Summary
Proteine leganti ghiaccio (IBPs), noto anche come proteine antigelo, inibiscono la crescita di ghiaccio e sono un additivo promettente per l'uso nella crioconservazione dei tessuti. Lo strumento principale utilizzato per indagare IBPs è il osmometro nanolitri. Abbiamo sviluppato una casa progettata fase di raffreddamento montato su un microscopio ottico e controllato utilizzando un custom-built routine di LabVIEW. Il osmometro nanolitri qui descritto manipolato la temperatura del campione in un ultra-minuscole.
Protocol
0. Procedure preliminari
- Capillare di vetro per l'iniezione soluzione. Utilizzando un estrattore capillare (Narishige, Tokyo, Giappone), preparare una pipetta con una forte apertura multa da un tubo capillare di vetro micro (Marca GMBH, Wertheim, Germania). La dimensione dell'apertura deve essere verificata facendo passare aria attraverso il capillare per ottenere bubbling bene in acqua pulita. Se il capillare è chiuso, si può aprirlo rompendo il bordo. Ciò può essere realizzato per stampaggio o graffiare delicatamente contro l'acqua contenente pareti del tubo. Preparare il capillare tale che l'apertura è quasi bloccata, ma sufficientemente aperta per consentire la formazione di bolle sub-millimetri.
- Pulizia del disco di rame. Sonicare i dischi di rame per 10 min a 0,1% Micro-90 sapone (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, Stati Uniti d'America), poi lavare con acqua bidistillata. Introdurre i dischi in un (tecnico) soluzione di isopropanolo e sonicare ancora per 10 min. Pinnaalleato, asciugare i dischi con aria filtrata. Questa fase di pulizia è fondamentale per evitare la contaminazione tra esperimenti IBP.
- Doppio strato di montaggio coprioggetti. Gruppo coprioggetti è stato preparato per consentire l'osservazione del campione senza condensa di umidità sulla superficie del vetro di copertura. Questo è stato ottenuto inserendo una (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) Drierite particelle (2 mm di diametro) tra due vetrini che poi sono stati incollati con una pistola per colla a caldo. Questa configurazione impedisce condensa che potrebbe bloccare la vista quando il campione è stato raffreddato a basse temperature e rimosso la necessità di soffiare aria secca sulla finestra di osservazione.
1. Fase di raffreddamento Set-up
- Collegare l'ingresso del flusso d'acqua e di uscita della fase di raffreddamento a 4 mm di diametro interno tubi Tygon (Saint-Gobain, Parigi, Francia), e collegare il tubo di flusso dell'acqua in ingresso ad una pompa dell'acqua.
- Collegare un tubo interno 4 mm di diametro Tygon all'ingresso del t stadio di raffreddamentoo fornire aria secca. L'aria è stata essiccata con un in-linea di colonna Drierite.
- Far funzionare le pompe di aria e acqua. Si noti che gli elementi di raffreddamento non dovrebbe essere eseguito senza un dissipatore di calore.
- Accendere il regolatore di temperatura, macchina fotografica, e di routine LabVIEW.
2. Preparazione del campione
- Posizionare una gocciolina 3-4 pl di olio B immersione (Cargille laboratori, Cedar Grove, New Jersey, USA) sul lato posteriore di un disco diametro 7 mm rame avente fori 500 micron perforati attraverso il disco.
- Posizionare il disco di rame sulla fase di raffreddamento con il lato rivolto verso il basso immersione in olio.
- Collegare il tubo capillare (il bordo smussato) ad un tubo di diametro interno 0,7 millimetri Tygon collegata all'altra estremità ad una siringa 2 ml di vetro (Poulten-Graf, Wertheim, Germania).
- Prima di utilizzare il tubo capillare, controllare la piccola apertura del capillare per garantire che l'apertura è una dimensione appropriata (vedere le procedure preliminari).
- Inserire lentamente il GLAss capillare nella provetta preparato proteina IBP (2,4 pM Mp IBP-GFP in 20 mM CaCl 2 e 25 mM Tris-HCl a pH 8, vedi riferimento 10 per i dettagli di preparazione) e tirare la siringa di vetro fino a quando il capillare di vetro contiene 0,1 pl della soluzione proteica.
- Iniziare la registrazione video tramite il software LabVIEW.
- Inserire il bordo tagliente del capillare di vetro (contenente la soluzione di proteina) in uno dei fori del disco di rame in fase di raffreddamento.
- Osservando al microscopio (Olympus, Tokyo, Giappone, obiettivo 10x), con attenzione penetrare lo strato di olio di immersione con la punta capillare di vetro, e premere la siringa di vetro (molto delicatamente) per fornire una piccola quantità (~ 10 nl) della proteina soluzione per creare un droplet 200 micron.
- Coprire il foro nella fase di raffreddamento con il gruppo a doppio strato coprioggetto (consultare le procedure preliminari).
3. TH attività di misura
- Press il pulsante di raffreddamento e la temperatura a -40 ° C.
- Inizialmente, la goccia soluzione sarà limpida. A basse temperature, tipicamente nel campo da -30 ° C a -35 ° C, il colore gocciolina cambia, indicando che la soluzione è stata congelata. Immediatamente dopo che il campione è congelato, aumentare la temperatura lentamente finché il ghiaccio bulk inizia a fondere. Un graduale aumento della temperatura è necessaria per evitare il superamento della temperatura che potrebbe portare alla completa fusione del campione.
- Passare a un obiettivo 50x e cominciare a sciogliere il ghiaccio con regolazione della temperatura. Questa regolazione è interattivo, e le fasi finali sono in genere eseguita con passi piccoli temperatura di 0,002 ° C. Continuare a fondere fino a quando rimane un singolo cristallo. La dimensione finale del cristallo deve essere di circa 10 micron. La massima temperatura alla quale ha cessato di fusione è determinato essere il punto di fusione ed è determinata con precisione nella fase successiva analisi video. <li> Impostare la temperatura di pochi centesimi di un grado Celsius sotto del punto di fusione del cristallo e iniziare una rampa di temperatura con un ritardo di 10 min. Regolare la velocità di rampa come desiderato. Durante questo tempo, il cristallo viene esposto ai IBPs.
- Al termine del tempo di 10 minuti di esposizione, la temperatura diminuisce automaticamente sotto il controllo della routine LabVIEW.
- Osservare la forma di cristallo al diminuire della temperatura. Ad un certo punto, l'improvviso scoppio del cristallo di ghiaccio può essere osservato. La temperatura alla quale si verifica ciò è notato come la temperatura scoppio cristallo.
- Utilizzare video analisi per determinare il punto preciso fusione e la temperatura di scoppio. In primo luogo, con l'analisi video, trovare il punto esatto di fusione. Ricordiamo che la temperatura massima alla quale ha cessato di fusione è determinato essere il punto di fusione. Documentare questo punto di fusione in un programma di foglio di calcolo. Quindi, determinare la precisa temperatura scoppio cristallo, e documentare questo valorepure. La differenza tra il punto di fusione e il punto di congelamento, o temperatura scoppio cristallo, è l'attività isteresi termica della soluzione IBP.
4. Misura della funzione del tempo di attività TH
- Seguire il protocollo descritto nelle sezioni 3,1-3,3 per preparare un singolo cristallo di ghiaccio.
- Dopo la formazione del cristallo, impostare il tempo di ritardo della rampa nel modo desiderato, e accendere la rampa.
- La temperatura diminuirà ad un tasso fisso (a seconda delle esigenze degli operatori) automaticamente una volta che il tempo di ritardo rampa è passato.
- Documentare la temperatura alla quale si verifica la rottura di cristallo. Calcolare il tempo di esposizione (tempo tra la formazione di cristalli e lo scoppio cristallo).
- Ripetere l'esperimento per diversi tempi di ritardo e tracciare l'attività TH come funzione del tempo di esposizione per valutare la dipendenza dal tempo dell'attività TH.
Representative Results
Misurazione della dipendenza dal tempo TH
Il LabVIEW azionati osmometro nanolitri facilita l'esecuzione di misure accurate attività TH. La costante di velocità di riduzione della temperatura consentita la misurazione della dipendenza dal tempo TH. Il controllo preciso della temperatura abilitato dal osmometro nanolitri era cruciale per questi esperimenti. Il tempo di esposizione di un cristallo di ghiaccio ai IBPs in soluzione è definita come il periodo di tempo dalla formazione del cristallo (la fine del processo di fusione), finché la crescita improvvisa di ghiaccio intorno al cristallo (burst cristallo). Abbiamo trovato che il tempo di esposizione dei cristalli di ghiaccio ai IBPs dipende moltissimo l'attività TH. Brevi periodi di esposizione IBP (alcuni secondi) prodotto una bassa attività TH nell'IBP-GFP soluzione Mp (2,4 pM) (Figura 5). L'attività TH aumentato con il tempo di esposizione IBP fino a raggiungere un plateau a esposizione min 4 IBP. A concentrazioni più elevate IBP, la piastraau è stato raggiunto in tempi più brevi.
Figura 1. IBPs diagramma schematico che illustra adsorbito al ghiaccio. Adottato con il permesso di 10.
Figura 2. La fase di raffreddamento. A) collegate a tubazioni sul microscopio. B) Senza la guida superiore. C) Schema di principio.
Figura 3. Schermata di interfaccia LabVIEW. Click qui per ingrandire la figura.
Figura 4. Stabilità grafico della temperatura. Il regolatore di temperatura è stato impostato per abbassare la temperatura di 0,01 ° C ogni 15 sec.
Figura 5. Mp attività TH IBP in funzione del tempo di esposizione ai cristalli di ghiaccio IBPs. Ogni punto rappresenta la media di tempo di 3-6 esperimenti.
Discussion
Questo lavoro illustra il funzionamento di un computer controllato osmometro nanolitri che permette misure accurate di attività TH con controllo della temperatura straordinario. In qualsiasi sistema sensibile alla temperatura, gradienti di temperatura desiderati devono essere evitati. Per evitare gradienti di temperatura nell'apparato qui presentato, la gocciolina di soluzione campione deve essere posizionato al centro di un foro nella fase di raffreddamento in rame disco (punto 2.7). Inoltre, il singolo cristallo dovrebbe essere al centro della goccia piuttosto che vicino ai bordi (nella maggior parte dei casi, ciò avverrà spontaneamente). La dipendenza dal tempo descritto indica che la velocità di raffreddamento può influenzare le letture TH. Pertanto, si suggerisce una relazione tra il tempo durante il quale il cristallo è stato esposto alla soluzione prima di raffreddamento, così come la velocità di raffreddamento. Abbiamo tipicamente aspettato 10 min prima rampa di discesa della temperatura a 0,01 ° C passaggi ogni 4 sec.
I LabVIEW controllati cofase oling stato adattato per l'uso con un microscopio invertito su cui dispositivi microfluidici potrebbe essere termicamente manipolato. Tale sistema facilita l'esecuzione di esperimenti di cambio soluzione con cristalli di ghiaccio e IBPs con etichetta eGFP 9, 10, 16. Il LabVIEW sistema controllato può essere adattata ad una fase Clifton collegando il regolatore di temperatura 3040 tramite un circuito di adattamento designato elettrico. Tale sistema viene utilizzato in laboratorio Davies 17. Il software LabVIEW e il designato disegno adegua circuito elettrico per la fase di Clifton sono disponibili su richiesta.
In conclusione, si descrive un osmometro nanolitri che facilita il controllo sensibile e la manipolazione della temperatura e il tasso di aumento e diminuzione della temperatura (con 0,002 ° C sensibilità), coordinati con un'interfaccia video attraverso una routine LabVIEW per analisi in tempo reale. Questo sistema può eseguire riproducibili tasso di esperimenti controllati che sono important per lo studio della cinetica delle interazioni IBP con ghiaccio. Tali esperimenti possono affrontare diverse a lungo dibattute questioni riguardanti il meccanismo d'azione di IBPs.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dalla ISF, NSF, e ERC. Vorremmo riconoscere aiuto tecnico con la fase di temperatura da Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, e Jeremy Dennison. Assistenza allo sviluppo del software è stato fornito da o Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy e Sumit Bhattachary. Vorremmo ringraziare i nostri collaboratori il Prof. Peter L. Davies e il dottor Laurie A. Graham per la proteina Mp IBP e utili discussioni. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, il dottor Yeliz Celik, il dottor Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, e Guy Shlomit per il loro feedback degli utenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
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