Summary
Eis Bindungsproteine (IBPs), auch als Frostschutzmittel Proteine bekannt, hemmen Eiswachstum und sind eine vielversprechende Additiv zur Verwendung bei der Kryokonservierung von Gewebe. Das wichtigste Instrument zur IBPs zu untersuchen ist die Nanoliter Osmometer. Wir haben ein Haus entworfen Kühlstufe auf einem optischen Mikroskop montiert und kontrolliert über eine custom-built LabVIEW Routine. Die Nanoliter Osmometer hier beschriebenen manipulierten die Temperatur der Probe in einem ultra-sensitive Art und Weise.
Protocol
0. Vorläufige Verfahren
- Glas zur Herstellung Injektionskapillare. Mit einer Kapillare Abzieher (Narishige, Tokyo, Japan), bereiten Sie einen scharfen Pipette mit einer feinen Öffnung von einer Glaskapillare Mikro-Schlauch (Brand GmbH, Wertheim, Deutschland). Die Größe der Öffnung sollte, indem Luft durch die Kapillare, um feine Blasen in sauberem Wasser zu erhalten verifiziert werden. Wenn die Kapillare geschlossen ist, dann kann es durch das Brechen der Kante zu öffnen. Dies kann durch Drücken oder Kratzen sie sanft gegen das Wasser mit Rohrwänden erreicht werden. Bereiten Sie die Kapillare, so dass die Öffnung blockiert ist, sondern annähernd ausreichend zu öffnen, um die Bildung von Blasen im Submillimeterbereich zu ermöglichen.
- Copper Disc Reinigung. Beschallen die Kupfer-Discs für 10 min in 0,1% Micro-90 Seife (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), dann waschen mit doppelt destilliertem Wasser. Führen Sie die Discs in einem Isopropanol (technische) Lösung und beschallen erneut für 10 min. FlosseVerbündeter, trocknen die Scheiben mit gefilterter Luft. Diese Reinigungsstufe ist entscheidend für die IBP Kontamination zwischen den Experimenten zu vermeiden.
- Double-Layer-Deckglas Montage. Ein Deckglas Versammlung war bereit, für Probenbeobachtung ohne Kondensation von Feuchtigkeit auf dem Deckglas Oberfläche zu ermöglichen. Dies wurde durch Platzieren eines Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) Teilchen (2 mm Durchmesser) zwischen zwei Deckgläsern, die dann mit einer Heißklebepistole klebten erreicht. Diese Konfiguration verhindert Kondensation, die die Sicht versperren könnte, wenn die Probe auf niedrige Temperaturen abgekühlt und entfernt die Notwendigkeit, trockene Luft auf die Beobachtungsfenster zu blasen.
Ein. Cooling Stage Set-up
- Verbinden Sie den Wasserfluss Einlass und Auslass der Kühlstufe bis 4 mm Innendurchmesser Tygon Röhren (Saint-Gobain, Paris, Frankreich), und schließen Sie den Wasserfluss Einlassrohr mit einer Wasserpumpe.
- Verbinden einer 4 mm Innendurchmesser Tygon Röhre zu dem Einlaß der Kühlstufe to liefern trockene Luft. Die Luft wurde getrocknet unter Verwendung einer in-line Drierite Spalte.
- Betreiben Sie die Luft-und Wasserpumpen. Beachten Sie, dass die Kühlelemente nicht ohne einen Kühlkörper betrieben werden.
- Schalten Sie den Temperaturregler, Kamera und LabVIEW-Routine.
2. Probenvorbereitung
- Legen Sie eine 3-4 ul Tropfen Immersionsöl B (Cargille Labors, Cedar Grove, New Jersey, USA) auf der Rückseite eines 7 mm Durchmesser Kupfer Scheibe mit 500 um Löcher durch die Platte gebohrt.
- Positionieren Sie den Kupfer-Disc auf der Kühlstufe mit dem Immersionsöl nach unten.
- Verbinden des Kapillarrohrs (die stumpfe Kante) zu einer 0,7 mm Innendurchmesser Tygon Rohrs an dem anderen Ende mit einer 2-ml-Glas-Spritze (Poulten-Graf, Wertheim, Deutschland) verbunden ist.
- Vor der Verwendung des Kapillarrohr, überprüfen Sie die kleine Öffnung der Kapillare, um sicherzustellen, dass die Öffnung eine geeignete Größe ist (siehe die vorläufigen Verfahren).
- Langsam legen Sie die glass in die vorbereitete IBP Protein Probenröhrchen (2,4 uM Mp IBP-GFP in 20 mM CaCl 2 und 25 mM Tris-HCl bei pH 8, siehe Referenz 10 zur Herstellung Details) Kapillare und ziehen Sie das Glas Spritze, bis die Glaskapillare enthält 0,1 ul der Proteinlösung.
- Beginnen Videoaufzeichnung über die LabVIEW-Software.
- Das spitze Kante der Glaskapillare (das Protein enthaltenden Lösung) in einem der Löcher in der Scheibe auf dem Kupfer Kühlstufe.
- Während der Beobachtung durch das Mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10fach Objektiv), sorgfältig durchdringen die Immersionsöl Schicht mit der Glaskapillare Spitze, und drücken Sie die Glasspritze (sehr fein), um eine kleine Menge (ca. 10 nl) des Proteins liefern Lösung, um eine 200 um Tropfen zu erzeugen.
- Verschließen Sie das Loch in der Kühlstufe mit dem Double-Layer-Deckglas-Baugruppe (siehe die vorläufigen Procedures).
3. TH Activity Measurement
- Press die Kühlung Taste und stellen Sie die Temperatur auf -40 ° C.
- Zunächst wird die Lösung Tropfen klar sein. Bei niedrigen Temperaturen, typischerweise im Bereich von -30 ° C bis -35 ° C, das Tröpfchen die Farbe ändert, was anzeigt, dass die Lösung eingefroren wurde. Unmittelbar nachdem die Probe eingefroren, erhöhen Sie die Temperatur langsam bis die Masse Eis beginnt zu schmelzen. Eine schrittweise Erhöhung der Temperatur ist erforderlich, um ein Überschwingen der Temperatur, die in dem vollständigen Schmelzen der Probe führen könnten, zu vermeiden.
- Wechseln Sie zu einem 50x Objektiv und beginnen, um das Eis durch Einstellen der Temperatur schmelzen. Diese Anpassung ist interaktiv und die letzten Schritte sind typischerweise unter Verwendung von kleinen Schritten Temperatur von 0.002 ° C. Weiter zu schmelzen, bis ein Einkristall bleibt. Die endgültige Größe des Kristalls sollte etwa 10 um betragen. Die höchste Temperatur, bei der Schmelztemperatur aufgehört hat festgestellt wird der Schmelzpunkt zu sein und ist genau in der späteren Videoanalyse Stufe bestimmt. <li> Stellen Sie die Temperatur um ein paar Hundertstel Grad Celsius unter dem Schmelzpunkt des Kristalls und beginnen einen Temperaturanstieg mit einer 10 min Verspätung. Passen Sie die Anstiegsrate wie gewünscht. Während dieser Zeit wird der Kristall mit den IBPs ausgesetzt werden.
- Nach Abschluss der 10 min Einwirkzeit wird die Temperatur automatisch zu verringern, unter der Kontrolle des LabVIEW Routine.
- Beachten Sie die Kristallform, wenn die Temperatur sinkt. An einem gewissen Punkt kann die plötzlichen Platzen der Eiskristall beobachtet werden. Die Temperatur, bei der dies der Fall ist, wie der Kristall Bersttemperatur vermerkt.
- Verwenden Videoanalyse um die genaue Schmelzpunkt und die Burst Temperatur zu bestimmen. Erstens, indem Videoanalyse, finden Sie die genaue Schmelzpunkt. Erinnern, dass die höchste Temperatur, bei der das Schmelzen aufgehört hat bestimmt wird, der Schmelzpunkt ist. Dokumentieren Sie dieses Schmelzpunkt in einem Tabellenkalkulationsprogramm. Dann bestimmen die genaue crystal Bersttemperatur und dokumentieren diesen Wertsowie. Der Unterschied zwischen dem Schmelzpunkt und dem Gefrierpunkt oder Kristall Bersttemperatur ist die thermische Hysterese-Aktivität des IBP Lösung.
4. Die Messung der Zeit-abhängigen TH Activity
- Folgen dem Protokoll in Abschnitte von 3,1 bis 3,3 beschrieben, um einen Einkristall aus Eis herzustellen.
- Nach der Bildung des Kristalls, die Verzögerungszeit der Rampe wie gewünscht, und schalten Sie auf die Rampe.
- Die Temperatur wird mit einem festen Zinssatz zu verringern (nach der Betreiber-Anforderungen) automatisch, sobald die Rampe Verzögerungszeit abgelaufen ist.
- Dokumentieren die Temperatur, bei der der Kristall-Burst auftritt. Berechnen der Belichtungszeit (die Zeit zwischen Kristallbildung und dem Kristall Burst).
- Wiederholen des Versuchs für verschiedene Verzögerungszeiten und Plotten der TH-Aktivität in Abhängigkeit von der Belichtungszeit, um die Zeit-Abhängigkeit der TH-Aktivität zu bewerten.
Representative Results
Messung der Zeitabhängigkeit TH
Die LabVIEW-betriebenen Nanoliter Osmometer erleichtert die Durchführung von genauen TH-Aktivität Messungen. Die konstante Temperatur Reduktionsrate erlaubt die Messung der Zeitabhängigkeit TH. Die genaue Temperatursteuerung durch die Nanoliter Osmometer aktiviert war entscheidend für diese Experimente. Die Belichtungszeit von einem Eiskristall zu den IBPs in Lösung wird als die Zeitdauer von der Bildung des Kristalls (das Ende der Schmelzvorgang), bis der plötzliche Wachstum von Eis um den Kristall (Kristall Burst) definiert. Wir fanden, dass die Belichtungszeit der Eiskristalle zu den IBPs entscheidend die TH-Aktivität beeinflusst. Kurze Zeiträume IBP Exposition (ein paar Sekunden) produziert eine geringe TH-Aktivität in der Mp IBP-GFP-Lösung (2,4 uM) (Abbildung 5). Der TH-Aktivität mit IBP Belichtungszeit erhöht, bis sie ein Plateau bei 4 min IBP Exposition erreicht. Bei höheren IBP Konzentrationen, die Platteau wurde in kürzeren Zeiten erreicht.
Abbildung 1. Schematische Darstellung IBPs Eis adsorbiert. Angenommen mit Genehmigung vom 10.
Abbildung 2. Die Kühlstufe. A) zu Rohren auf dem Mikroskop verbunden. B) Ohne die obere Führung. C) Schematische Darstellung.
Abbildung 3. Screenshot des LabVIEW-Schnittstelle. Click hier, um größere Zahl anzuzeigen.
Abbildung 4. Temperaturstabilität graph. Der Temperaturregler wurde eingestellt, um die Temperatur 0,01 ° C alle 15 Sekunden zu senken.
Abbildung 5. Mp IBP TH-Aktivität als Funktion der Eiskristall Belichtungszeit auf den IBPs. Jeder Zeitpunkt ist der Durchschnitt von 3-6 Experimenten.
Discussion
Diese Arbeit zeigt, das den Betrieb eines computergesteuerten Nanoliter Osmometer, die genaue Messungen der TH-Aktivität ermöglicht außerordentlich Temperaturregelung. In jeder Temperatur-sensiblen System müssen unerwünschte Temperaturgradienten vermieden werden. Um Temperaturgradienten in der hier dargestellten Vorrichtung zu vermeiden, muss die Testlösung Tröpfchens in der Mitte ein Loch in der Kupferscheibe Kühlstufe (Schritt 2,7) positioniert werden. Außerdem sollte der Einkristall in der Mitte des Tropfens statt der Nähe der Ränder sein (in den meisten Fällen ist diese spontan geschehen). Die Zeitabhängigkeit beschrieben anzeigt, dass die Abkühlrate kann die TH Messwerte beeinflussen. Somit schlagen wir mit einem Bericht mit der Zeit, während der der Kristall zu der Lösung wurde vor dem Abkühlen ausgesetzt sowie der Abkühlgeschwindigkeit. Wir in der Regel warteten 10 Minuten vor dem Herunterfahren der Temperatur, bei 0,01 ° C Schritten zu je 4 sec.
Die LabVIEW-gesteuerte ZusammenarbeitOling Stufe wurde für die Verwendung mit einem inversen Mikroskop, auf der mikrofluidischen Vorrichtungen thermisch manipuliert werden könnten angepasst. Dieses System erleichtert die Durchführung der Lösung Austausch Experimente mit Eiskristallen und IBPs mit eGFP 9, 10, 16 markiert. Die LabVIEW-gesteuerte System kann zu einer Clifton Bühne, indem Sie das 3040 Temperaturregler über ein bestimmtes Anpassung Stromkreis angepasst werden. Ein solches System ist im Labor Davies 17 betrieben. Die Software NI LabVIEW und der designierte Anpassung Stromkreis Entwurf für das Clifton Bühne sind auf Anfrage erhältlich.
Abschließend beschreiben wir eine Nanoliter Osmometer, die das empfindliche Kontrolle und Manipulation der Temperatur und die Geschwindigkeit des Temperaturanstiegs Zunahme und Abnahme (mit 0,002 ° C Empfindlichkeit), mit einem Video-Schnittstelle über eine LabVIEW-Routine für die Echtzeit-Analyse koordiniert erleichtert. Dieses System kann reproduzierbaren Rate-kontrollierte Experimente, die importan sindt zur Untersuchung der Kinetik der IBP Interaktionen mit Eis. Solche Experimente angehen können mehrere lange diskutierte Fragen rund um den Wirkmechanismus von IBPs.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der ISF, NSF und ERC unterstützt. Wir möchten technische Hilfe mit der Temperatur Etappe von Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer und Jeremy Dennison anzuerkennen. Unterstützung bei der Software-Entwicklung wurde von Oder Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy und Sumit Bhattachary vorgesehen. Wir möchten unsere Mitarbeiter Prof. Peter L. Davies und Dr. Laurie A. Graham für den Mp IBP Protein und hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch lab Mitglieder Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr. Yeliz Celik, Dr. Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy und Shlomit Guy für ihre Benutzer-Feedback.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
