Summary
Ice proteiner (aktørene kan), også kjent som frostvæske proteiner, hemmer isen vekst og er en lovende additiv for anvendelse ved kryopreservering av vev. Det viktigste verktøyet som brukes til å undersøke aktørene kan er nanoliter osmometer. Vi utviklet en hjemme-laget kjøletrinn montert på et optisk mikroskop og kontrollert ved hjelp av en spesialbygd LabVIEW rutine. Den nanoliter osmometer beskrives her manipulert prøvetemperaturen i en ultra-sensitiv måte.
Protocol
0. Foreløpige Prosedyrer
- Glass kapillær for løsning injeksjon. Ved hjelp av en kapillær avtrekker (Narishige, Tokyo, Japan), utarbeide en skarp pipette med en fin åpning fra et glass kapillær micro tube (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Størrelsen på åpningen bør verifiseres ved å føre luft gjennom kapillære å skaffe fint bobler i rent vann. Hvis kapillær er lukket, så kan man åpne den ved å bryte sin kant. Dette kan oppnås ved å trykke eller skrape den forsiktig mot vann inneholdende rørvegger. Forbered kapillæret slik at åpningen nærmest blokkert men er åpent tilstrekkelig å tillate dannelsen av sub-millimeter bobler.
- Kobber plate rengjøring. Sonicate kobber plater i 10 min i 0,1% mikro-90 såpe (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), og deretter vaske med dobbelt-destillert vann. Introduser plater i en isopropanol (teknisk) løsning og sonicate igjen i 10 min. Finalliert, tørke plater med filtrert luft. Denne rengjøring fasen er avgjørende for å unngå IBP kontaminering mellom eksperimenter.
- Dobbelt-lags coverglass montering. En coverglass montering var forberedt på å tillate prøven observasjon uten kondensering fuktighet på forsiden glassflaten. Dette ble oppnådd ved å plassere en Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikkel (2 mm i diameter) mellom to dekkglass som ble deretter limt med et varmt lim pistol. Denne konfigurasjonen forhindret kondens som kan blokkere visning når prøven ble avkjølt til lave temperaturer og fjernet behovet for å blåse tørr luft på måletiden.
1. Kjøling Stage Set-up
- Koble vannstrømmen innløp og utløp av kjøling scenen til 4 mm indre diameter Tygon rør (Saint-Gobain, Paris, Frankrike), og koble vannstrømmen innløpsrøret til en vannpumpe.
- Koble en 4 mm indre diameter Tygon rør til innløpet av kjøletrinn to levere tørr luft. Luften ble tørret ved hjelp av en in-line Drierite kolonne.
- Betjene luft og vann pumper. Legg merke til at kjøleelementer ikke skal kjøres uten en kjøleribbe.
- Slå på temperaturregulatoren, kamera, og LabVIEW rutine.
2. Prøvepreparering
- Plasser en 3-4 ul dråpe immersjonsolje B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på baksiden av en 7 mm diameter kobber skive som har 500 mikrometer hull boret gjennom platen.
- Plasser kobber plate på kjøling scenen med immersjonsolje siden ned.
- Koble kapillærrøret (den butte kant) til en 0,7 mm indre diameter Tygon rør forbundet i den andre enden til en 2 ml glassprøyte (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland).
- Før bruk av kapillarrør, kontrollerer den lille åpningen i kapillarrøret for å sikre at åpningen er en passende størrelse (se Preliminary prosedyrer).
- Sett den langsomt glass kapillær i forberedt IBP proteinet prøverør (2,4 uM Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl 2 og 25 mM Tris-HCl ved pH 8, se referanse 10 for fremstilling detaljer) og trekk glassprøyte før glasset kapillarrøret inneholder 0,1 ul av proteinoppløsningen.
- Begynn videoopptak via LabVIEW.
- Sett den skarpe kanten av glasset kapillær (inneholder proteinet løsning) i en av hullene i den kobber-plate på kjøletrinn.
- Mens observere gjennom mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x objektiv), nøye penetrere nedsenking oljelaget med glasset kapillær spissen, og trykk glassprøyte (svært delikat) å levere en liten mengde (~ 10 nl) av proteinet løsning for å lage en 200 mikrometer dråpe.
- Dekke hullet i kjølesystemet scenen med dobbelt lag coverglass montering (se Innledende prosedyrer).
3. TH Aktivitet Måling
- Press kjøling knappen og still inn temperaturen til -40 ° C.
- I første omgang vil løsningen droplet være klart. Ved lave temperaturer, typisk i området -30 ° C til -35 ° C, dråpe skifter farge, noe som indikerer at løsningen har vært frosset. Umiddelbart etter at prøven er frosset, øke temperaturen langsomt til bulk isen begynner å smelte. En gradvis økning av temperaturen er nødvendig for å unngå overshooting av temperaturen som kan resultere i den fullstendige smelting av prøven.
- Bytte til en 50x objektiv og begynner å smelte isen ved å justere temperaturen. Denne justeringen er interaktivt, og de siste trinnene er vanligvis utføres ved hjelp av små temperaturforskjeller trinn på 0,002 ° C. Fortsett å smelte til en enkelt krystall gjenstår. Den endelige størrelsen på krystall bør være rundt 10 mikrometer. Den høyeste temperatur ved hvilken smelting har opphørt er bestemt til å være smeltepunktet og bestemmes nøyaktig i senere videoanalyse stadium. <li> Sett temperaturen på noen få hundredeler av en grader Celsius under smeltepunktet av krystallen og begynne en temperatur rampe med en 10 min forsinkelse. Juster ramping sats som ønsket. I løpet av denne tiden vil krystallen bli utsatt for aktørene kan.
- Ved gjennomføring av 10 min eksponeringstid, vil temperaturen reduseres automatisk under kontroll av LabVIEW rutinen.
- Observere krystall form som temperaturen synker. På et tidspunkt, kan den plutselige utbrudd av isen krystall følges. Temperaturen ved hvilken dette skjer er kjent som krystall burst temperatur.
- Bruke video analyse for å fastslå den nøyaktige smeltepunkt og burst temperatur. Først, ved hjelp av video-analyse, finne nøyaktig smeltepunkt. Husker at den høyeste temperaturen ved hvilken smelting har opphørt er bestemt til å være smeltepunktet. Dokumentere denne smeltepunkt i et regnearkprogram. Deretter bestemmer den nøyaktige krystall burst temperatur og dokumentere denne verdienså vel. Forskjellen mellom smeltepunktet og frysepunktet, eller krystall burst temperatur, er den termiske hysterese aktiviteten IBP løsningen.
4. Måling av Tidsavhengig TH aktivitet
- Følg protokollen beskrevet i punkt 3.1 til 3.3 for å forberede en enkelt krystall av is.
- Etter dannelsen av krystallen, stille inn forsinkelsen av rampen som ønsket, og slå på rampen.
- Temperaturen vil synke til en fast rente (i henhold til operatørenes krav) automatisk når rampen forsinkelsen har gått.
- Dokument temperaturen ved hvilken krystall burst oppstår. Beregn eksponeringen (tiden mellom krystalldannelse og krystallen burst).
- Gjenta eksperimentet for ulike forsinkelsestidene og plotte TH aktivitet som en funksjon av eksponeringstiden for å evaluere den tid-avhengighet av TH aktivitet.
Representative Results
Måling av TH tidsavhengighet
LabVIEW-opererte nanoliter osmometer forenkler utførelsen av nøyaktige TH aktivitetsmålinger. Konstant temperatur reduksjonsforhold tillates måling av TH tidsavhengighet. Den nøyaktig temperaturkontroll aktivert av nanoliter osmometer var avgjørende for disse eksperimentene. Eksponeringstiden av et iskrystall til aktørene kan i oppløsning er definert som tidsrommet fra dannelsen av krystallen (slutten av smelteprosessen) inntil plutselig vekst av is rundt krystallen (crystal burst). Vi fant at eksponeringstid iskrystallene til aktørene kan avgjørende påvirket TH aktivitet. Kortvarig IBP eksponering (noen sekunder) ga en lav TH aktivitet i Mp IBP-GFP-oppløsning (2,4 uM) (figur 5). TH aktiviteten økte med IBP eksponering tid før det nådde et platå på 4 min IBP eksponering. Ved høyere konsentrasjoner IBP, tallerkenenau ble nådd på kortere tid.
Figur 1. Skjematisk diagram som illustrerer aktørene kan adsorberes til is. Vedtatt med tillatelse fra 10.
Figur 2. Kjølesystemet scenen. A) Koblet til rør på mikroskopet. B) Uten øvre ledelsen. C) Prinsippskisse.
Figur 3. Skjermbilde av LabVIEW grensesnittet. Click her for å se større figur.
Figur 4. Temperaturstabilitet grafen. Temperaturregulatoren ble satt til å senke temperaturen 0,01 ° C hver 15 sek.
Figur 5. Mp IBP TH aktivitet som en funksjon av iskrystall eksponeringstid til aktørene kan. Hvert tidspunkt er gjennomsnittet av 3-6 eksperimenter.
Discussion
Dette arbeidet viser driften av en datastyrt nanoliter osmometer som muliggjør nøyaktige målinger av TH aktivitet med ekstraordinær temperaturkontroll. I hvilken som helst temperatur-følsomt system, må uønskede temperaturgradienter unngås. Å unngå temperaturgradienter i anordningen presentert her, må prøveløsningen dråpen være plassert i sentrum av et hull i platen kobber kjøletrinn (trinn 2.7). I tillegg bør enkelt krystall være i sentrum av dråpesamleren snarere enn nær kantene (i de fleste tilfeller vil dette skje spontant). Den tidsavhengighet beskrevet indikerer at avkjølingshastighet kan påvirke TH avlesningene. Således, foreslår vi inkludert en rapport av tiden hvorunder krystaller ble eksponert til oppløsningen før kjøling, så vel som den avkjølingshastighet. Vi vanligvis ventet 10 min før ramping ned temperaturen ved 0,01 ° C trinnene hver 4 sek.
LabVIEW-kontrollerte cooling stadium ble tilpasset for bruk med en invertert mikroskop som microfluidic enheter kunne være termisk manipulert. Dette systemet forenkler utførelsen av løsningen utveksling forsøk med iskrystaller og aktørene kan tagget med 9 eGFP, 10, 16. LabVIEW-kontrollert system kan tilpasses en Clifton stadium ved å koble 3040 temperaturregulatoren via en utpekt tilpasse strømkrets. Et slikt system er operert i Davies lab 17. LabVIEW software og den utpekte tilpasse elektrisk krets design for Clifton scenen er tilgjengelig på forespørsel.
Som konklusjon, beskriver vi en nanoliter osmometer som forenkler nøyaktig kontroll og manipulering av temperatur og hastigheten av temperaturøkning og reduksjon (med 0,002 ° C sensitivitet), koordinert med en video-grensesnitt gjennom en LabVIEW rutine for sanntids analyse. Dette systemet kan utføre reproduserbare rente-kontrollerte eksperimenter som er important for å undersøke kinetikken av IBP interaksjoner med is. Slike eksperimenter kan løse flere lange debattert spørsmål rundt virkningsmekanismen til aktørene kan.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av ISF, NSF, og ERC. Vi ønsker å erkjenne teknisk hjelp med temperaturen scenen fra Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, og Jeremy Dennison. Bistand med utvikling av programvare ble levert av Eller Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy, og Sumit Bhattachary. Vi vil gjerne takke våre samarbeidspartnere Prof Peter L. Davies og Dr. Laurie A. Graham for Mp IBP protein og nyttige diskusjoner. Vi vil også takke lab medlemmer Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr. Yeliz Celik, Dr. Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, og Shlomit Guy for deres tilbakemeldinger fra brukerne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immersion oil Type B | Cargille Laboratories | 16484 | |
| Drierite | W.A. Hammond Drierite | 043063 2270g | |
| Micro 90 cleaning solution |  Cole-Parmer |
EW-18100-11 | |
| Capillary puller | Narishige | PB-7 | |
| Glass capillary tubes | Brand GNBH | 7493 21 | 75 mm long, 1.15 diameter |
| Temperature controller | Newport, Irvine, California, United States | Model 3040 | Model 3040 |
| Light microscope | Olympus | Model BH2 | |
| 10x objective | Olympus | S Plan 10, 0.3, 160/0.17 | |
| 50x objective | Nikon | CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD | |
| CCD Camera | Provideo | CVC-140 | |
| Tygon tubes | Saint-Gobain, Paris, France | Tygon Formulation S-50-HL Tubing | |
| Glass syringe (2 ml) | Poulten-Graf, Wertheim, Germany | 7 10227 | |
| GPIB-PCI card | National instruments, Austin, Texas, USA | 778032-01 | |
| Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 | National instruments, Austin, Texas, USA | 322156B-01 | |
| LabVIEW System Design Software | National instruments, Austin, Texas, USA | Version 8 | |
| DiVx Author software | DiVx LLC, San Diego, CA, USA |
References
- DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
- Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
- Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
- Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
- Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
- Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
- Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
- Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
- Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
- Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
- Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
- Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
- Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
- Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
- Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
- Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
- Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
