Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة

Published: February 4, 2013 doi: 10.3791/4189
Automatic Translation
1,2, 1
1Institute of Biochemistry, Food Science, and Nutrition , The Robert H. Smith Faculty of Agriculture, Food, and Environment, The Hebrew University of Jerusalem, 2Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

البروتينات ملزمة الجليد (IBPs)، المعروف أيضا باسم البروتينات التجمد، وتمنع نمو الجليد واعدة هي المضافة لاستخدامها في الحفظ بالتبريد من الأنسجة. الأداة الرئيسية المستخدمة لتحقيق IBPs هو مقياس التناضح نانولتر. وضعنا منزل التصميم مرحلة التبريد التي شنت على المجهر الضوئي والتحكم باستخدام روتين ابفيف مبنية خصيصا. وصف مقياس التناضح نانولتر هنا التلاعب درجة حرارة العينة بطريقة فائقة الحساسية.

Protocol

0. الإجراءات الأولية

  1. الزجاج الشعرية للحقن الحل. باستخدام مجتذب الشعرية (Narishige، طوكيو، اليابان)، وإعداد ماصة حاد مع افتتاح غرامة من أنبوب زجاجي الدقيقة الشعرية (الاسم التجاري GMBH، فيرتهايم، ألمانيا). وينبغي التحقق من حجم الفتحة عن طريق تمرير الهواء من خلال الشعيرات الدموية للحصول على السطح الجميلة في المياه النظيفة. إذا تم إغلاق الشعرية، ثم يمكن للمرء أن فتحه عن طريق كسر حافتها. ويمكن تحقيق هذا عن طريق الضغط عليه برفق أو الخدش ضد الماء تحتوي على جدران الأنبوب. إعداد مثل هذه الشعرية التي يتم حظرها تقريبا افتتاح لكن فتح بما يكفي للسماح بتشكيل الفرعي ملليمتر الفقاعات.
  2. النحاس تنظيف القرص. يصوتن الأقراص النحاس لمدة 10 دقيقة في 0.1٪ مايكرو-90 الصابون (كول-Parmer، فيرنون هيلز، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية)، ثم تغسل بالماء المقطر مزدوجة. إدخال أقراص إلى حل (التقنية) الأيزوبروبانول ويصوتن مرة أخرى لمدة 10 دقيقة. زعنفةحليف، تجف الأقراص باستخدام الهواء التي تمت تصفيتها. هذه المرحلة الحرجة التنظيف لتجنب تلوث IBP بين التجارب.
  3. وقد أعدت الجمعية مزدوج الطبقة ساترة. A الجمعية ساترة للسماح للمراقبة دون تكاثف الرطوبة عينة على غلاف سطح الزجاج. وقد تحقق ذلك من خلال وضع (WA هاموند Drierite، زينيا، أوهايو، الولايات المتحدة الأمريكية) Drierite الجسيمات (2 مليمتر في القطر) بين اثنين من coverslips التي تم لصقها ثم بمسدس الصمغ الحار. منع هذا التكوين التي يمكن أن تكثف منع الرأي عندما تم تبريد العينة إلى درجات حرارة منخفضة وإزالة الحاجة إلى ضربة الهواء الجاف على النافذة المراقبة.

1. مجموعة التبريد مرحلة المتابعة

  1. ربط مدخل ومخرج تدفق المياه من مرحلة التبريد إلى 4 مم القطر الداخلي Tygon أنابيب (سان جوبان، باريس، فرنسا)، وتوصيل أنبوب تدفق المياه مدخل إلى مضخة المياه.
  2. توصيل 4 مم قطر داخلى Tygon أنبوب إلى مدخل للمرحلة التبريد رس تقديم الهواء الجاف. تم تجفيفها في الهواء باستخدام عمود Drierite في الخط.
  3. تشغيل مضخات الهواء والماء. علما أنه لا ينبغي أن عناصر التبريد تشغيل بدون بالوعة الحرارة.
  4. تشغيل وحدة تحكم في درجة الحرارة، الكاميرا، والروتين ابفيف.

2. تحضير العينة

  1. ضع قطرة 3-4 ميكرولتر من الغمر النفط B (Cargille المختبرات، بستان الارز، ولاية نيو جيرسي، الولايات المتحدة الأمريكية) على الجانب الخلفي من القرص القطر النحاس 7 مم وجود ثقوب 500 ميكرون من خلال حفر القرص.
  2. وضع القرص النحاس على المسرح التبريد مع الجانب الغمر النفط إلى الأسفل.
  3. توصيل أنبوب شعري (حافة حادة) إلى 0.7 مم قطر الأنبوب الداخلي Tygon متصلة في الطرف الآخر لحقنة 2 مل الزجاج (Poulten-غراف، فيرتهايم، ألمانيا).
  4. قبل استخدام الأنبوب الشعري، والتحقق من فتحة صغيرة من شعري لضمان أن فتح هو الحجم المناسب (انظر الإجراءات الأولية).
  5. إدراج ببطء غلاSS الشعرية في أنبوب المعدة IBP عينة البروتين (2.4 ميكرومتر النائب IBP-GFP في 20 ملي CaCl 2 و 25 مم تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة في-8، انظر المرجع 10 لتفاصيل الإعداد) وسحب الحقنة الزجاج حتى الزجاج الشعرية يحتوي على 0،1 ميكرولتر من محلول البروتين.
  6. بدء تسجيل الفيديو عن طريق برنامج ابفيف.
  7. إدراج حافة حادة من الزجاج الشعرية (التي تحتوي على البروتين الحل) في واحدة من الثقوب في القرص النحاس على المسرح التبريد.
  8. مع مراعاة من خلال المجهر (أوليمبوس، طوكيو، اليابان، الهدف 10X)، اختراق طبقة الزيت بعناية الغمر مع طرف زجاج الشعرية، ثم اضغط على حقنة زجاجية (بدقة جدا) لتقديم كمية صغيرة (~ 10 NL) من البروتين الحل هو إنشاء قطيرة ميكرومتر 200.
  9. تغطية فتحة في مرحلة التبريد مع الجمعية طبقة ساترة مزدوجة (راجع إجراءات أولية).

3. TH نشاط القياس

  1. قبلSS على زر التبريد وضبط درجة الحرارة إلى -40 ° C.
  2. في البداية، سوف يكون واضحا حل الحبرية. في درجات حرارة منخفضة، وعادة في نطاق -30 ° C إلى -35 درجة مئوية، ويتغير لون الحبرية، تشير إلى أنه تم تجميد الحل. مباشرة بعد العينة جمدت، وزيادة درجة الحرارة ببطء حتى الجليد معظم يبدأ في الذوبان. وهناك زيادة تدريجية في درجة الحرارة اللازمة لتجنب المبالغة في درجة الحرارة يمكن أن يؤدي إلى ذوبان كامل للعينة.
  3. التبديل إلى الهدف 50X والبدء في إذابة الجليد عن طريق ضبط درجة الحرارة. هذا التعديل هو التفاعلية، وعادة ما يتم تنفيذ الخطوات النهائية باستخدام خطوات صغيرة في درجة الحرارة من درجة مئوية 0،002 تواصل تذوب حتى الكريستال واحد لا يزال قائما. ينبغي أن الحجم النهائي من الكريستال يكون حوالي 10 ميكرون. يتم تحديد أعلى درجة الحرارة التي تنصهر وتوقفت عن أن تكون نقطة ذوبان ويتم تحديد بدقة في المرحلة الفيديو تحليلها لاحقا.
    4. <تعيين لى> درجة الحرارة إلى واحد بالمائة من عدد قليل درجة مئوية تحت درجة انصهار البلورة ويبدأ منحدر درجة الحرارة مع تأخير 10 دقيقة. ضبط معدل التعلية على النحو المرغوب فيه. خلال هذا الوقت، سوف يكون عرضة البلورة إلى IBPs.
  4. وعند الانتهاء من وقت التعرض دقيقة 10، وسوف تنخفض درجة الحرارة تلقائيا تحت سيطرة الروتين ابفيف.
  5. مراقبة على شكل الكريستال مع تناقص درجات الحرارة. في مرحلة ما، قد يكون لاحظ موجة مفاجئة من الكريستال الجليد. ويلاحظ درجة الحرارة التي يحدث هذا لأن البلورة درجة حرارة الانفجار.
  6. استخدام تحليل الفيديو لتحديد درجة انصهار دقيقة ودرجة حرارة الانفجار. أولا، عن طريق استخدام تحليل الفيديو، والعثور على نقطة انصهار دقيقة. نذكر بأن يتم تحديد أعلى درجة الحرارة التي تنصهر وتوقفت عن أن تكون درجة انصهار. توثيق هذه المرحلة ذوبان في برنامج جدول بيانات. ثم، تحديد انفجار الكريستال دقيقة درجة الحرارة، وتوثيق هذه القيمةكذلك. الفرق بين درجة انصهار ودرجة التجمد، أو الكريستال درجة حرارة الاندفاع، هو النشاط التباطؤ الحراري من الحل IBP.

4. قياس نشاط TH المعتمدة على الزمن

  1. اتبع بروتوكول الموصوفة في أقسام لإعداد 3،1-3،3 الكريستال واحد من الجليد.
  2. بعد تشكيل الكريستال، وضبط الوقت تأخير المنحدر كما هو مطلوب، وبدوره على منحدر.
  3. سوف تنخفض درجة الحرارة بمعدل ثابت (وفقا لمتطلبات المشغلين) تلقائيا بمجرد وقت التأخير قد مرت منحدر.
  4. توثيق درجة الحرارة التي يحدث انفجار الكريستال. حساب زمن التعرض (الوقت بين تشكيل الكريستال والبلور انفجار).
  5. تكرار التجربة لمرات تأخير المختلفة ورسم النشاط TH بوصفها وظيفة من الوقت لتقييم التعرض الوقت في الاعتماد على النشاط TH.

Representative Results

قياس الوقت TH الاعتماد

ومقياس التناضح نانولتر ابفيف تعمل على تسهيل أداء قياسات دقيقة النشاط TH. يسمح بتخفيض درجة حرارة ثابتة معدل قياس الوقت TH الاعتماد. كان التحكم في درجة الحرارة دقيقة مكنت من مقياس التناضح نانولتر حاسم لهذه التجارب. ويعرف الوقت من التعرض بلورة الثلج على IBPs في حل والفترة الزمنية من تشكيل الكريستال (نهاية عملية الذوبان) حتى النمو المفاجئ من الثلج في جميع أنحاء الكريستال (كريستال انفجار). وجدنا أن الوقت التعرض للبلورات الثلج على IBPs يؤثر بشكل حاسم على النشاط TH. أنتجت فترات قصيرة من التعرض IBP (بضع ثوان) نشاط TH منخفضة في حل IBP-GFP النائب (2.4 ميكرومتر) (الشكل 5). النشاط TH زيادة مع مرور الوقت تعرض IBP حتى وصلت إلى الهضبة في 4 دقائق IBP التعرض. بتركيزات أعلى IBP، لوحةوتم التوصل الاتحاد الافريقي في أقصر الأوقات.

الشكل 1
الشكل 1. رسم تخطيطي يوضح IBPs كثف إلى الجليد. اعتمد بإذن من 10.

الشكل 2
الشكل 2. المرحلة التبريد. A) متصلة على أنابيب المجهر. B) بدون الرصاص العليا. C) رسم تخطيطي.

الشكل 3
الشكل 3. لقطة من واجهة ابفيف. الكلورينإك هنا لمشاهدتها بشكل اكبر الرقم.

الشكل 4
الشكل 4. درجة الحرارة الرسم البياني الاستقرار. تم تعيين تحكم في درجة الحرارة لخفض درجة حرارة 0.01 ° C كل ثانية 15.

الشكل 5
الشكل 5. النائب النشاط TH IBP بوصفها وظيفة من الكريستال الجليد الوقت التعرض لIBPs. كل نقطة هو متوسط ​​الوقت من 3-6 التجارب.

Discussion

هذا العمل يدل على تشغيل مقياس التناضح نانولتر الكمبيوتر التي تسيطر عليها تمكن قياسات دقيقة من النشاط TH مع التحكم في درجة الحرارة غير عادية. في أي نظام حساسة للحرارة، لا بد من تجنب التدرجات درجة الحرارة غير المرغوب فيها. لتجنب درجات الحرارة التدرجات في الجهاز المعروضة هنا، لا بد من وضع حل لقطيرة الاختبار في وسط حفرة في مرحلة التبريد النحاس القرص (الخطوة 2.7). بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تكون واحدة الكريستال في وسط قطرات بدلا من قرب حواف (في معظم الحالات، وهذا لن يحدث تلقائيا). الاعتماد الوقت وصف يشير إلى أن معدل التبريد قد تؤثر على قراءات TH. وهكذا، فإننا نقترح بما في ذلك تقرير الزمنية التي تعرضت لها الكريستال في حل قبل التبريد، وكذلك معدل التبريد. انتظرنا عادة 10 دقيقة قبل التعلية بانخفاض درجة الحرارة عند 0.01 ° C الخطوات في كل ثانية 4.

المشارك ابفيف التي تسيطر عليهاوقد تم تكييف المرحلة أولينغ للاستخدام مع مجهر مقلوب على الأجهزة التي يمكن التلاعب بها ميكروفلويديك حراريا. هذا النظام يسهل أداء التجارب التي تنطوي على تبادل حل بلورات الثلج وIBPs ذات الكلمات الدلالية مع EGFP 9 و 10 و 16. ويمكن تكييف نظام ابفيف التي تسيطر عليها إلى مرحلة كليفتون من خلال ربط تحكم في درجة الحرارة عن طريق الدائرة 3040 عين الكهربائية التكيف. ويتم تشغيل هذا النظام في المختبر ديفيز 17. البرنامج ابفيف والتكيف المعينة تصميم الدوائر الكهربائية للمرحلة كليفتون متاحة عند الطلب.

وفي الختام، فإننا وصف مقياس التناضح نانولتر تسهل السيطرة الحساسة والتلاعب في درجة الحرارة ومعدل ارتفاع درجة الحرارة وانخفاض (مع حساسية 0،002 C °)، بتنسيق مع واجهة الفيديو من خلال روتين ابفيف في الوقت الحقيقي التحليل. يمكن هذا النظام أداء استنساخه معدل تسيطر التجارب التي مهمر عن التحقيق في حركية التفاعلات IBP مع الجليد. يمكن معالجة العديد من هذه التجارب الطويلة من الجدل القضايا المحيطة آلية عمل IBPs.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل قوى الأمن الداخلي، NSF، وERC. نود أن نعترف مساعدة فنية مع المرحلة درجات الحرارة من ميلفورد راندي، كورين مايكل شيفر دوغ، وجيريمي دينيسون. وقدمت المساعدة مع تطوير البرمجيات من قبل تشن أو شو دي، Sannareddy راجيش، وBhattachary سوميت. نود أن نشكر لدينا المتعاونين البروفيسور بيتر ديفيس والدكتور L. لوري غراهام A. للبروتين IBP النائب والمناقشات مفيدة. نشكر أيضا أعضاء المختبر الدكتورة مايا بار دوليف، Yangzhong تشين الدكتور سيليك Yeliz الدكتور Pertaya ناتاليا، Mizrahy Ortal، وغاي شلوميت لردود الفعل المستخدم الخاصة بهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immersion oil Type B Cargille Laboratories 16484
Drierite W.A. Hammond Drierite 043063 2270g
Micro 90 cleaning solution Cole-Parmer EW-18100-11
Capillary puller Narishige PB-7
Glass capillary tubes Brand GNBH 7493 21 75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller Newport, Irvine, California, United States Model 3040 Model 3040
Light microscope Olympus Model BH2
10x objective Olympus S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective Nikon CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera Provideo CVC-140
Tygon tubes Saint-Gobain, Paris, France Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml) Poulten-Graf, Wertheim, Germany 7 10227
GPIB-PCI card National instruments, Austin, Texas, USA 778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 National instruments, Austin, Texas, USA 322156B-01
LabVIEW System Design Software National instruments, Austin, Texas, USA Version 8
DiVx Author software DiVx LLC, San Diego, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
  2. Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
  3. Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
  4. Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
  5. Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
  6. Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
  7. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
  8. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
  9. Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
  10. Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
  11. Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
  12. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
  13. Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
  14. Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
  15. Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
  16. Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
  17. Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 72، الكيمياء، الفيزياء، الفيزياء الحيوية، الهندسة الحيوية، علم الأحياء الدقيقة، والبروتينات، والبروتينات الجليد ملزمة، IBP والبروتينات التجمد، والبروتينات التباطؤ الحراري، TH، والبروتينات هيكلة الجليد، والبروتينات تثبيط التبلور، مقياس التناضح نانولتر، ابفيف، التحكم بدرجة الحرارة، ومرحلة المجهر ، نانو، جيبس ​​تومسون الواقع، على microfluidics، الميكروسكيل الكيمياء
ابفيف تعمل مقياس التناضح نانولتر رواية للتحقيقات الجليد بروتين ملزمة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braslavsky, I., Drori, R.… More

Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. J. Vis. Exp. (72), e4189, doi:10.3791/4189 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter