Summary
Ice белков (IBPs), также известный как антифриз белков, тормозят рост и льда являются перспективными добавка для использования в криоконсервация тканей. Основным инструментом, используемым для расследования IBPs является nanoliter осмометра. Мы разработали дом-разработаны стадии охлаждения установлены на оптическом микроскопе и управляются с помощью заказных LabVIEW рутины. Осмометра nanoliter описанных здесь манипуляций температуры образца в ультра-чувствительной манере.
Protocol
0. Предварительные процедуры
- Стеклянный капилляр для решения инъекций. Использование капиллярного съемника (Narishige, Токио, Япония), подготовить резкий пипетки с тонким открытия из стеклянного капилляра микро трубки (Brand GMBH, Wertheim, Германия). Размер отверстия должны быть проверены путем пропускания воздуха через капилляр для получения тонкой кипящей в чистой воде. Если капиллярная закрыт, то можно открыть его, разбивая ее края. Это может быть достигнуто путем нажатия или царапины это мягко по отношению к воде, содержащей стенок трубы. Подготовка капиллярные, что открытие почти заблокированы, но достаточно открыть, чтобы позволить формирование суб-миллиметровом пузыри.
- Медный диск очистки. Разрушать ультразвуком медных дисков в течение 10 мин в 0,1% Micro-90 мыло (Cole-Parmer, Вернон Хиллс, штат Иллинойс, США), затем промыть дистиллированной водой. Представьте дисков в изопропанол (техническое) решение, и разрушать ультразвуком в течение 10 мин. Плавниксоюзника, высушить диски, используя фильтрованный воздух. Такая очистка этап имеет решающее значение для предотвращения загрязнения IBP между экспериментами.
- Двойной слой покровного стекла сборки. Покровного стекла сборка была готова предоставить для выборочного наблюдения без конденсации влаги на поверхности стеклянной крышкой. Это было достигнуто путем размещения Drierite (WA Hammond Drierite, Ксения, штат Огайо, США) частицы (2 мм в диаметре) между двумя покровные, которые затем были склеены пистолет горячего клея. Эта конфигурация предотвратить конденсацию, которые могут блокировать зрения, когда образец охлаждают до низких температур и сняло необходимость дуть сухой воздух на смотровое окно.
1. Охлаждение Этап Настройка
- Подключите воды на входе и выходе потока из стадии охлаждения до 4 мм внутреннего диаметра трубы Tygon (Saint-Gobain, Париж, Франция), и подключить входной воды трубы водяного насоса.
- Подключите 4 мм, внутренний диаметр трубы Tygon на входе системы охлаждения т этапеO поставлять сухого воздуха. В воздухе сушат в линию Drierite колонки.
- Эксплуатация воздушных и водяных насосов. Обратите внимание, что охлаждающие элементы не должны работать без радиатора.
- Включите регулятор температуры, камеры и LabVIEW рутины.
2. Подготовка проб
- Поместите 3-4 мкл каплю иммерсионного масла B (Каргиль лабораторий, Cedar Grove, Нью-Джерси, США) на обратной стороне 7 мм, диаметр диска меди 500 мкм, имеющих отверстия, просверленные через диск.
- Расположите медный диск на стадии охлаждения с боковой погружения нефть вниз.
- Подключите капиллярная трубка (тупой край) до 0,7 мм, внутренний диаметр трубы Tygon связан с другого конца в 2 мл стеклянный шприц (Poulten-Граф, Wertheim, Германия).
- Перед использованием капиллярной трубке, проверьте небольшое отверстие капилляра для того, чтобы отверстие соответствующего размера (см. предварительные процедуры).
- Медленно вставьте GLAсс капилляр в подготовленную IBP белка пробирку (2,4 мкМ Мп IBP-GFP в 20 мМ CaCl 2 и 25 мМ Трис-HCl при рН 8, см. ссылку 10 для подготовки деталей) и вытащить стеклянный шприц, пока стеклянный капилляр содержит 0,1 мкл раствора белка.
- Начать запись видео с помощью программного обеспечения LabVIEW.
- Вставьте острый край стеклянного капилляра (содержащий раствор белка) в одно из отверстий в медных дисков на стадии охлаждения.
- При наблюдении в микроскоп (Olympus, Токио, Япония, 10-кратный объектив), осторожно проникают в слой иммерсионного масла с кончика стеклянного капилляра, а затем нажмите стеклянный шприц (очень тонко), чтобы доставить небольшое количество (~ 10 п) белка Решение создать 200 мкм капли.
- Закройте отверстие в стадии охлаждения с двойной сборки покровного стекла слоя (см. Предварительные процедуры).
3. Измерение активности TH
- Предварительноесс охлаждение кнопку и установите температуру до -40 ° C.
- Первоначально решение капля будет ясно. При низких температурах, как правило, в диапазоне от -30 ° C до -35 ° C, цвет капли изменения, указав, что решение было заморожено. Сразу же после пробы заморожены, повышение температуры медленно, пока основная лед начинает таять. Постепенное повышение температуры необходимо, чтобы избежать превышения температуры, что может привести к полному таянию образца.
- Переключить на 50x цель и начать, чтобы растопить лед, регулируя температуру. Эта настройка является интерактивным, и последние шаги, как правило, осуществляется с помощью маленьких шагов температуре 0,002 ° C. Продолжайте, пока расплава монокристалл остается. Окончательный размер кристалла должна быть около 10 мкм. Самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления и точно определить на более поздней стадии анализа видео. <li> Установить температуру на несколько сотых градуса Цельсия ниже температуры плавления кристалла и начать температуры рампа с задержкой 10 минут. Отрегулируйте наращивает скорость по желанию. За это время кристалл будет подвергаться IBPs.
- После завершения 10 раз экспозиция мин, температура будет уменьшаться автоматически под контроль процедуру LabVIEW.
- Соблюдайте формы кристалла при понижении температуры. В какой-то момент, внезапный взрыв кристаллов льда могут быть обнаружены. Температура, при которой это происходит, отметил, как температура взрыва кристалла.
- Используйте видео анализ, чтобы определить точную температуру плавления и всплеск температуры. Во-первых, с помощью анализа видео, найти точную температуру плавления. Напомним, что самая высокая температура, при которой плавление перестал определяется как температура плавления. Запишите этот температуру плавления в программе электронных таблиц. Затем, определить точную температуру взрыва кристалла, и документировать это значение, а также. Разница между температурой плавления и замерзания, или температура кристалла взрыв, является тепловая активность гистерезиса решение IBP.
4. Измерение зависимости от времени TH активность
- Следуйте протоколу, описанному в разделах 3.1-3.3 подготовить единый кристалл льда.
- После образования кристаллов, установить время задержки рампы по желанию, и включить рампы.
- Температура снизится по фиксированной ставке (в соответствии с требованиями операторов) автоматически, как только темпа задержки.
- Документ температуры, при которой происходит взрыв кристалла. Рассчитайте время экспозиции (время между образованием кристаллов и кристаллов взрыв).
- Повторите эксперимент для различных времен задержки и построить TH деятельности в зависимости от воздействия времени, чтобы оценить зависимость от времени TH деятельности.
Representative Results
Измерение зависимости от времени TH
LabVIEW управлением nanoliter осмометра облегчает выполнение точных измерений активности TH. Постоянную скорость снижения температуры допускается измерение зависимости от времени TH. Точный контроль температуры включен по осмометра nanoliter имеет решающее значение для этих экспериментов. Выдержка из кристаллов льда в IBPs в растворе определяется как период времени с образованием кристаллов (конец процесса плавления) до внезапного роста льда вокруг кристалла (кристалл взрыв). Мы обнаружили, что время воздействия кристаллов льда в IBPs решающее влияние на TH деятельности. Короткие периоды IBP экспозиции (несколько секунд) производится низкой активности TH в МП IBP-GFP решение (2,4 мкм) (рис. 5). TH деятельности увеличилась с IBP время экспозиции пока не достигли плато на 4 мин экспозиции IBP. При более высоких концентрациях IBP, пластиныAu была достигнута на короткое время.
Рисунок 1. Схематическое IBPs адсорбированных на льду. Принято с разрешения 10.
Рисунок 2. Стадии охлаждения. A) связи на трубы на микроскопе. Б) без верхней свинца. C) схема.
Рисунок 3. Скриншот интерфейса LabVIEW. ClИк здесь, чтобы просмотреть большую фигуру.
Рисунок 4. График температурной стабильности. Регулятор температуры был установлен, чтобы понизить температуру 0,01 ° C каждые 15 сек.
Рисунок 5. Mp IBP TH деятельности в зависимости от игрового времени экспозиции кристалла в IBPs. Каждый раз, дело в том, среднее из 3-6 экспериментов.
Discussion
Эта работа демонстрирует работу с компьютерным управлением nanoliter осмометра, что обеспечивает точное измерение TH деятельности с необычайной контроля температуры. В любом чувствительные к температуре системы, нежелательные температурные градиенты следует избегать. Чтобы избежать температурных градиентов в аппарате представлены здесь, капли исследуемого раствора должна быть расположена в центре отверстие в охлаждении медный диск этап (шаг 2,7). Кроме того, в одном кристалле должны быть в центре капли, а не по краям (в большинстве случаев, это произойдет спонтанно). Зависимость от времени описано показывает, что скорость охлаждения может повлиять на TH показания. Таким образом, мы предлагаем в том числе отчета о времени, в течение которого кристалл подвергается раствор до охлаждения, а также от скорости охлаждения. Как правило, мы ждали 10 минут до наращивает вниз температура на 0,01 ° C шаги каждые 4 сек.
LabVIEW совместно контролируемыхОлинг этапе был адаптирован для использования с помощью инвертированного микроскопа, на котором микрофлюидных устройства могут быть термически манипулировать. Эта система облегчает выполнение решений обмена эксперименты с кристаллами льда и IBPs отмеченных УЗФБ с 9, 10, 16. LabVIEW-управляемая система может быть адаптирована к сцене Clifton, подключив 3040 Регулятор температуры с помощью назначенных адаптации электрической цепи. Такая система работает в лаборатории Дэвис 17. Программное обеспечение LabVIEW и назначенный адаптации электрических схем для сцены Clifton предоставляются по запросу.
В заключение мы описываем nanoliter осмометра, что облегчает чувствительной контроля и манипуляции температуру и скорость увеличения температуры и уменьшение (с чувствительностью 0,002 ° C), согласованный с видео интерфейс, с помощью LabVIEW для рутинного анализа в реальном времени. Эта система может выполнять воспроизводимые скорости контролируемых экспериментов, которые являются importanт для исследования кинетики IBP взаимодействия со льдом. Такие эксперименты могут решить ряд давно обсуждаемая вопросы, связанные с механизмом действия IBPs.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано ISF, NSF, и ERC. Мы хотели бы отметить техническую помощь с температурой этапе от Рэнди Milford, Майкл Корен, Даг Шефер, и Джереми Dennison. Помощь в разработке программного обеспечения были предоставлены Или Чэнь, Сюй Ди, Раджеш Sannareddy, и Sumit Bhattachary. Мы хотели бы поблагодарить наших сотрудников Профессор Питер Л. Дэвис и доктор Лори А. Грэмом для белка Мп IBP и полезные обсуждения. Мы также благодарим лабораторию члены доктор Майя Бар-Dolev, Yangzhong Цинь, доктор Yeliz Челик, д-р Наталья Pertaya, Орталь Mizrahy, и Шломит Guy за их обратную связь с пользователем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
