Brug af BLT Humaniseret Mouse som en stamcelle baseret genterapi tumormodel

Summary

Generering og karakterisering af tumorspecifikke T-celler under anvendelse af humaniserede mus er beskrevet her. Humant thymisk væv og genetisk modificerede humane hæmatopoietiske stamceller transplanteres ind immunkompromitterede mus. Dette resulterer i rekonstituering af et manipuleret humant immunsystem muliggør in vivo undersøgelse af anti-tumor immunrespons.

Abstract

Små dyremodeller, såsom mus er blevet flittigt brugt til at studere sygdom hos mennesker og udvikle nye terapeutiske indgreb. Trods det væld af information opnået fra disse studier, de unikke egenskaber muse immunitet samt artsspecificitet af virale sygdomme, såsom humant immundefektvirus (HIV)-infektion har ført til udviklingen af ​​humaniserede musemodeller. De tidligere modeller involveret anvendelse af C. B 17 scid / scid mus og transplantation af humane føtale thymus betegnet og føtal lever thy / liv (SCID-hu) ^{1, 2} eller den adoptive overførsel af humane perifere blodleukocytter (SCID-huPBL ) ^3. Begge modeller blev hovedsagelig anvendt til undersøgelse af HIV-infektion.

En af de vigtigste begrænsninger af begge disse modeller var manglen på stabile rekonstituering af humane immunceller i periferien for at gøre dem mere fysiologisk relevant model til at studere HIV-sygdom. Til dette formål BLT humanized musemodel er udviklet. BLT står for knoglemarv / lever / thymus. I denne model gamle 6 til 8 uger NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunkompromitterede mus modtager thy / liv implantat som i SCID-hu muse-modellen kun at blive efterfulgt af en anden human hæmatopoietisk stamcelletransplantation ^4. Fordelen ved dette system er fuldstændig rekonstituering af det humane immunsystem i periferien. Denne model er blevet anvendt til at undersøge HIV-infektion og latens ^5-8.

Vi har genereret en modificeret udgave af denne model, som vi bruger genetisk modificerede humane hæmatopoietiske stamceller (hHSC) at konstruere thy / liv implantat efterfulgt af injektion af transducerede autologe hHSC ^{7, 9.} Denne fremgangsmåde resulterer i frembringelsen af ​​genetisk modificerede linier. Mere vigtigt har vi tilpasset dette system til at undersøge potentialet af at generere funktionelle cytotoksiske T-celler (CTL), der udtrykker et melanom specifik T-cellereceptor. Brug af denne model var vi i stand til at vurdere funktionaliteten af ​​vores transgene CTL udnytte levende positronemissionstomografi (PET) scanning for at bestemme tumor regression (9).

Målet med denne protokol er at beskrive processen med at frembringe disse transgene mus og vurdere in vivo-effektivitet ved hjælp af levende PET-billeddannelse. Som en note, da vi bruger humane væv og lentivirusvektorer vores faciliteter i overensstemmelse med CDC NIH retningslinier for biosikkerhedsniveau 2 (BSL2) med særlige forholdsregler (BSL2 +). Hertil kommer, at NSG musene alvorligt immunkompromitterede derfor skal deres boliger og vedligeholdelse opfylder de højeste sundheds-standarder ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Frembringelse af BLT mus

Frembringelsen af ​​BLT mus er opdelt i tre (3) dele: (1) behandling af fostervæv og forberedelse af CD34 humane hæmatopoietiske stamceller, (2) transplantation af humant væv, og (3) sekundære transplantation. For alle de protokoller, har vi givet Tabel 1 med reagens information.

1. Vævsbehandling og isolering af CD34 humane hæmatopoietiske stamceller

Frisk fostervæv eller væv afsendt natten over på is fra forskellige organsystemer indkøbsagenturer kan anvendes. Ofte føtalt væv er ikke sterilt, som vist ved produktionen af ​​1.000 bakterielle kolonier på blodagar per milliliter omgivende medium. Vi rutinemæssigt vaskes vævet to gange i 40 ml sterilt PBS. Selv om dette ikke fjerne alle bakterier, kan det gøre en forskel mellem en vellykket transplantation serie og et resultat, hvor de fleste af de recipientmus bukke under for bakteriel iinfektion. Som et yderligere trin, for yderligere at desinficere vævet, vi kultur cellesuspensionen i nærvær af antibiotika.

1,1 Behandling af føtalt tymisk Tissue

1. Vask thymus ved at hælde mediet i et bægerglas med blegemiddel og anvendelse skalpel for at forhindre vævet i at glide ind i blegemiddel. Fylde røret med PBS. Og vend et par gange for at vaske thymus. Dekanteres supernatant i blegemiddel. Gentag.
2. Placer thymus væv i 8 ml RPMI + 10% føtalt kalveserum i en 60 mm skål og forskydningsspænding i 1,5-2 mm stykker med to skalpeller. Klipning med skalpeller minimerer tåreflåd og beskadige vævet bits. Beskadiget væv tendens til at blive hævede, klæbrig og vanskelig at trække ind i implantatet nålen. Antallet af opnåede bit er den første øvre grænse for transplanterbare mus.
3. Overføre de suspenderede bits med en 25 ml pipette (for at minimere vævsskade) i en T25 kolbe. Tilsættes 70 pi piptazo (Zosyn) til kolben og kultur natten over, 2. Dette reducerer kontaminerende bakterier. Hvis du ønsker at gøre vævstypebestemmelse eller andre fænotypebestemmelse assays, tage ud 1 ml af celler.

1,2 Behandling af føtalt levervæv

1. Vask leveren som i trin 1.1.1.
2. Tilsæt 10 ml Iscoves medium og dekanteres alt i en 100 mm petriskål.
3. Med to skalpeller, skær det i leveren i små (~ 3 mm) stykker. Hvis du løber ind i hvid bindevæv, skrabe leveren fra det og smid det i blegemiddel.
4. Homogenisere vævet ved at suge den til en 12 ml sprøjte forsynet med en 16 gauge stump nål 3 eller 4 gange, og overførsel til et 50 ml rør.
5. Forberede enzymer til væv fordøjelse som følger: collagenase type IV (1 mg / ml), hyaluronidase (1 mg / ml), DNase I (2 U /: Til 10 ml Iscoves i et 50 ml rør, 200 pi af hver tilsættes ml).
6. Tegn enzymer ind i en 12 ml sprøjte og passer det med et 0,22 μ filter. Filtreres enzymig / medium direkte i cellesuspensionen.
7. Cap og forsegle cellerne med Parafilm. Rotere ved 37 ° C i 90 minutter.
8. Opsætning af en 50 ml rør med en 100 μ celle si. Pipette cellen fordøje gennem dette filter.
9. Tilsættes PBS til cellerne for at bringe volumenet op til 50 ml. Opdele denne i to rør på 25 ml.
10. Underlag cellerne med 10 ml Ficoll. Spin at 2400 rpm i 20 min uden bremse.
11. Interfacet skal være tyk. Suge det ud med en 5 ml pipette og overføres til et andet rør. Du skal have to rør af interface. Der tilsættes 50 ml PBS i hvert og centrifugering ved 1200 rpm i 10 min.
12. Kombinere pellets i et rør og vaskes tre gange med PBS indeholdende 2% FCS.
13. Endelig suspenderes i 50 ml RPMI + 10% FCS og tælle celler under anvendelse af trypanblåt. Afhængig af størrelsen af vævet, kan du få fra ¹⁰ August - 10 SEPTEMBER alt hepatocytter.
14. Overføre cellerne til en T150-kolbe tilsættes 30 ml RPMI + 10% FCS og 0,8 ml piptazo.
15. Inkuberes i 1-1,5 time ved 37 ° C for at fjerne adhærerende celler.

1,3 Sortering og transduktion af CD34 hæmatopoietiske stamceller

1. Efter binding af celler i trin 1.2.15, agitere kolben frem og tilbage forsigtigt i et minut for at løsne løse celler. Der vil være mange fibroblaster og denne sidder fast til overfladen.
2. Tælle igen under anvendelse af en 1-20 fortynding og registrere det totale antal celler. Gem nogle få tiendedele af et ml for senere farvning. Du bør have omkring 30% færre celler fra dine første celletal (trin 1.2.13).
3. Stop, og vaskes to gange med 40 ml MACS buffer.
4. CD34-celler sorteres ved hjælp af Miltenyi Biotech s CD34 Direct Kit. Vi følger nøjagtig den fabrikantens protokol ved hjælp LS søjler leveret af det samme firma.
5. Indvundne celler vil være i 5 ml. Tæl og beregne totale celler. Dit udbytte af CD34 +-celler skal være 3-5% af din samlede celletal. Dette varierer med the alder føtal lever. Yngre føtale lever tendens til at give et højere udbytte af CD34 +-celler.
6. Divideres antallet af celler med 1x10 ^6. Dette giver den anden øvre grænse for transplanterbare mus.
7. Tæl CD34-fraktion (gennemstrømning og vask) og reserve 6 x 10 ⁶ per mus, der skal transplanteres. Kultur disse celler natten over i 50-80 ml RPMI + 10% føtalt kalveserum + 1% piptazo.
8. Transducere CD34 +-celler natten over med lentiviral vektor. Vi bruger retronectin af Takara fulgte nøjagtigt producentens anvisninger.
9. Den næste dag, høst af de CD34-celler, de transficerede CD34 + celler og tæller.
10. Opdele CD34 +-celler i halvdelen: Del A og del B.
11. Spin down Del A CD34 + transducerede celler og den suspenderes i 4-6 ml frysemedium (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterilfiltreret). Sættes 1 ml prøver i frysehætteglas og mærkat "huFetalCD34", antallet af celler i hætteglasset, datoen og dine initialer.
12. For hver mus mix 0.5x10 ⁶ Del B CD34 + transducerede celler og 4.5x10 ⁶ CD34-celler i en steril skruelåg mikrofugerør, pellet og holde på is. Også tø et rør af Matrigel (BD Biosciences) på is. Alle disse rør skal opbevares på is indtil brug (gå til trin 2.10).

2. Vævstransplantation

Målet med dette trin er at transplantere et humant føtalt thymus / liver organoid under NSG muse nyrekapsel. Denne organoid bedre efterligner processen med humane T-celleselektion og modningsprocesser som de humane hæmatopoietiske stamceller vil anvende human thymus og ikke mus som stedet for deres differentiering til forskellige T-celle og andre lymfoide linier. Anvendelsen af ​​CD34-celler i transplantation processen er at re-generere den føtal lever stroma og giver mulighed for bedre transplantation og vækst af implantatet. Alderen på NSG brugte mus er 6-8 uger gamle.

1. Fremstilling af lægemidler til surgery:
   1. Isofluran: Rul op en 2 tommer gaze pad og kram det ind i en 15 ml skruelåg centrifugerør. Hæld i omkring 1 ml af isofluran direkte fra flasken.
   2. Ketamin / zylazine: Tilføj 0,52 ml ketamin (Ketaset) (100 mg / ml) og 0,52 ml xylazin (Anased) (100 mg / ml) til et 20 ml hætteglas af saltvand til injektion. Etiket med udløbsdatoen for den tidligste udløber komponent og holde frosset ved -20 ° C indtil anvendelse.
   3. Carprofen (Rimadyl). Fortyndes lige før et kirurgisk indgreb. Fortyndes 1:100 ved at trække 0,1 eller 0,2 ml fra hætteglasset med en 1 ml sprøjte og en 25G nål. Injicere i en 10 eller 20 ml saltvand til injektion. Label og dato. Opbevares i køleskabet i én dag. Load i 3 ml sprøjter med 25G nåle.
2. Opsætning af tabellen for kirurgi. Dæk den med sterile blå puder og en steril håndklæde til hver kirurg. Hver kirurg får fra deres kasse med steriliserede instrumenter: 4 "saks, buede stumpe pincet, har brug forle-næse pincet, hæmostat, 16G stump trokar og sår klip applikator. Desuden skal de en krum nål Vicryl sutur, en stak isopropanol tørre pakker, en 35 mm petriskål i PBS, og en 1 ml sprøjte fyldt med PBS.
3. Set i midten af ​​bordet et glas Coplin krukke med 2 cm af Betadine og 2 vatpinde. Hæld brissel bits ind i en 60 mm petriskål.
4. Bedøvelsen udføres på et separat bord eller i en hætte dækket med sterile blå puder. Opsæt to små stativer og en elektronisk vægt med et bæger til at holde musene. Brug en rack til at holde 0,5 ml X 28g insulinsprøjter lastet med ketamin / xylazin og den anden til at holde de 3 ml sprøjter med carprofen. Også flytte biologisk farligt affald container nær at holde barberede pels.
5. Afveje alle mus (6-8 uger gamle) i et bur for at få den gennemsnitlige vægt og belastning sprøjter med en dosis på 15 gl / g ketamin / xylazin. Injicere alle musene i buret.
6. Efter musene bliver træg barbering deres left side fra hofte til skulderen mellem midten af ​​ryggen og bugen med en Oster clipper med nr. 40 klinge. Optag deres vægt, og punch deres ører for nummerering.
7. Injicer 0,3 ml carprofen subkutant over skulderen.
8. Kontroller anæstesi niveauet af musen ved at klemme en pote. Hvis musen flinches, administrere isofluran fra et rør på omkring 12 sek. Så prøv det pote squeeze igen. Med at give korte skud af isofluran indtil paw refleks forsvinder. Læg musen på sin højre side vender til venstre.
9. En 16-gauge cancer implantat nålen med spidsen indgivet runde bruges til at indsætte vævet. Skyl ud trokar et par gange i skålen af ​​PBS. Holde den horisontalt med stangen lige inden spidsen. Tilføj et stykke thymus med de needlenose pincet og suge det i.
10. En hjælper tilføjer 5 ul af kold Matrigel til et rør af celler (trin 1.3.12) med en Eppendorf positiv fortrængning pipette, og blander ved forsigtig omrøring. Kirurgen holds den trokar vandret og trækker stangen langsomt tilbage som hjælperen pipetter den Matrigel mix ind i trokar. Blandingen gelerer ved stuetemperatur.
11. Swab den nøgne hud med Betadine. Tør derefter dette med en isopropanol tørre. Gentag.
12. Find milten under huden. Det er den mørkeste plet. Musens nyre ligger omkring 5 mm dorsalt til milten, som kan ses gennem den barberede hud.
13. Afhente huden over dette sted med stumpe pincet og lave et snit parallelt med milten omkring 15 mm lang. Lav en tilsvarende nedskæring i bughinden muskel lag nedenunder. Hos mænd bør nyre være direkte synlige, og du simpelthen nødt til at klemme maven til at springe ud. Hos kvinder, skal du muligvis hente æggestokkene med arterieklemmen og trække ud nyrerne. Dette kan hjælpe bevare nyren uden for kroppen. For mænd, bliver du nødt til at holde et vist pres på maven med venstre hånd til at holde nyrerne udsat for.
14. Pluk en lille hul i posterior ende af nyrekapslen. Det kan bløde lidt.
15. Skub trokar i dette hul og langs nyrerne indtil åbningen af ​​trokar er helt dækket af nyrekapslen. Derefter bruge den lille finger på din højre hånd, injicere væv.
16. Skub nyre tilbage forsigtigt ind med den lukkede arterieklemmen. Put et sting i bughinden bundet med en dobbelt kender. Klem huden op som en pung og sat i to sårklemmer.
17. Put en dråbe PBS på hvert øje og lægge musen på siden på buret sengetøj. Sørg for at alle musene er vendt tilbage til æglæggende på deres maver, før de forlader dem.
18. Næste dag, giver hver mus anden skud af carprofen.

3. Sekundær Transplantation

Målet med dette trin i genereringen af ​​BLT mus er at udfylde moue knoglemarv med humane hæmatopoietiske stamceller. Det transplanterede implantat fra procedure (2) er ikke tilstrækkelig til fuldstændig rekonstituering af the humane immunsystem i disse mus. Under den sekundære transplantat, sub-letalt vi bestråle musene at udtømme murine knoglemarvsceller hvilket medfører "space" til implantation af humane CD34 +-celler.

1. Fire til seks uger senere bestråle musene med 2,7 Gy. Musene injiceres samme dag med del A CD34 + transducerede celler. Tidsrammen er baseret på etablering og vækst af din / liv implantat transplanteret i trin 2. Typisk i løbet af denne tid implantatet er vokset betydeligt tillade os at gå videre til de næste trin.
2. Optø ud del A CD34 + transducerede celler, vask og suspension i medium til en koncentration på 5x10 ⁶ / ml.
3. Indlæs 0,5 ml X 28g insulinsprøjter med 0,1 ml celler (10 ⁵ til 5x10 ⁵ celler pr 0,1 ml per mus) i et bur af mus (hvert bur indeholder maksimalt 5 mus), og læg dem på en rist, der vender væk.
4. Bedøver en mus med en isofluran rør ved scruffing det og holde sinnæse i rørene i ca 20 sek. Tæl at holde styr på tiden.
5. Derefter står den til højre, og trække huden omkring sin hals stramme med tommel-og pegefinger på venstre hånd. Tryk under sin kæbe med din tredje søg, således at dens højre øje buler ud. Hold sprøjten parallelt med den lange akse af musen hoved, nålen glide bag øjet og skub det forsigtigt, indtil det stopper. Tryk ikke på nogen længere, men injicere lasten over omkring 2 sek.
6. To til tre måneder senere mus blødte retroorbitally bruger EDTA belagt glas pipetter. Du kan kun tage et maksimum på 200 ul blod per måned per mus. 50-100 ul blod bør være tilstrækkeligt for FACS-analyse. Alternative blødning strategier omfatter ansigtet vene blødninger og halevenen beskæringer. Sidstnævnte vil give dig meget små mængder blod, som måske ikke er tilstrækkelig til flere assays.
7. Blodprøver farves til ekspression af det humane lymfocyt-markør CD45 kunne vurdere rekonstitution. BLood prøver tilsættes til 1 ml røde blodlegemer lysisbuffer (160 mM _NH4CI, 100 mM _KHCO3, 0,01 mM EDTA) og inkuberet i 5 minutter ved stuetemperatur.
8. Vask cellerne i lysepuffer, 5 minutter ved 1200 rpm, og gentag om nødvendigt.
9. Centrifuger celler i 3,8 og vask i PBS suppleret med 3% føtalt kalveserum (FACS-PBS).
10. Fjern supernatanten og resuspender pellets i 100 ul FACS-PBS.
11. Læg antistoffer til vurdering human lymfocyt rekonstitution. Vi typisk indbefatter følgende CD45 (human lymfocyt markør), CD8, CD4, CD14 og CD16 for makrofager og monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler.
12. Inkuber ved 4 ° C i 30 minutter.
13. Vask som i trin 3.9 og resuspender cellerne i 2% paraformaldehyd i FACS-analyse.
14. Hvis mus rekonstitueret, vi går videre med tumor injektioner. Rekonstitution niveauer af humane lymfocytter variere fra under 1% til 40% af de samlede blodlegemer. De niveauer og typer af lymphocyte slægter kan sammenlignes med, hvad man ville forvente fra raske bloddonorer. Men gør forventer udsving i antallet af ikke-T-cellelinier. Hvis tallene ikke er acceptable inden for 12-ugers tidsramme du kunne gentage det sekundære transplantation procedure fra trin 3,1.
15. Tumorcellelinier dyrkes ifølge producentens eller laboratoriebrug anbefalinger. Celler høstes, vaskes og resuspenderet i matrigel i forholdet 1:1 (50 ul celler/50 pi Matrigel). Prøverne opbevares på is hele tiden.
16. Mus bedøves og barberet på området injektion. Området steriliseres under anvendelse af en isopropanol pad. En hjælper belastninger cellesuspensioner i pre afkølet 23g 1 ml sprøjter. Tumorceller injiceret subkutant. Behandle injektionsstedet med antibiotisk salve. Tumorer bør etablere og begynde at vokse i 4 uger.

B. In vivo Positron Emission Tomografi (PET)

For vores studier har vi eksamenine glukoseoptagelse ^([18 F]-fluordeoxyglucose ^([18 F] FDG) således mus fastes 4-6 timer forud for billeddannelse. MicroPET / CT scanninger er færdig med at bruge den microPET Inveon scanner (Siemens Prækliniske Solutions) og MicroCATII CT-scanner ( Siemens PreclinicalSolutions). billedanalyse udføres under anvendelse OsiriX (Pixmeo, Schweiz) software. Målet er at måle den metaboliske aktivitet af tumoren og i sidste ende at anvende PET-billeddannelse som et alternativ til fysisk måling af tumorregression. Som det ses i figur 2, vi er stødt på tumorer, baseret på fysiske udseende og størrelse er ikke målrettet, men levende PET imaging afslørede omfattende vævsnekrose. Denne metode kan tjene som en mere følsom og nøjagtig indikator for tumorregression.

1. Udpeger et kammer til bedøvelse (2% isofluoran) musene, og et kammer, som 60 min optagelsen af ​​FDG før PET-scanning ("ventende kammer"). Anbring blå puder i begge kamre.
2. Da dyr er Anesthetized over en lange perioder, bør de holdes varm ved 30 ° C ved brug af vandfyldte handsker, der varmes i en mikrobølgeovn og placere burene på varme pads.
3. Drej isofluran flow for dette kammer på. Tillade isofluran at fylde bedøvelse kammer til cirka 5-10 minutter før placere mus ind i kammeret. Sørg for, at låget er låst og lukket tæt for at undgå lækage isofluran.
4. Placer den første mus ind i bedøvelse kammer og lås låget stramt. Tillad 5-10 min, eller indtil musen er bevidstløs.
5. Fjern musen fra bedøvelse kammer, etiket halen af musen (forskellig farve per bur) og injicere intraperitonealt musen med ^[18 F] FDG (80 uCi). Vær opmærksom på det tidspunkt, hvor mus blev injiceret. Musen vil være bedøvede igen 50 min fra denne tidspunkterne, der giver mulighed for 10 min at sætte op for PET-scanning (for de i alt 60 min ^[18 F] FDG optagelse før PET-scanning).
6. Anbring injicerede mus ind i den ventende kammeret, så ^[18F] FDG optagelse i 1 time før PET-scanning. Du må ikke låse låget. Lade låget løs for at tillade luftstrøm.
7. Umiddelbart placere den næste mus for FDG injektion i bedøvelse kammer. Efterfølgende mus injektioner skal fordeles 10 min fra hinanden, fordi processen med PET-scanning er 10 min. Umiddelbart efter en mus er scannet, vil 60 min FDG-optagelse for den næste mus skal scannes være klar nøjagtig 10 min fra hinanden.
8. Fortsat bedøvelse og injicere mus som angivet i trin 7-9.
9. Efter 50 min fra den første mus indsprøjtning tidspunkterne, skal du placere den første indsprøjtet musen i bedøvelse kammer igen (mens der stadig fortsætter med at bedøve og injicere mus).
10. Tilslut musen seng til ilt og isofluran linjer, og drej isofluran flow på i sengen. Placer en blå pude på sengen.
11. Placer musen klar til PET-scanning på sengen, strække armene ogben og holder denne position med tape. Anbring smøremiddel over øjnene. Dette trin er det vigtigste, eftersom placeringen af ​​dyret kan påvirke kvaliteten af ​​billeddannelse.
12. Afbryd isofluran og oxygen linjer, og hurtigt montere seng på PET-scanning maskine. Placere isofluran og oxygen linier. Sørg for, at isofluran flow på for PET-scanning maskine. Slut PET scanning kabel og starte scanningen.
13. Når PET-scanningen er afsluttet derefter flytte dyret til CT-scanner. Efter denne scanning bevæge dyret til dets respektive bur.

Representative Results

Et rutediagram af transplantationerne vist i figur 1A. Et billede af thy / liv implantat er vist i figur 1B. Den thymiske væv normal udvikling og har en fysiologiske distribution af humane CD4-og CD8-T-celler. Efter rekonstitution bære dyrene et humant immunsystem med normal fordeling af CD4, CD8 T-celler og andre immun celleafstamninger.

Uoverensstemmelsen mellem tumorstørrelse og levende væv er vist i figur 2. Mens CT-scanning (gråt område) viste en stor tumorvækst in vivo PET imaging viste, at det var hovedsagelig nekrotisk og arvæv (figur 2). Dette understreger nytten af ​​PET-billeddannelse som en mere følsom og præcis måde at vurdere tumor regression og rydning.

Fig. 1. (A) Et skematisk diagram af det ændrede BLT model anvendt i disse studier til generering af kimære mus, der bærer MART-1 specifikke T-celler. Den Thy / Liv implantat blev rekonstrueret fra transducerede og ikke-transducerede CD34 celler isoleret fra en autolog føtal lever. En fraktion af de transducerede celler fryses og sprøjtes ind i bestrålede mus 4-6 uger senere. (B) Et repræsentativt billede af thy / liv implantat i humaniserede mus. Implantaterne har en fysiologisk vævsdistribution og CD4/CD8 nøgletal som vist ved IHC og flowcytometri tal. Klik her for at se større figur .

Figur 2. En PET og CT billede af en mus, der bærer en melanoma tumor. Dengrå område angiver den fysiske størrelse af tumoren, mens den røde farve indikerer tumoren stofskifteaktivitet, der er meget begrænset.

Discussion

Den modificerede BLT humaniseret musemodel kombineret med in vivo PET-billeddannelse er effektive redskaber til at studere kroniske sygdomme hos mennesker. Dette system tager BLT musemodel og forskud det ud over de begrænsede muligheder for HIV-forskning. Endvidere er det en stor system, hvor man kan undersøge forskellige genterapiprotokoller samt diagnostiske teknikker før de kan nå det kliniske miljø. Sidstnævnte kombineret med de lave omkostninger ved at bruge mus versus primater gør dette en meget nyttig model.

PET imaging-teknologi tilladt os at vurdere effekten af ​​vores strategi. Hvis vi udelukkende gjort den fysiske målinger af tumoren, ville vi have undervurderet styrken af ​​antitumorrespons genereres af vore transgene T-celler. Den omfattende ardannelse og nekrotisk væv til tilsyneladende at en stor tumor, som i virkeligheden var dødt væv.

Det konkluderes, at anvendeligheden af ​​den modificerede BLT muse model kan udvides til andre sygdomsmodeller. Mens nogle ulemper der stadig såsom kortere levetid af mus, kan dette være et meget stærkt værktøj til in vivo vurdere mange aspekter af menneskers immunitet, test og udvikle nye terapeutiske indgreb.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx