Bruke BLT humanisert Mouse som en stamcelle basert Gene Therapy Tumor Model

Summary

Generering og karakterisering av tumor spesifikke T-celler ved hjelp av humaniserte mus er beskrevet her. Menneskelig thymic vev og genmodifiserte menneskelige blodkreft stamceller er transplantert inn immunsupprimerte mus. Dette resulterer i rekonstituering av en konstruert menneskets immunsystem muliggjør in vivo undersøkelse av anti-tumor immunrespons.

Abstract

Små dyremodeller som mus har vært mye brukt for å studere sykdom hos mennesker og å utvikle nye terapeutiske intervensjoner. Tross mange opplysninger fått fra disse studiene, ledet de unike egenskapene mus immunitet samt arten spesifisitet av virussykdommer slik som humant immunsviktvirus (HIV)-infeksjon til utvikling av humaniserte musemodeller. De tidligere modellene involverte bruk av C. B 17 SCID / SCID mus og transplantasjon av menneskelige foster thymus og fosterets lever betegnet din / liv (SCID-hu) ^{1, 2} eller adoptiv overføring av humant perifert blod leukocytter (SCID-huPBL ) ^3. Begge modellene er i hovedsak brukt for studiet av HIV-infeksjon.

En av de viktigste begrensninger av begge disse modellene var mangel på stabile rekonstituering av humane immunceller i periferien for å gjøre dem mer fysiologisk relevant modell for å studere HIV sykdom. For dette formål, BLT nynneanized mus modellen ble utviklet. BLT står for benmarg / lever / thymus. I denne modellen, 6 til 8 uke gamle NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) immunsupprimerte mus får din / liv implantat som i SCID-hu mus modell bare for å bli etterfulgt av en andre menneske hematopoetisk stamcelletransplantasjon ^4. Fordelen med dette systemet er den fullstendige oppløsning av det menneskelige immunsystem i periferien. Denne modellen er blitt brukt til å studere HIV infeksjon og ventetid ^5-8.

Vi har generert en modifisert versjon av denne modellen som vi bruker genmodifiserte menneskelige blodkreft stamceller (hHSC) å konstruere din / liv implantat etterfulgt av injeksjon av transduced autolog ^{7 hHSC, 9.} Dette resulterer i at generasjonen av genmodifiserte linjene. Enda viktigere, tilpasset vi dette systemet å undersøke potensialet til å generere funksjonelle cytotoksiske T-celler (CTL) som uttrykker en melanom spesifikke T celle reseptor. Ved hjelp av denne modellen vi var i stand til å vurdere funksjonaliteten vår transgene CTL utnytte levende positronemisjonstomografi (PET) imaging for å fastslå tumorregresjon (9).

Målet med denne protokollen er å beskrive prosessen med å generere disse transgene mus og vurdere in vivo effekt ved hjelp av levende PET imaging. Som et notat, siden vi bruker menneskelige vev og lentiviral vektorer, våre anlegg i samsvar med CDC NIH retningslinjer for biosikkerhet Nivå 2 (BSL2) med spesielle forholdsregler (BSL2 +). I tillegg er NSG mus alvorlig immunkompromitterte dermed må deres bolig og vedlikehold i samsvar med de høyeste helse-standarder ( http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html ).

Protocol

A. Generation of BLT mus

Generering av BLT mus delt inn i tre (3) deler: (1) behandling av fostervev og utarbeidelse av CD34 humane hematopoetiske stamceller, (2) transplantasjon av menneskelig vev, og (3) sekundære transplantasjon. For alle protokoller, har vi gitt tabell 1 med reagens informasjon.

1. Tissue Processing og Isolering av CD34 Menneskelig blodkreft stamceller

Fersk fostervev eller vev levert over natten på is fra forskjellige Organ Procurement etater kan brukes. Ofte fostervev ikke sterilt, noe som gjenspeiles av produksjonen av 1000 bakteriekolonier på blodagar per milliliter omgivende mediet. Vi rutinemessig vaske vevet to ganger i 40 ml steril PBS. Selv om dette ikke fjerner alle bakterier, kan det gjøre en forskjell mellom en vellykket transplantasjon serien og et resultat som de fleste av mottakerlandene mus bukke til bakteriell isjon. Som en ekstra trinn for ytterligere å desinfisere vevet, vi kultur cellesuspensjonen i nærvær av antibiotika.

1.1 Behandling av Fetal thymisk Tissue

1. Vask thymus ved å helle av mediet i et begerglass av blekemidler og bruke skalpell å hindre at vevet glir inn blekemiddel. Fyll opp røret med PBS. Cap og invertere noen ganger for å vaske thymus. Decant supernatant i blekemiddel. Gjenta.
2. Plasser thymus vev i 8 ml RPMI + 10% kalvefosterserum i en 60-mm parabol og skjærkraft i 1,5 til 2 mm stykker med to skalpeller. Klipping med skalpeller minimerer rive og skade vev biter. Skadet vev har en tendens til å bli hoven, klebrig, og vanskelig å trekke inn i implantatet nålen. Antall bits framkommet er den første øvre grense på transplantable mus.
3. Overfør de suspenderte biter med en 25 ml pipette (for å minimere vevskader) i en T25-kolbe. Legg 70 pl piptazo (Zosyn) til kolbe og kultur over natten, 2. Dette reduserer betraktelig forurensende bakterier. Hvis du ønsker å gjøre vevstyping eller andre fenotyping analyser, ta ut 1 ml av celler.

1.2 Behandling av Fetal Liver Tissue

1. Vask leveren som i trinn 1.1.1.
2. Tilsett 10 ml Iscoves medium og dekanter alt inn i en 100 mm petriskål.
3. Med to skalpeller, terninger leveren i små (~ 3 mm) stykker. Hvis du kjører inn i hvitt bindevev, skrape leveren fra den og kast den i blekemiddel.
4. Homogenisere vevet ved å suge den inn en 12 ml sprøyte utstyrt med en 16 gauge stump nål 3 eller 4 ganger, og overføring til et 50 ml rør.
5. Klargjør enzymer for vev fordøyelsen som følger: Til 10 ml av Iscoves i en 50 ml rør, tilsett 200 ul av hver: kollagenase type IV (1 mg / ml), hyaluronidase (1 mg / ml), DNase I (2 U / ml).
6. Tegn enzymer i en 12 ml sprøyte og passer det med en 0,22 μ filter. Filtrere enzyme / medium direkte inn i cellen suspensjon.
7. Hetten og forsegle celler med Parafilm. Roter ved 37 ° C i 90 min.
8. Sette opp en 50 ml tube med en 100 μ celle sil. Pipet cellen fordøye gjennom denne silen.
9. Legg PBS til cellene for å bringe volumet opp til 50 ml. Dele dette inn i to rør på 25 ml.
10. Undertak cellene med 10 ml Ficoll. Spinne på 2400 rpm i 20 min uten brems.
11. Grensesnittet skal være tykk. Suge den ut med en 5 ml pipette og overfør til et annet rør. Du bør ha to tuber grensesnitt. Tilsett 50 ml av PBS til hver og sentrifugering ved 1200 opm i 10 min.
12. Kombiner pellets inn en rør og vaske tre ganger med PBS inneholdende 2% FCS.
13. Endelig suspendere i 50 ml RPMI + 10% FCS og telle celler bruker Trypan blå. Avhengig av størrelsen av vevet, kan få fra august ^10-september 10 totale hepatocytter.
14. Overfør cellene til en T150 kolbe og tilsett 30 ml RPMI + 10% FCS og 0,8 ml piptazo.
15. Inkuber i 1 til 1,5 time ved 37 ° C for å fjerne adherente celler.

1.3 Sortering og Transduksjon av CD34 blodkreft stamceller

1. Etter montering av celler i trinn 1.2.15, agitere kolben frem og tilbake forsiktig på et minutt for å fjerne løse celler. Det vil være mye av fibroblaster og slikt fast til overflaten.
2. Telle igjen ved hjelp av en 1-20 fortynning og registrere det totale antall celler. Spare noen få tidels ml for senere flekker. Du bør ha ca 30% færre celler fra de første celletall (trinn 1.2.13).
3. Spinne ned og vask to ganger med 40 ml MACS-buffer.
4. CD34 celler er sortert ved hjelp av Miltenyi Biotechs CD34 direkte Kit. Vi følger nøyaktig produsentens protokollen med LS kolonner levert av samme selskap.
5. Gjenvundne celler vil være i 5 ml. Telle og beregne totale celler. Din utbytte av CD34 +-celler bør være 3-5% av det totale celletall. Dette varierer med the alder av fosterets leveren. Yngre fosterets lever tendens til å gi en høyere avkastning på CD34 +-celler.
6. Dele antall celler ved 1x10 ^6. Dette gir andre øvre grense på transplantable mus.
7. Telle CD34-fraksjonen (flow gjennom og vasker) og reserve 6 x 10 ⁶ per mus for å bli transplantert. Kultur disse cellene over natten i 50 til 80 ml RPMI + 10% føtalt kalveserum + 1% piptazo.
8. Transduce de CD34 +-celler natten med lentiviral vektor. Vi bruker retronectin av Takara følge nøyaktig produsentens instruksjoner.
9. Neste dag, høste de CD34-celler, de transfekterte CD34 + celler og teller.
10. Dele CD34 +-celler i halvparten: del A og del B.
11. Nedtrapping del A CD34 + transduced celler og suspendere i 4 til 6 ml frysing medium (RPMI + 10% FCS + 10% DMSO, 0,22 μ sterilfiltrert). Sett 1 ml alikvoter inn frysing hetteglass og merke med "huFetalCD34", antall celler i hetteglasset, datoen og initialene dine.
12. For hver mus blande 0.5x10 ⁶ Del B CD34 + transduced celler og 4.5x10 ⁶ CD34-celler i et sterilt skrue-cap mikrosentrifuge tube, pellet og holde på is. Også tin en tube av Matrigel (BD Biosciences) på is. Alle disse rørene må holdes på is inntil bruk (gå til trinn 2.10).

2. Vev transplantasjon

Målet med dette trinnet er å transplantere et menneske fosterets thymus / leveren organoid under NSG musen nyre kapsel. Dette organoid etterligner bedre prosessen med human T celle utvalg og modning prosesser som den menneskelige blodkreft stamceller vil bruke de menneskelige thymus og ikke musen som stedet for differensiering deres til forskjellige T-celle og andre lymfoide linjene. Bruken av CD34-celler i transplantasjon prosessen er å re-generere fosterets leveren stroma og muliggjør bedre transplantasjon og vekst av implantatet. Alderen på NSG mus som brukes er 6-8 uker gamle.

1. Utarbeidelse av narkotika for surgery:
   1. Isofluran: Rull opp en 2-tommers gasbind pad og dytte i en 15 ml skrulokk sentrifugerør. Hell i ca 1 ml isofluran direkte fra flasken.
   2. Ketamin / zylazine: Legg 0,52 ml ketamin (Ketaset) (100 mg / ml) og 0,52 ml av xylazin (Anased) (100 mg / ml) til et 20 ml hetteglass av saltvann for injeksjon. Etikett med utløpsdato av de tidligste utløper komponent og holde fryses ved -20 ° C inntil nødvendig.
   3. Karprofen (Rimadyl). Fortynne dette like før et kirurgisk inngrep. Fortynn 1:100 ved å trekke 0,1 eller 0,2 ml fra hetteglasset med en 1 ml sprøyte og en 25G nål. Injisere i en 10 eller 20 ml saltløsning for injeksjon. Etiketten og dato. Oppbevares i kjøleskap for en dag bare. Belastning i 3 ml sprøyter med 25g nåler.
2. Sett opp tabellen for operasjoner. Dekk den med sterile blå pads, og et sterilt håndkle for hver kirurg. Hver kirurg får fra sin boks med steriliserte instrumenter: 4 "saks, buede butte tang, måle-nese tang, hemostat, 16G avstumpet trochar, og sår klipp applikator. I tillegg, de trenger en buet-nål Vicryl sutur, en stabel av isopropanol tørk pakker, en 35 mm petriskål av PBS, og en 1 ml sprøyte fylt med PBS.
3. Sett i midten av bordet et glass Coplin krukke med 2 cm Betadine og 2 bomullspinner. Hell brisselen biter til en 60 mm petriskål.
4. Anestesi utføres på en separat tabell eller i en hette dekket med sterile blå pads. Sett opp to små stativer og en elektronisk balanse med et beger for å holde musene. Bruk én rack å holde 0,5 ml x 28g insulin sprøyter lastet med ketamin / xylazin og den andre til å holde 3 ml sprøyter av karprofen. Også flytte biohazard avfallsbeholder nær å holde barbert pels.
5. Veie alle mus (6-8 uker gamle) i et bur for å få den gjennomsnittlige vekt og belastningen sprøyter med en dose på 15 ul / g av ketamin / xylazin. Injisere alle musene i buret.
6. Etter musene blir svak barbere LEFt side fra hofte til skulder mellom midten av ryggen og magen med en Oster hårklipperen med nr. 40. blad. Spille inn sin vekt, og punch ørene for nummerering.
7. Injisere 0,3 ml carprofen subkutant over skulderen.
8. Sjekk anestesi nivå av musen ved å klemme en labb. Dersom musen viker, administrere isofluran fra et rør i ca 12 sek. Deretter prøver de labben klemme igjen. Fortsette å gi korte bilder av isofluran til labben refleks forsvinner. Legge musen på sin høyre side vender venstre.
9. En 16-gauge kreft implantat nål med spissen arkivert runden brukes til å sette vevet. Skyll trochar et par ganger i parabolen PBS. Holder den horisontale med stangen rett innenfor spissen. Legg et stykke thymus med needlenose pinsett og suge den i.
10. Et hjelpeprogram legger 5 ul kald Matrigel til en tube av celler (trinn 1.3.12) med en Eppendorf positiv fortrengning pipette, og blander etter forsiktig omrøring. Kirurgen holds den trochar horisontalt og trekker stangen tilbake sakte som hjelper pipets den Matrigel bland inn i trochar. Blandingen geler ved romtemperatur.
11. Pensle den nakne huden med Betadine. Tørk dette av med en isopropanol tørk. Gjenta.
12. Finn milten under huden. Det er den mørkeste stedet. Musens nyre ligger omtrent 5 mm dorsal til milten, som kan sees gjennom det barbert hud.
13. Plukke opp huden over dette stedet med den butte pinsett og lage et snitt parallelt til milten ca 15 mm lange. Lage en lignende kutt i peritoneum muskel laget under. Hos menn bør nyre være direkte synlig, og du bare må presse magen slik at det spretter ut. Hos kvinner, kan det hende du må plukke opp eggstokken med pinsetten og dra ut nyrene. Dette kan bidra til å beholde nyrene utenfor kroppen. For menn, må du holde et visst press på magen med venstre hånd for å holde nyrene utsatt.
14. Nappe et lite hull i posterior enden av nyre kapsel. Det kan blø litt.
15. Skyv trochar inn i dette hullet og langs nyre inntil åpningen av trochar er fullstendig dekket av nyrene kapselen. Deretter bruke lillefingeren på høyre hånd, injiserer i vevet.
16. Skyv nyre tilbake forsiktig med den lukkede pinsetten. Sett ett sting i peritoneum bundet med en dobbel vet. Klem huden opp som en veske og satt i to såret klipp.
17. Ta en dråpe PBS på hvert øye og legge musen på sin side på buret sengetøy. Pass på at alle musene har returnert til legging på maven før avreise dem.
18. Neste dag, gi hver mus et skudd av karprofen.

3. Sekundær Transplantasjon

Målet med dette trinnet i produksjonen av BLT mus er å fylle moue benmarg med menneskelige blodkreft stamceller. Det transplanterte implantatet prosedyren (2) ikke er tilstrekkelig til å støtte full oppløsning av the menneskets immunsystem i disse musene. Under den sekundære transplantasjon, vi sub-lethally strålebehandling musene å utarme murine benmargceller dermed generere "space" for implantasjon av de menneskelige CD34 +-celler.

1. Fire til seks uker senere strålebehandling musene med 2,7 Gy. Musene injiseres samme dag med del A CD34 + transduced celler. Tidsrammen er basert på etablering og vekst av din / liv implantat transplantert i trinn 2. Vanligvis, i løpet av denne tiden implantatet har vokst betydelig tillater oss å gå videre til neste trinn.
2. Tine Part A CD34 + transduced celler, vaske og suspendere i medium til en konsentrasjon på 5x10 ⁶ / ml.
3. Last 0,5 ml x 28g insulin sprøyter med 0,1 ml av celler (10 ⁵ til 5x10 ⁵ celler pr 0,1 ml per mus) for én bur av mus (hver bur inneholder maksimalt 5 mus) og legger dem på et stativ som vender bort.
4. Anesthetize en mus med en isofluran røret ved scruffing det og holde sinnesen i rørene for omtrent 20 sek. Tell å holde styr på tiden.
5. Deretter innse det til høyre, og dra i huden rundt halsen tett med tommel og pekefinger på venstre hånd. Trykk under kjeven sin med ditt tredje finder slik at høyre øye buler ut. Holde sprøyten parallelt til den lange aksen av musen hode, ta nålen bak øyet, og skyv det forsiktig inn til det stopper. Ikke trykk på noen lenger, men injisere belastningen over ca 2 sek.
6. To til tre måneder senere mus blødde retroorbitally bruker EDTA belagt glass pipetter. Du kan bare ta maksimalt 200 mL blod per måned per mus. 50-100 mL blod bør være tilstrekkelig for FACS-analyse. Alternative blødning strategier inkluderer ansikts vein blør og halevenen utfallende. Sistnevnte vil gi deg svært små mengder blod som kanskje ikke er tilstrekkelig for flere analyser.
7. Blodprøver er farget for ekspresjon av den menneskelige lymfocytt markør CD45 å vurdere rekonstituering. BLood prøvene blir lagt inn 1 ml røde blodceller lyseringsbuffer (160 mM _NH4Cl, 100 mM KHCO _3, 0,01 mM EDTA) og inkubert i 5 min ved romtemperatur.
8. Vask cellene i lyseringsbuffer, 5 min ved 1200 rpm, og gjenta om nødvendig.
9. Sentrifuger cellene som i 3,8 og vaske i PBS supplert med 3% føtalt kalveserum (FACS-PBS).
10. Fjern supernatant og resuspendere pellets i 100 ul FACS-PBS.
11. Legg antistoffer for å vurdere menneskers lymfocytt tilberedning. Vi vanligvis inkluderer følgende CD45 (human lymfocytt markør), CD8, CD4, CD14 og CD16 for makrofager og monocytter, CD19 for B-celler og CD56 for NK-celler.
12. Inkuber ved 4 ° C i 30 min.
13. Vask som i trinn 3.9 og re-suspendere celler i 2% paraformaldehyd i FACS analyse.
14. Hvis mus rekonstitueres, fortsetter vi med tumor injeksjoner. Reconstitution nivåer av humane lymfocytter varierer, fra mindre enn 1% til 40% av totale blodceller. Nivåene og typer lymphocYTE linjene er sammenlignbare med hva man kan forvente fra friske mennesker blodgivere. Imidlertid, må forvente svingninger i antall ikke-T-celle-linjene. Hvis tallene er ikke akseptabelt innenfor 12-ukers tidsramme du kan gjenta den sekundære transplantasjon prosedyren fra trinn 3.1.
15. Tumorcellelinjer dyrkes i henhold til produsentens eller laboratorium anbefalinger. Cellene høstes, vaskes og resuspenderes i Matrigel i forholdet 1:1 (50 ul cells/50 pl Matrigel). Eksemplarene oppbevares på is hele tiden.
16. Mus bedøves og barbert på området av injeksjon. Området er sterilisert ved hjelp av en isopropanol pad. En hjelper laster cellesuspensjoner i pre avkjølt 23G 1 ml sprøyter. Kreftceller injiseres subkutant. Unn injeksjonsstedet med antibiotisk salve. Svulster bør etablere og begynne å vokse i 4 uker.

B. In vivo emisjontomografi (PET)

For våre studier eksamen viine glukoseopptak ^([18 F]-fluorodeoxyglucose ^([18 F] FDG) dermed mus fastet 4-6 timer før bildebehandling. MicroPET / CT-skanning utføres ved hjelp av microPET Inveon scanner (Siemens Prekliniske Solutions) og MicroCATII CT-skanner ( siemens PreclinicalSolutions). Bildeanalyse er gjort ved hjelp OsiriX (Pixmeo, Sveits) programvare. Målet er å måle metabolsk aktivitet av svulsten og til slutt å benytte PET avbildning som et alternativ til fysisk måling tumorregressjon. Som sett i figur 2, vi har møtt svulster som basert på fysisk utseende og størrelse er ikke målrettet, men levende PET imaging avdekket omfattende vevsnekrose. Denne metodikken kan tjene som en mer følsom og nøyaktig indikator på tumor regresjon.

1. Utpeke en kammer for bedøvelse (2% isofluorane) musene, og ett kammer som 60 min opptaket av FDG før PET-skanning ("venter kammer"). Plasser blå pads i begge kamre.
2. Som dyr er anesthetized over en lengre perioder, bør de holdes varm ved 30 ° C ved bruk av vannfylte hansker som er varmet i en mikrobølgeovn og plassere merdene på varme pads.
3. Vri isofluran flyt for dette kammeret på. Tillate isofluran å fylle bedøvelse kammeret i ca 5-10 minutter før de plasseres noen mus inn i kammeret. Kontroller at lokket er låst og lukket tett for å unngå lekkasje isofluran.
4. Plasser den første musen til bedøvelse kammer og lås lokket tett. Tillat 5-10 min eller til musen er bevisstløs.
5. Fjerne mus fra bedøvelse kammer, etikett halen av musa (annen farge per bur) og injisere intraperitonealt musen med ^[18 F] FDG (80 uCi). Vær oppmerksom på den tiden musen ble injisert. Musen vil være bedøvet igjen 50 min fra denne endepunktet, slik at for 10 min å sette opp for PET-skanning (for totalt 60 min ^[18 F] FDG opptak før PET-skanning).
6. Plasser den injiserte mus inn i den ventende kammer, slik at ^[18 F] FDG-opptak for en time før PET-skanning. Ikke lås lokket. La lokket løs for å tillate luftstrøm.
7. Plasser øyeblikkelig neste musen for FDG injeksjon i bedøvelse kammeret. Påfølgende mus injeksjoner bør linjeavstand 10 min fra hverandre, fordi prosessen med PET-skanning er 10 min. Umiddelbart etter en mus er skannet, vil 60 min FDG opptak for neste mus som skal skannes være klar nøyaktig 10 min fra hverandre.
8. Fortsett bedøvelse og injisere mus som nevnt i trinn 7-9.
9. Etter 50 min fra den første musen injeksjon endepunktet, plassere den første injisert musen til bedøvelse kammeret igjen (mens du fremdeles fortsetter å bedøve og injisere mus).
10. Koble musen sengen til oksygen og isofluran linjer, og slå isofluran flyt på for sengen. Plasser en blå pad på sengen.
11. Plasser musen klar for PET-skanning på sengen, strekke armene ogben og holder denne posisjonen med tape. Plasser smøremiddel over øynene. Dette trinnet er det mest avgjørende siden plasseringen av dyret kan påvirke kvaliteten av imaging din.
12. Koble fra isofluran og oksygen linjer, og raskt montere sengen på PET-skanning maskinen. Plasser isofluran og oksygen linjer. Kontroller at isofluran flyt er på for PET-skanning maskinen. Koble PET-skanning kabelen og starte skanningen.
13. Når PET scan er fullført deretter flytte dyret til CT-skanner. Etter denne skanningen flytte dyret til sin respektive bur.

Representative Results

Et flytskjema av transplantasjonen prosessen er vist i figur 1A. Et bilde av din / Liv implantat er vist i figur 1B. Den thymisk vev utvikler normalt og har en fysiologisk fordeling av menneskelige CD4 og CD8 T-celler. Etter rekonstituering dyrene bære en menneskets immunsystem med normal fordeling av CD4, CD8 T-celler og andre immunceller linjene.

Avviket mellom tumor størrelse og levende vev er vist i figur 2. Mens CT scan (grått område) indikerte stor svulstvekst in vivo PET avbildning viste at det var hovedsakelig nekrotisk og arrvev (figur 2). Dette understreker nytten av PET billeddiagnostikk som en mer følsom og nøyaktig måte å vurdere tumorregresjon og klarering.

Figur 1. (A) viser et skjematisk diagram på den modifiserte BLT modellen som brukes i disse studiene for generering av chimeriske mus bærer Mart-1 spesifikke T-celler. Den Thy / Liv implantat ble rekonstruert fra transduced og ikke-transduced CD34 celler isolert fra en autolog fosterets lever. En brøkdel av de transduced cellene er frosset og injisert i bestrålte mus 4-6 uker senere. (B) Et representativt bilde av din / Liv implantat i humaniserte mus. Implantater har en fysiologisk vevsdistribusjon og CD4/CD8 forholdstall som vist ved IHC og flowcytometri tall. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. En PET og CT bilde av en mus som bærer en melanom tumor. Dengrå området indikerer den fysiske størrelsen på svulsten mens den røde fargen indikerer svulsten metabolsk aktivitet, som er svært begrenset.

Discussion

Den modifiserte BLT humanisert mus modell kombinert med in vivo PET imaging er kraftige verktøy for å studere kroniske sykdommer hos mennesker. Dette systemet tar BLT mus modell og drar det utover den begrensede muligheter for HIV-forskning. I tillegg er det et stort system som vi kan undersøke ulike genterapi protokoller så vel som diagnostiske teknikker før de kan nå klinisk sammenheng. Sistnevnte kombinert med lave kostnader ved å bruke mus versus primater gjør dette en svært nyttig modell.

PET imaging teknologi tillater oss å vurdere effekten av vår tilnærming. Hvis vi stolte utelukkende på fysiske målinger av svulsten, ville vi ha undervurdert styrken på kreftsvulster respons generert av våre transgene T-celler. Den omfattende arrdannelse og nekrotisk vev ga utseendet av en stor tumor, som i virkeligheten var dødt vev.

I konklusjonen, nytten av den modifiserte BLT mus model kan utvides til andre sykdomstilstander modeller. Mens noen ulemper fortsatt vedvarer slik som kortere levetid av mus, kan dette være en svært sterkt verktøy til in vivo vurdere mange aspekter ved menneskelig immunitet, test og utvikle nye terapeutiske intervensjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	Invitrogen	10010049
RPMI 1640		A1049101
Iscove's		12440061
Fetal Calf Serum		16000085
Collagenase type IV	Sigma Aldrich	C5138
Hyaluronidase		H3506
DNAse I	Roche Diagnostics	10104159001
Piptazo (Zosyn)	Pfizer		Piperacillin/tazobactam combination
Ficoll (Ficoll-Paque Plus)	Ge Healthcare Life Sciences	17-1440-02
MACS Buffer	Miltenyi Biotech	See comments	MACS buffer: PBS supplemented with 0.5% fetal bovine serum and 2 mM citrate dextrose formula-A
CD34 Microbead Kit		130-046-702
LS Columns		130-042-401
Retronectin	Takara	T100A
Matrigel	BD Biosciences	354263
Isofluorane	Baxter		http://www.baxter.com/healthcare_professionals/products/forane.html
Carprofen (Rimadyl)	Pfizer Animal Health		https://www.rimadyl.com/default.aspx