Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

باستخدام الماوس BLT إنساني وساق الموديل خلية مقرها جين ورم العلاج

Published: December 18, 2012 doi: 10.3791/4181
Automatic Translation
1,2,3, 1,2, 1,2, 1,2, 4, 4, 1,2,3, 1,2,5
1Department of Medicine, Division of Hematology-Oncology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 2UCLA AIDS Institute, 3Eli & Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research at UCLA, 4Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, David Geffen School of Medicine at UCLA

Summary

ووصف جيل وتوصيف الخلايا السرطانية T معينة باستخدام الفئران أنسنة هنا. تزرع الأنسجة البشرية والغدة الصعترية المعدلة وراثيا خلايا الجذعية المكونة للدم في الفئران المناعة. هذه النتائج في إعادة تشكيل نظام المناعة البشري هندسيا يسمح لفحص الجسم الحي في المضادة للورم الاستجابات المناعية.

Abstract

وقد نماذج الحيوانات الصغيرة مثل الفئران المستخدمة على نطاق واسع لدراسة الأمراض التي تصيب البشر، وتطوير التدخلات العلاجية الجديدة. على الرغم من ثروة من المعلومات المكتسبة من هذه الدراسات، أدت الخصائص الفريدة للحصانة الماوس، فضلا عن خصوصية الأنواع من الأمراض الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) عدوى في تطوير نماذج الماوس أنسنة. النماذج السابقة ينطوي على استخدام الفئران C. B SCID / SCID (17) وزرع الغدة الصعترية الجنين البشري والكبد ووصف الجنين خاصتك / ليف (SCID هو جين تاو) 1 أو 2 أو نقل بالتبني من الكريات البيض الدموية المحيطية الإنسان (SCID-huPBL ) 3. واستخدمت أساسا كلا النموذجين لدراسة عدوى فيروس نقص المناعة البشرية.

كان واحدا من القيود الرئيسية على حد سواء من هذه النماذج عدم إعادة مستقرة من خلايا المناعة البشرية في محيط لجعلها نموذجا أكثر من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية مرض. تحقيقا لهذه الغاية، وهمهمة BLTتم تطوير نموذج الفأر anized. BLT تقف على نخاع العظام / الكبد / الغدة الصعترية. في هذا النموذج، من 6 إلى 8 أسابيع من العمر NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) الفئران المناعة تتلقى زرع خاصتك / ليف كما هو الحال في نموذج الفأر SCID هو جين تاو وبعدها من قبل الإنسان المكونة للدم 2 زرع للخلايا الجذعية 4. وميزة هذا النظام هو إعادة كامل من الجهاز المناعي البشري في الهامش. وقد استخدم هذا النموذج لدراسة فيروس نقص المناعة البشرية العدوى والكمون 5-8.

لقد ولدت لدينا نسخة معدلة من هذا النموذج التي نستخدم خلايا معدلة وراثيا الجذعية المكونة للدم (hHSC) لبناء زرع خاصتك / ليف تليها حقن ذاتي transduced hHSC 7 و 9. هذا النهج القائم على النتائج في توليد الأنساب المعدلة وراثيا. الأهم من ذلك، أننا تكييف هذا النظام لدراسة إمكانات توليد خلايا T السامة للخلايا وظيفية (CTL) تعبر عن خلية سرطان الجلد T مستقبلات محددة. باستخدام هذا النموذج كنا قادرين على تقييم وظيفة CTL لدينا المعدلة وراثيا باستخدام التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني الحية (PET) والتصوير لتحديد الانحدار الورم (9).

والهدف من هذا البروتوكول هو لوصف عملية توليد هذه الفئران المعدلة وراثيا وتقييم فعالية في الجسم الحي باستخدام التصوير PET الحية. كملاحظة، لأننا استخدام الأنسجة البشرية وناقلات lentiviral، مرافقنا تتفق مع المبادئ التوجيهية لمعاهد الصحة القومية CDC مستوى السلامة الأحيائية 2 (BSL2) مع اتخاذ احتياطات خاصة (BSL2 +). وبالإضافة إلى ذلك، يتم المناعة بشدة الفئران نيوز سيرفيسز جروب بالتالي، يجب الإسكان وصيانتها تتوافق مع أعلى معايير الصحة ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. الجيل من الفئران BLT

وينقسم الجيل من الفئران BLT إلى أجزاء (3) ثلاثة: (1) تجهيز الأنسجة الجنينية وإعداد CD34 الإنسان الخلايا الجذعية المكونة للدم، (2) زرع الأنسجة البشرية، و (3) زرع الثانوية. لجميع البروتوكولات، قدمنا ​​الجدول 1 المعلومات مع كاشف.

1. معالجة الأنسجة وعزل خلايا CD34 الجذعية المكونة للدم

ويمكن استخدام أنسجة الجنين أو الأنسجة الطازجة التي يتم شحنها بين عشية وضحاها على الجليد من مختلف وكالات المشتريات الجهاز. في كثير من الأحيان الأنسجة الجنينية ليست عقيمة، كما يتضح من الإنتاج من 1،000 المستعمرات البكتيرية على أجار الدم في الملليمتر الواحد من المحيط المتوسط. ونحن عادة غسل النسيج مرتين في 40 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. في حين أن هذا لا يزيل كل البكتيريا، يمكن أن تحدث فرقا بين سلسلة زرع ناجحة والنتيجة التي معظم الفئران المتلقية الخضوع لالبكتيرية فيfection. كخطوة إضافية، لتطهير أنسجة أخرى، ونحن الثقافة تعليق خلية في وجود المضادات الحيوية.

1،1 التحميل من الأنسجة التوتة الجنينية

  1. غسل الغدة الصعترية عن طريق سكب قبالة المتوسطة في كوب من المبيض باستخدام مشرط ومنع الأنسجة من الانزلاق في التبييض. تملأ أنبوب مع PBS. الغطاء وقلب عدة مرات لغسل الغدة الصعترية. صب الطافي في التبييض. تكرار.
  2. وضع الأنسجة الغدة الصعترية في 8 مل من RPMI + 10٪ مصل العجل الجنين في طبق 60 ملم والقص إلى قطع 1،5 حتي 2 مم مع اثنين من المشارط. قص مع المشارط يقلل تمزيق وإتلاف الأنسجة بت. الأنسجة التالفة تميل إلى أن تصبح منتفخة، لزجة، ويصعب رسم في إبرة الزرع. عدد وحدات البت التي تم الحصول عليها هي الحد الأول العلوي على الفئران زرع.
  3. نقل البتات مع وقف التنفيذ الماصة مل 25 (للتقليل من تلف الأنسجة) في قارورة T25. إضافة 70 ميكرولتر من piptazo (Zosyn) إلى قارورة والثقافة بين عشية وضحاها، 2. هذا يقلل إلى حد كبير البكتيريا الملوثة. إذا كنت ترغب في القيام بكتابة الأنسجة أو أي فحوصات أخرى phenotyping، واخراج 1 مل من الخلايا.

1،2 التحميل من أنسجة الكبد الجنين

  1. يغسل الكبد كما في الخطوة 1.1.1.
  2. إضافة 10 مل من كل شيء Iscove في المتوسط ​​وصب في طبق بتري ملم 100.
  3. مع اثنين من المشارط، الزهر الكبد إلى قطع (~ 3 مم) الصغيرة. إذا قمت بتشغيل إلى النسيج الضام الأبيض، تتخلص منه في الكبد وتخلص منه في التبييض.
  4. تجانس الأنسجة ويمتص قبل أن تتحول إلى حقنة مل 12 مزودة إبرة قياس 16 3 صريحا أو 4 مرات ونقل إلى أنبوب 50 مل.
  5. إعداد الأنزيمات لهضم الأنسجة على النحو التالي: ل10 مل من لIscove في أنبوب 50 مل، أضف 200 ميكرولتر من كل من: كولاجيناز النوع الرابع (1 ملغ / مل)، هيالورونيداز (1 ملغ / مل)، الدناز I (2 U / مل).
  6. رسم الانزيمات في حقنة مل 12 و تناسب مع مرشح μ 0.22. تصفية enzyلي / متوسطة مباشرة في التعليق الخلية.
  7. وختم غطاء الخلايا مع Parafilm. تدوير في C ° 37 لمدة 90 دقيقة.
  8. إنشاء أنبوب 50 مل مع مصفاة μ الخلية 100. الماصة الخلية هضم من خلال هذه المصفاة.
  9. إضافة إلى الخلايا PBS لتبرزي حجم ما يصل الى 50 مل. تقسيم هذا إلى قسمين أنابيب من 25 مل.
  10. الأساس الذي تقوم عليه الخلايا مع 10 مل من Ficoll. تدور في 2400 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة دون فرامل.
  11. يجب أن تكون سميكة واجهة. تمتص بها مع الماصة 5 مل ونقل إلى أنبوب آخر. يجب أن يكون لديك اثنين من أنابيب واجهة. إضافة 50 مل من برنامج تلفزيوني لكل وتدور في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
  12. الجمع بين الكريات في أنبوب واحد ويغسل ثلاث مرات أكثر مع PBS تحتوي على 2٪ FCS.
  13. تعليق وأخيرا في 50 مل من RPMI + FCS 10٪ والخلايا العد باستخدام التريبان الأزرق. اعتمادا على حجم الأنسجة، ويمكنك الحصول عليها من خلايا الكبد ل10 8 9 10 المجموع.
  14. نقل الخلايا إلى قارورة T150 وإضافة 30 مل من RPMI + 10٪ FCS وم 0،8لتر من piptazo.
  15. احتضان لمدة 1 1.5 ساعة عند 37 ° C لإزالة الخلايا الملتصقة.

1،3 الفرز وتنبيغ من خلايا الجذعية المكونة للدم CD34

  1. بعد الحجز على الخلايا في الخطوة 1.2.15، تستنهض الهمم القارورة بلطف ذهابا وإيابا لمدة دقيقة لطرد الخلايا فضفاضة. سيكون هناك الكثير من الخلايا الليفية وتمسك هذه إلى السطح.
  2. عد مرة أخرى باستخدام التخفيف 1 حتي 20 وسجل العدد الإجمالي للخلايا. حفظ بضعة أعشار من مل لتلطيخ في وقت لاحق. يجب أن يكون أقل الخلايا٪ من نحو 30 تهمة صومعتك الأولية (الخطوة 1.2.13).
  3. تدور باستمرار وغسل مرتين مع 40 مل من العازلة MACS.
  4. يتم تصنيف CD34 الخلايا باستخدام التكنولوجيا الحيوية في Miltenyi CD34 كيت المباشر. ونحن نتابع بالضبط بروتوكول الشركة المصنعة باستخدام أعمدة LS التي تقدمها الشركة نفسها.
  5. سوف تسترد الخلايا يكون في 5 مل. عد وحساب مجموع الخلايا. يجب أن العائد الخاص من الخلايا CD34 + يكون 3-5٪ من إجمالي تعداد صومعتك. هذا يختلف مع ال(ه) من عمر الجنين الكبد. كبد الجنين الأصغر سنا يميلون إلى إعطاء عائدات أعلى من الخلايا CD34 +.
  6. تقسيم عدد من الخلايا 1x10 6. هذا يعطي الحد الثاني على الفئران العليا للزرع.
  7. عد CD34-الكسر (من خلال تدفق ويغسل) والاحتياطي 6 إلى أن زرع × 10 6 في الماوس. هذه الخلايا الثقافة بين عشية وضحاها في 50 إلى 80 مل من RPMI + 10٪ مصل العجل الجنين + piptazo 1٪.
  8. تنبيغ الخلايا CD34 + ليلة وضحاها مع ناقلات lentiviral الخاص. نستخدم retronectin من تاكارا باتباع إرشادات الشركة المصنعة تماما.
  9. في اليوم التالي، والحصاد الخلايا CD34، CD34 + بالنقل والخلايا والعد.
  10. تقسيم خلايا CD34 + في نصف: الجزء A والجزء B.
  11. تدور أسفل الجزء A + CD34 الخلايا transduced وتعليق في 4 إلى 6 مل من المتوسط ​​التجمد (+ 10٪ RPMI FCS + 10٪ DMSO، 0.22 μ العقيمة التي تمت تصفيتها). ضع 1 مليلتر مأخوذة في قارورة وتجميد التسمية مع "huFetalCD34"، وعدد من الخلايا في قارورة، وتاريخ، والأحرف الأولى من اسمك.
  12. لكل الماوس مزيج 0.5x10 6 الجزء B + CD34 transduced الخلايا و4.5x10 6 خلايا CD34 في أنبوب العقيمة microfuge المسمار كأب، وبيليه والحفاظ على الجليد. ذوبان الجليد أيضا أنبوب من Matrigel (BD العلوم البيولوجية) على الجليد. يجب أن تبقى كل هذه الأنابيب على الجليد حتى استخدام (اذهب إلى الخطوة 2.10).

2. زراعة الأنسجة

الهدف من هذه الخطوة هو زرع الجنين في الغدة الصعترية الإنسان / عضي الكبد تحت كبسولة الكلى NSG الماوس. هذا عضي يحاكي أفضل عملية تحديد الخلية البشرية والعمليات T نضوج خلايا الإنسان كما الجذعية المكونة للدم سوف تستخدم الغدة الصعترية الإنسان وليس الماوس كموقع للتمايز الخلايا T لمختلف الأنساب واللمفاوية الأخرى. استخدام خلايا CD34 في عملية زرع هو إعادة توليد الجنين سدى الكبد والسماح للأفضل زرع ونمو الزرع. عمر الفئران NSG المستخدمة هي 6-8 أسابيع من العمر.

  1. إعداد الأدوية لسوrgery:
    1. Isoflurane: نشمر على الشاش 2 بوصة والاشياء في أنبوب الطرد المركزي 15 مل screwcap. صب في حوالي 1 مل من isoflurane مباشرة من الزجاجة.
    2. الكيتامين / zylazine: إضافة 0،52 مل من الكيتامين (Ketaset) (100 ملغ / مل) و0،52 مل من زيلازين (Anased) (100 ملغ / مل) إلى قارورة 20 مل من المياه المالحة للحقن. التسمية مع تاريخ انتهاء الصلاحية من أقرب عنصر تنتهي والحفاظ على تجميدها في -20 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
    3. كاربروفين (Rimadyl). تمييع هذا قبل إجراء العمليات الجراحية. تمييع 1:100 من خلال سحب 0.1 أو 0.2 مل من القارورة مع حقنة 1 مل وإبرة 25G. يحقن في 10 مل أو 20 من المياه المالحة للحقن. التسمية والتاريخ. نضع في الثلاجة لمدة يوم واحد فقط. تحميل إلى 3 مل الحقن الإبر مع 25G.
  2. إعداد جدول لعملية جراحية. تغطية ذلك مع منصات الزرقاء العقيمة، ومنشفة معقمة في كل الجراح. كل الجراح يحصل من مربع الأدوات المعقمة الخاصة بهم: 4 "مقص، ملقط المنحني حادة، والحاجةLE-الأنف ملقط، مرقئ، 16G trochar أضعفت، والجرح قضيب كليب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تحتاج إلى خياطة Vicryl المنحني إبرة، كومة من الأيزوبروبانول مسح الحزم، طبق بتري 35 مم من PBS، وحقنة 1 مل مليئة PBS.
  3. تعيين في منتصف الجدول جرة Coplin الزجاج مع 2 سم من Betadine ومسحات القطن 2. صب بت الغدة الصعترية في طبق بتري 60 مم.
  4. يتم تنفيذ التخدير على طاولة منفصلة أو في غطاء محرك السيارة مغطاة منصات الزرقاء العقيمة. إنشاء شركتين رفوف صغيرة وموازين الكترونية مع كوب لعقد الفئران. استخدام واحد رف لعقد 0.5 مل المحاقن الأنسولين 28G X محملة الكيتامين / زيلازين والآخر لعقد الحقن مل 3 من كاربروفين. أيضا نقل حاوية النفايات بيولوجية بالقرب من الاستمرار على حلق الفراء.
  5. تزن كل الفئران (6-8 الاسبوع القديمة) في قفص للحصول على متوسط ​​وزن حمولة والحقن بجرعة من 15 ميكرولتر / غرام من الكيتامين / زيلازين. حقن الفئران جميع في القفص.
  6. بعد الفئران تصبح بطيئة يحلق بهم LEFر الجانب من الورك إلى جنب بين وسط الظهر والبطن مع اوستر مع شفرة المقص 40 رقم. تسجيل وزنهم، وآذانهم لكمة الترقيم.
  7. حقن 0.3 مل تحت الجلد كاربروفين على الكتف.
  8. تحقق من مستوى التخدير من الماوس عن طريق الضغط على مخلب. إذا كان الماوس الجفلات وإدارة isoflurane من أنبوب لحوالي 12 ثانية. ثم حاول الضغط مخلب مرة أخرى. الحفاظ على إعطاء لقطات قصيرة من isoflurane حتى يختفي منعكس مخلب. وضع الماوس على جانبها الأيمن تواجه اليسار.
  9. ويستخدم زرع السرطان 16-قياس الإبرة، مع تلميح الجولة قدم لإدراج الأنسجة. طرد trochar عدة مرات في طبق من PBS. عقده مع قضيب أفقي فقط داخل الإكراميات. إضافة قطعة من التوتة مع ملقط needlenose وتمتص فيه.
  10. A المساعد يضيف 5 ميكرولتر من Matrigel الباردة إلى أنبوب واحد من الخلايا (خطوة 1.3.12) مع التشرد إيبندورف الماصة إيجابية، ويمزج بواسطة التحريك لطيف. الجراح الحولDS في trochar أفقيا وتسحب قضيب العودة ببطء والمساعد pipets المزيج Matrigel في trochar. هذا المزيج شتاتها في درجة حرارة الغرفة.
  11. مسحة الجلد العارية مع Betadine. ثم يمسح هذا الخروج مع الأيزوبروبانول القضاء. تكرار.
  12. تحديد موقع الطحال تحت الجلد. ومن أظلم بقعة. يقع الكلى الماوس، حوالي 5 ملم الظهرية إلى الطحال، وهو ما يمكن ملاحظته من خلال الجلد حلق.
  13. التقاط الجلد فوق هذه البقعة مع ملقط حادة ونجعل بالتوازي قطع الطحال إلى حوالي 15 ملم طويلة. جعل خفض مماثل في الصفاق طبقة العضلات أدناه. في الذكور، ينبغي أن تكون واضحة مباشرة الكلى وكان لديك ببساطة للضغط على البطن لموسيقى البوب ​​من ذلك. في الإناث، قد يكون لديك لالتقاط المبيض مع مرقئ واسحب للخارج الكلى. وهذا قد يساعد الإبقاء على الكلى خارج الجسم. للذكور، سيكون لديك للحفاظ على بعض الضغط على البطن بيدك اليسرى للحفاظ على الكلى عرضة للخطر.
  14. نتف فتحة صغيرة في posterioR نهاية كبسولة الكلى. قد تنزف قليلا.
  15. حرك trochar في هذا الثقب وعلى طول الكلى حتى يتم تغطيتها بالكامل من فتحة trochar بواسطة الكبسولة الكلى. ثم باستخدام الاصبع الصغير من يدك اليمنى، حقن الأنسجة.
  16. دفع برفق مرة أخرى في الكلى مع مرقئ مغلقة. وضع واحد في غرزة الصفاق تعادل مع يعرف مزدوجة. ضغط على الجلد واقفا مثل محفظة وضعت في الجرح مقاطع اثنين.
  17. وضع قطرة من PBS على كل عين ووضع الماوس على جانبها على الفراش القفص. تأكد من أن جميع الفئران عادوا إلى زرع على بطونهم قبل أن يتركهم.
  18. اليوم التالي، وإعطاء فرصة أخرى لكل من الماوس كاربروفين.

3. زرع الثانوية

الهدف من هذه الخطوة في توليد فئران BLT هو لتجميع نخاع العظم moue مع خلايا الجذعية المكونة للدم. عملية الزرع المزروع من الإجراء (2) ليست كافية لدعم إعادة كامل من اله نظام المناعي للانسان في هذه الفئران. خلال زرع الثانوية، ونحن شبه قاتل أشرق الفئران الفئران في استنزاف خلايا نخاع العظام مما يولد "الفضاء" لزرع الخلايا البشرية + CD34.

  1. أربعة إلى ستة أسابيع في وقت لاحق أشرق الفئران مع 2.7 غراي. يتم حقن الفئران في اليوم نفسه مع الجزء A + CD34 الخلايا transduced. ويستند الإطار الزمني على إنشاء ونمو الزرع خاصتك / ليف زرع في الخطوة 2. عادة، وخلال هذا الوقت نمت بشكل كبير مما يسمح لنا زرع للشروع في الخطوات التالية.
  2. ذوبان الجليد من الجزء A + CD34 الخلايا transduced، وغسل ووقف في وسط لتركيز 5x10 6 / مل.
  3. تحميل 0.5 مل الحقن X الأنسولين 28G مع 0.1 مل من الخلايا (10 5 إلى 5x10 5 خلايا لكل 0.1 مل لكل الماوس) لمدة قفص من الفئران (كل قفص يحتوي على الحد الأقصى من 5 الفئران) ويضعونها على الرف تواجه بعيدا.
  4. تخدير ماوس مع أنبوب isoflurane من scruffing ذلك وعقد لهالأنف في أنابيب لمدة 20 ثانية. عد لتتبع الوقت.
  5. يواجه بعد ذلك إلى الحق، وسحب الجلد حول عنقه ضيق مع الإبهام والسبابة من اليد اليسرى. اضغط تحت الفك مع مكتشف الخاص العين الثالثة بحيث حقها تضخمات. عقد حقنة موازية للمحور طويلة من رأس الفأر، زلة الإبرة وراء العين وحرك برفق حتى تتوقف. لا تضغط أكثر من ذلك، ولكن حقن تحميل أكثر من حوالي 2 ثانية.
  6. شهرين إلى ثلاثة أشهر في وقت لاحق ونزف الفئران باستخدام ماصات retroorbitally EDTA الزجاج المطلي. يمكنك أن تأخذ فقط بحد أقصى 200 ميكرولتر من الدم شهريا لكل الماوس. يجب 50-100 ميكرولتر من الدم تكون كافية لتحليل FACS. استراتيجيات بديلة تشمل النزيف ينزف وينزف الوريد الوجه الوريد الذيل. سوف تعطيك هذه الأخيرة كميات صغيرة جدا من الدم قد لا تكون كافية لفحوصات متعددة.
  7. هي ملطخة عينات الدم للتعبير عن علامة في اللمفاويات البشرية لتقييم إعادة CD45. Bوأضاف عينات lood في 1 مل العازلة تحلل الخلايا الحمراء في الدم (160 ملي NH 4 الكلورين، 100 مم KHCO 3، 0.01 مم EDTA) وحضنت لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. غسل الخلايا في المخزن المؤقت تحلل، 5 دقائق في 1200 دورة في الدقيقة، وكرر إذا لزم الأمر.
  9. أجهزة الطرد المركزي الخلايا كما في 3.8 ويغسل في برنامج تلفزيوني تستكمل مع مصل العجل 3٪ الجنين (FACS-PBS).
  10. إزالة طاف واعادة تعليق الكريات في 100 ميكرولتر PBS-FACS.
  11. إضافة أجسام مضادة لتقييم إعادة اللمفاويات البشرية. ندرج عادة CD45 التالية (علامة اللمفاويات البشرية)، CD8، CD4، CD14 CD16 وحيدات والبالعات الكبيرة ل، CD19 للخلايا B والخلايا NK لCD56.
  12. احتضان في C ° 4 لمدة 30 دقيقة.
  13. يغسل كما في الخطوة 3.9 و اعادة تعليق الخلايا في بارافورمالدهيد 2٪ للتحليل FACS.
  14. إذا أعيد الفئران، ونحن المضي قدما في حقن الورم. إعادة مستويات من الخلايا الليمفاوية البشرية تختلف، من٪ 1 إلى أقل من 40٪ من مجموع خلايا الدم. مستويات وأنواع lymphocالأنساب YTE قابلة للمقارنة مع ما هو متوقع من الأصحاء المتبرعين بالدم الإنسان. ومع ذلك، لا نتوقع تقلبات في عدد الخلايا غير الأنساب-T. إذا كانت الأرقام غير مقبول في الإطار الزمني لمدة 12 أسبوعا هل يمكن تكرار عملية لزراعة الثانوية من الخطوة 3.1.
  15. يتم استزراع خطوط الخلايا السرطانية وفقا لتوصيات الشركة المصنعة أو المختبر. ويتم حصاد الخلايا، وغسلها ومعلق في matrigel في نسبة 1:1 (50 ميكرولتر cells/50 matrigel ميكرولتر). يتم الاحتفاظ عينات على الجليد في جميع الأوقات.
  16. الفئران هي تخدير وحلق في منطقة الحقن. يتم تعقيم المنطقة باستخدام لوحة الأيزوبروبانول. A تبريد تعليق خلية المساعد الأحمال في مرحلة ما قبل الحقن 23G 1 مل. يتم حقن الخلايا السرطانية تحت الجلد. علاج مكان الحقن مع مرهم مضاد حيوي. يجب أن تبدأ الأورام إنشاء ونموا في 4 أسابيع.

B. في الجسم الحي البوزيترون الطبقي لانبعاثات (PET)

لدراساتنا نحن الامتحانالمعهد الوطني للإحصاء امتصاص الجلوكوز ([18 F]-fluorodeoxyglucose ([18 F] FDG) وهكذا صام والفئران 4-6 ساعة قبل التصوير بالاشعة MicroPET / CT. تتم باستخدام الماسح الضوئي Inveon microPET (سيمنز حلول ما قبل السريرية) والماسح الضوئي CT MicroCATII ( PreclinicalSolutions سيمنز). يتم تحليل الصور باستخدام سيريكس (Pixmeo، سويسرا) والبرمجيات. والهدف هو قياس النشاط الأيضي للورم وبالتالي لاستخدام التصوير PET كبديل لقياس جسديا الانحدار الورم. كما يتضح في الشكل 2، ونحن لقد واجهت الأورام التي تقوم على المظهر الخارجي والحجم لا تستهدف إلا أن يعيش التصوير PET كشفت واسعة نخر الأنسجة. هذه المنهجية يمكن أن تكون بمثابة مؤشر أكثر حساسية ودقة من الانحدار الورم.

  1. تعيين غرفة واحدة للفئران التخدير (2٪ isofluorane)، وغرفة واحدة وامتصاص 60 دقيقة من FDG PET المسح قبل ("انتظار الغرفة"). وضع منصات الأزرق في كلا المجلسين.
  2. كما الحيوانات anesthetized على مدى فترات طويلة، يجب أن تظل دافئة في C ° 30 من خلال استخدام قفازات المياه التي يتم شغلها استعد في الميكروويف ووضع أقفاص على منصات الحرارة.
  3. تحويل تدفق isoflurane لهذه القاعة جرا. السماح للisoflurane لملء غرفة التخدير لحوالي 5-10 دقيقة قبل وضع أي الفئران في الغرفة. تأكد من تأمين غطاء ومغلقة بإحكام لتجنب تسرب isoflurane.
  4. ضع الماوس لأول مرة في غرفة التخدير وقفل الغطاء بإحكام. السماح 5-10 دقيقة أو حتى الماوس فاقد الوعي.
  5. إزالة الماوس من غرفة التخدير، والتسمية ذيل الماوس (لون مختلف لكل قفص) وحقن الغشاء البريتونى مع الماوس [18 F] FDG (80 μCi). يحيط علما الوقت تم حقن الماوس. الماوس ستكون تخدير مرة أخرى 50 دقيقة من هذا timepoint، والسماح لمدة 10 دقيقة لإعداد مسح PET ل(لمجموعه 60 دقيقة [18 F] FDG امتصاص قبل المسح PET).
  6. ضع الماوس حقنها في غرفة الانتظار، مما يسمح [18 F] FDG امتصاص ل1 ساعة قبل الفحص PET. لا قفل الغطاء. ترك غطاء فضفاض لتسمح بتدفق الهواء.
  7. ضع الماوس على الفور المقبل للحقن FDG إلى غرفة التخدير. وينبغي متباعدة اللاحقة الفئران حقن 10 دقيقة بعيدا، لأن عملية المسح PET هو 10 دقيقة. مباشرة بعد يتم تفحص الماوس واحد، وامتصاص ال 60 دقيقة للFDG الماوس القادمة التي يتم مسحها ضوئيا تكون جاهزة تماما 10 دقيقة بعيدا.
  8. مواصلة تخدير الفئران عن طريق الحقن وكما هو مذكور في الخطوات 7-9.
  9. بعد 50 دقيقة من الحقن الأولى timepoint الماوس، ضع الماوس 1 حقنها في غرفة التخدير مرة أخرى (في حين لا تزال مستمرة لتخدير وحقن الفئران).
  10. توصيل الماوس إلى سرير الأكسجين وخطوط isoflurane، وتحويل تدفق isoflurane على لسرير. وضع وسادة زرقاء على السرير.
  11. ضع الماوس على استعداد لمسح PET على السرير، وتمتد الذراعين والساقين وعقد هذا الموقف مع الشريط. وضع مواد التشحيم في العيون. هذه الخطوة هي الأكثر أهمية منذ تحديد المواقع للحيوان يمكن أن تؤثر على جودة التصوير الخاصة بك.
  12. فصل خطوط isoflurane والأكسجين، وجبل السرير بسرعة على الجهاز مسح PET. وضع خطوط isoflurane والأكسجين. تأكد من تدفق isoflurane على المسح الضوئي للجهاز PET. قم بتوصيل كبل مسح PET والبدء في الفحص.
  13. وبمجرد أن المسح PET اكتمال ثم نقل الحيوانات إلى الماسح الضوئي CT. وبعد هذا الفحص نقل الحيوانات إلى القفص الخاص به.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد الرسم البياني لعملية زرع في الشكل 1A. ويظهر صورة لزرع خاصتك / ليف في الشكل 1B. نسيج الغدة الصعترية يتطور بشكل طبيعي ويحتوي على توزيع الفسيولوجية للCD4 CD8 خلايا الإنسان وT. بعد إعادة، والحيوانات تحمل نظام المناعة البشري مع التوزيع العادي للCD4، CD8 خلايا T وغيرها من الأنساب الخلايا المناعية.

ويظهر التفاوت بين حجم الورم والأنسجة الحية في الشكل 2. في حين أن الاشعة المقطعية (المنطقة الرمادية) تدل على نمو الورم كبير، في الجسم الحي التصوير PET أظهرت أن معظمهم كان نخرية وندبة الأنسجة (الشكل 2). وهذا يؤكد فائدة التصوير PET كوسيلة أكثر حساسية ودقة لتقييم الانحدار الورم وإزالة الألغام.

الشكل 1 الشكل 1 (A) A الرسم التخطيطي لطراز BLT تعديل المستخدمة في هذه الدراسات لتوليد فئران تحمل خيالية MART الخلايا T-1 محددة. أعيد بناؤها في زرع خاصتك / ليف من transduced وغير transduced الخلايا معزولة عن CD34 الكبد والجنين ذاتي. يتم تجميد جزء صغير من الخلايا transduced وحقنها في الفئران المعرضة للإشعاع 4-6 أسابيع في وقت لاحق. (B) صورة ممثل زرع خاصتك / ليف في الفئران أنسنة. يزرع لديها توزيع الأنسجة الفسيولوجية ونسب CD4/CD8 كما يتضح من الأرقام IHC والتدفق الخلوي. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. صورة PET CT وعلى فأرة الحاسوب يحمل الورم القتامي. الالمنطقة الرمادية يشير إلى الحجم الفعلي للورم في حين أن اللون الأحمر يدل على النشاط الأيضي الورم، الذي محدودة جدا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتعديل نموذج BLT الماوس أنسنة جانب التصوير في الجسم الحي PET هي أدوات قوية لدراسة الأمراض التي تصيب الإنسان المزمن. هذا النظام يأخذ نموذج الفأر والسلف BLT يخرج عن نطاق محدود للبحوث فيروس نقص المناعة البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه هو نظام الكبير الذي يمكننا دراسة مختلف بروتوكولات العلاج الجيني وكذلك تقنيات التشخيص قبل أن يتمكنوا من الوصول إلى إعداد سريرية. هذا الأخير بالإضافة إلى انخفاض تكلفة استخدام الفئران مقابل قرود يجعل هذا النموذج مفيد جدا.

سمح للتكنولوجيا التصوير PET لنا لتقييم فعالية نهجنا. إذا اعتمدنا فقط على القياسات البدنية للورم، لأننا التقليل من فاعلية للاستجابة انتيتومور التي تم إنشاؤها بواسطة الخلايا T دينا المعدلة وراثيا. وتندب واسعة والأنسجة نخرية أعطى ظهور ورم كبير، والذي كان في الواقع الأنسجة الميتة.

في الختام، الأداة المساعدة من م المعدلة الماوس BLTويمكن تمديد odel لنماذج مرض آخر. في حين أن بعض عيوب لا تزال قائمة مثل أقصر عمر الفئران، وهذا يمكن أن يكون أداة قوية جدا لفي الجسم الحي تقييم جوانب كثيرة من مناعة الإنسان، واختبار وتطوير التدخلات العلاجية الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نود أن نشكر ألفين وولش بانغ لاري للحصول على المساعدة التقنية. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) جائزة P50 CA086306، ومعهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) منح RC1-00149-1 وRS1-00203-1؛ CIRM جائزة كلية جديدة RN2-00902-1 ، المركز المشترك معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا، جامعة كاليفورنيا للطب بالحركة، UCLA مركز لأبحاث الإيدز (CFAR) NIH / NIAID AI028697، والإيدز UCLA المعهد، وأدوات CIRM وجائزة التكنولوجيا RT1-01126، وبحوث Multicampus برنامج UC والمبادرات من كاليفورنيا مركز لاكتشاف الأدوية المضادة للفيروسات (عدد MRPI-143226).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Invitrogen 10010049
RPMI 1640 A1049101
Iscove's 12440061
Fetal Calf Serum 16000085
Collagenase type IV Sigma Aldrich C5138
Hyaluronidase H3506
DNAse I Roche Diagnostics 10104159001
Piptazo (Zosyn) Pfizer Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus) Ge Healthcare Life Sciences 17-1440-02
MACS Buffer Miltenyi Biotech See comments MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit 130-046-702
LS Columns 130-042-401
Retronectin Takara T100A
Matrigel BD Biosciences 354263
Isofluorane Baxter http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl) Pfizer Animal Health https://www.rimadyl.com/default.aspx

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McCune, J. M., Namikawa, R., Kaneshima, H., Shultz, L. D., Lieberman, M., Weissman, I. L. The SCID-hu mouse: murine model for the analysis of human hematolymphoid differentiation and function. Science. 241 (4873), 1632-1639 (1988).
  2. Bristol, G. C., Gao, L. Y., Zack, J. A. Preparation and maintenance of SCID-hu mice for HIV research. Methods. 12 (4), 343-347 (1997).
  3. Mosier, D. E., Gulizia, R. J., Baird, S. M., Wilson, D. B. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 335 (6187), 256-259 (1988).
  4. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nat. Med. Melkus, M. W., Estes, J. D., Padgett-Thomas, A., Gatlin, J., Denton, P. W., Othieno, F. A., Wege, A. K., Haase, A. T., Garcia, J. V. 12 (11), 1316-1322 (2006).
  5. Denton, P. W., Estes, J. D., Sun, Z., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Powell, D. A., Payne, D., Haase, A. T., Garcia, J. V. Antiretroviral pre-exposure prophylaxis prevents vaginal transmission of HIV-1 in humanized BLT mice. PLoS Med. 5 (1), e16 (2008).
  6. Sun, Z., Denton, P. W., Estes, J. D., Othieno, F. A., Wei, B. L., Wege, A. K., Melkus, M. W., Padgett-Thomas, M. W. Intrarectal transmission, systemic infection, and CD4+ T cell depletion in humanized mice infected with HIV-1. J. Exp. Med. 204 (4), 705-714 (2007).
  7. Shimizu, S., Hong, P., Arumugam, B., Pokomo, L., Boyer, J., Koizumi, N., Kittipongdaja, P., Chen, A., Bristol, G., Galic, Z., Zack, J. A., Yang, O., Chen, I. S., Lee, B., An, D. S. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  8. V, J. Generation of HIV Latency in Humanized BLT Mice. J. Virol. 86 (1), 630-634 (2012).
  9. Vatakis, D. N., Koya, R. C., Nixon, C. C., Wei, L., Kim, S. G., Avancena, P., Bristol, G., Baltimore, D., Kohn, D. B., Ribas, A., Radu, C. G., Galic, Z., Zack, J. A. Antitumor activity from antigen-specific CD8 T cells generated in vivo from genetically engineered human hematopoietic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (51), 1408-1416 (2011).

Tags

بيولوجيا السرطان، العدد 70، بيولوجيا الخلايا الجذعية، علم المناعة، الهندسة الطبية الحيوية، والطب، الهندسة الحيوية، علم الوراثة، علم الأورام، الفئران إنساني، زرع الخلايا الجذعية، والخلايا الجذعية،
باستخدام الماوس BLT إنساني وساق الموديل خلية مقرها جين ورم العلاج
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, … More

Vatakis, D. N., Bristol, G. C., Kim, S. G., Levin, B., Liu, W., Radu, C. G., Kitchen, S. G., Zack, J. A. Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model. J. Vis. Exp. (70), e4181, doi:10.3791/4181 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter