir. Antibiyotik merhem ile enjeksiyon yerinde davranın. Tümörler kurmak ve 4 hafta içinde büyüyen başlamalıdır.

Vivo Pozitron Emisyon Tomografi (PET) B.

Çalışmalarımızda için biz sınavıine glikoz alımını ^{([18F]-florodeoksiglukoz ([18} F] FDG) Böylece farelerin önceden görüntüleme. MicroPET / CT taramaları için 4-6 saat oruç vardır microPET Inveon tarayıcı (Siemens Preklinik Çözümleri) ve MicroCATII BT tarayıcı (kullanılarak yapılır Siemens PreclinicalSolutions). Görüntü analizi OsiriX (Pixmeo, İsviçre) yazılımı kullanılarak yapılır. amacı, tümörün metabolik aktiviteyi ölçmek için ve sonuçta tümör gerilemesi fiziksel olarak ölçülmesi için bir alternatif olarak PET kullanılmasıdır. Şekil 2'de görüldüğü üzere, bu Fiziksel görünüm ve boyutuna göre bu tümörler karşılaştığım hedeflenmiş ama canlı PET'in geniş doku nekrozu saptandı değildir. Bu metodoloji tümör regresyonu daha hassas ve kesin bir göstergesi olarak hizmet verebilir.

1. Anestezi (% 2 isofluorane) fareler için bir odası ve PET tarama ("kamara") bekleme önce FDG 60 dk alınımı olarak bir odası atayın. Her iki mecliste de mavi pedleri yerleştirin.
2. Hayvanlar anesth olduğundanUzun süreler boyunca etized, bir mikrodalga ısındı ve ısı pedleri üzerinde kafesleri koyuyoruz su dolu eldiven kullanımı ile 30 ° C sıcak tutulmalıdır.
3. Bu çemberi için izofluran akışını açın. Izofluran odasına herhangi bir fare yerleştirmeden önce yaklaşık 5-10 dakika süreyle anestezi odasına dolmasını sağlayın. Kapağı izofluran sızıntı önlemek için sıkı kilitli ve kapalı olduğundan emin olun.
4. Anestezi odasına ilk fare yerleştirin ve sıkıca kapağını kilitlemek. 5-10 dk İzin Ver veya fare bilinçsiz kadar.
5. Anestezi odası, etiket fare kuyruğu (kafes başına farklı renk) gelen fareyi çıkarın ve intraperitonal fare enjekte ^[18 F] FDG (80 μCi). Fare enjekte edildi zaman not alın. Fare 10 dakika PET taraması için kurmak için izin, yine bu timepoint 50 dk anestezi olacak (60 dk toplam ^[18 F] PET tarama öncesi FDG tutulumu).
6. Izin bekleyen odasına enjekte Farenizi ^[18 F] PET tarama 1 saat önce için FDG tutulumu. Kapağını kilitlemek etmeyin. Hava akımı sağlamak için kapağı gevşek bırakın.
7. Hemen anestezi odasına FDG enjeksiyonu için sonraki fare yerleştirin. PET tarama işlemi 10 dakika olduğundan daha sonraki enjeksiyon fareler, 10 dakika aralıklı yerleştirilmiş olmalıdır. Tek bir fare tarandıktan hemen sonra, taranacak sonraki fare için 60 dk FDG tutulumu dışında tam 10 dk hazır olacak.
8. Anestezi ve adımları 7-9 belirtildiği gibi fareler enjekte devam edin.
9. (Hala uyutmak ve farelere enjekte devam ederken) birinci fare enjeksiyon timepoint 50 dk sonra tekrar anestezi odasına ilk enjekte fare yerleştirin.
10. Oksijen ve izofluran satırları fare yatakta bağlayın ve yatak üzerinde izofluran akışını açın. Yatakta mavi ped yerleştirin.
11. , Yatağa PET tarama için hazır Farenizi kollarını germe vebacaklar ve teyp ile bu konumda tutarak. Gözleri yağ koyun. Hayvan konumlandırma görüntüleme kalitesini etkileyebilir çünkü bu adımı çok önemlidir.
12. Izofluran ve oksijen borularını ayırın ve hızlı PET tarama makine yatağı monte edin. Izofluran ve oksijen hatları yerleştirin. Izofluran akışı PET tarama makine için açık olduğundan emin olun. PET tarama kablosunu takın ve tarama başlar.
13. PET taraması tamamlandıktan sonra ardından CT tarayıcı için hayvan taşımak. Bu tarama, ilgili kafesine hayvan taşımak izleyebiliriz.

Representative Results

Transplantasyon işlemin bir akış şeması Şekil 1A 'de gösterilmiştir. Senin / liv implantın bir resmi Şekil 1B 'de gösterilmiştir. Timik doku normal olarak geliştirir ve insan CD4 ve CD8 T hücrelerinin bir fizyolojik bir dağılıma sahiptir. Sulandırıldıktan sonra, hayvanlar CD4, CD8, T hücreleri ve diğer immün hücre soyları, normal dağılım ile bir insan bağışıklık sistemi taşırlar.

Tümör büyüklüğü ve canlı doku arasındaki fark Şekil 2 'de gösterilmiştir. BT (gri alan) in vivo PET görüntülemede büyük bir tümör büyümesi, ifade ederken, çoğunlukla nekrotik ve (Şekil 2) doku skar olduğunu gösterdi. Bu tümör regresyonu ve temizleme değerlendirmek için daha duyarlı ve doğru yol olarak PET görüntüleme programı çiziyor.

Şekil 1. MART-1 spesifik T hücreleri taşıyan kimerik farelerin üretimi için bu çalışmalarda kullanılan modifiye blt modelinde (a), şematik diyagram. Transdüksiyon ve otolog fetal karaciğer izole CD34 hücre dışı transdük gelen Thy / Liv implant yeniden inşa edildi. Transdük hücrelerin bir kısmı 4-6 hafta sonra fareler içine ışınlanmış dondurulur ve enjekte edilir. (B) humanize farelerde senin / liv implant temsilcisi görüntü. Implantlar fizyolojik bir doku dağılımı ve İHK ve akım sitometri figürler tarafından gösterildiği gibi CD4/CD8 oranları var. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2. Melanom tümör taşıyan bir fare bir PET ve CT görüntü.kırmızı renk çok sınırlıdır tümörün metabolik aktivite, gösterir iken gri alan tümörün fiziksel boyutunu gösterir.

Discussion

In vivo PET görüntüleme ile birleştiğinde modifiye BLT humanize fare modelinde kronik insan hastalıkları incelemek için güçlü araçlardır. Bu sistem blt fare modeli ve HIV araştırma için sınırlı kapsamı dışındadır gelişmeler alır. Buna ek olarak, bunların klinik ortamda ulaşmadan önce çeşitli gen tedavi protokolleri gibi teşhis yöntemleri incelemek hangi bir büyük bir sistemdir. Fareler karşı primatlar kullanarak düşük maliyet ile birleştiğinde ikincisi bu bir çok yararlı bir model sağlar.

PET görüntüleme teknolojisi bizim yaklaşımın etkinliğini değerlendirmek için izin verdi. Bu tümörün fiziksel ölçümler yaslanmaktadır edersek, transgenik T-hücreleri tarafından üretilen anti-tümör cevabının etki ardı olurdu. Geniş yara ve nekrotik doku, gerçekte ölü doku bir büyük tümörün görünüm verdi.

Sonuç olarak, bu modifiye edilmiş BLT fare m yararodel diğer hastalık modelleri ile uzatılabilir. Bazı dezavantajları hala farelerin kısa ömrü gibi devam ederken, bu in vivo insan bağışıklık test birçok açıdan değerlendirmek ve yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için çok güçlü bir araç olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx