Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Chemistry

LabVIEW betjent Novel nanoliter Osmometer for Ice bindingsprotein Undersøgelser

doi: 10.3791/4189 Published: February 4, 2013

Summary

Is proteiner (IBPs), også kendt som anti-fryseproteiner, inhiberer is vækst og er en lovende additiv til anvendelse ved kryopræservering af væv. Det vigtigste redskab til at undersøge IBPs er nanoliter osmometer. Vi udviklede et hjem designet køletrin monteret på et optisk mikroskop og styres ved hjælp af en specialbygget LabVIEW rutine. The nanoliter osmometer her beskrevne manipuleret prøvens temperatur i en ultra-følsom måde.

Protocol

0. Indledende procedurer

  1. Glaskapillar til opløsning injektion. Ved hjælp af en kapillær aftrækker (Narishige, Tokyo, Japan), udarbejde en skarp pipette med en fin åbning fra en glaskapillar micro rør (Brand GMBH, Wertheim, Tyskland). Størrelsen af ​​åbningen bør verificeres ved at lede luft gennem kapillarrøret for at opnå fine bobler i rent vand. Hvis kapillarrøret er lukket, så kan man åbne den ved at bryde sin kant. Dette kan ske ved presning eller skrabe det let mod den vandholdige rørvæggene. Forberede den kapillære således at åbningen næsten er blokeret, men er tilstrækkelig åben til at tillade dannelsen af ​​sub-millimeter bobler.
  2. Kobber disc rengøring. Sonikeres de kobberskiverne i 10 minutter i 0,1% Micro-90 soap (Cole-Parmer, Vernon Hills, Illinois, USA), vask derefter med dobbeltdestilleret vand. Indføre diske i en isopropanol (teknisk) opløsning og sonikeres igen i 10 min. Finallieret, tørre diske med filtreret luft. Denne rengøring fase er afgørende for at undgå IBP forurening mellem forsøgene.
  3. Dobbelt-lag dækglas forsamling. En dækglas samling var parat til at give mulighed for prøve observation uden kondensering fugt på forsiden glasoverfladen. Dette blev opnået ved at placere et Drierite (WA Hammond Drierite, Xenia, Ohio, USA) partikel (2 mm i diameter) mellem to dækglas, der derefter blev limet med en varm lim pistol. Denne konfiguration forhindret kondensation, der kan blokere lyset, når prøven blev afkølet til lave temperaturer og fjernet behovet for at blæse tør luft på observationsvindue.

1. Køling Stage Set-up

  1. Slut vandstrømmen ind-og udløb af den afkølingstrinnet til 4 mm indvendig diameter Tygon-rør (Saint-Gobain, Paris, Frankrig), og tilslut vandstrømmen indgangsrøret til en vandpumpe.
  2. Tilslutte en 4 mm indre diameter Tygon rør til indløbet af afkølingstrinnet to levere tør luft. Luften blev tørret under anvendelse af en in-line Drierite-søjle.
  3. Betjen luft og vand pumper. Bemærk, at køleelementerne ikke bør køre uden et varmedræn.
  4. Tænd for temperatur controller, kamera, og LabVIEW rutine.

2. Prøvefremstilling

  1. Anbring en 3-4 pi dråbe immersionsolie B (Cargille laboratorier, Cedar Grove, New Jersey, USA) på bagsiden af ​​en 7 mm diameter kobber skive med 500 um huller boret gennem disken.
  2. Placer kobber disken i afkølingstrinnet med immersionsolie nedad.
  3. Tilslut kapillarrøret (den stumpe kant) til en 0,7 mm indre diameter Tygon rør forbundet ved den anden ende til en 2 ml glassprøjte (Poulten-Graf, Wertheim, Tyskland).
  4. Før anvendelse af kapillarrør, kontrollere den lille åbning af kapillaret for at sikre, at åbningen er passende størrelse (se de indledende procedurer).
  5. Sæt langsomt glass kapillær i den klargjorte IBP protein prøverøret (2,4 uM Mp IBP-GFP i 20 mM CaCl2 og 25 mM Tris-HCI ved pH 8, se reference 10 til fremstillingen detaljer) og træk glassprøjten indtil glaskapillar indeholder 0,1 gl af proteinopløsningen.
  6. Begynd videooptagelse via LabVIEW software.
  7. Sæt den skarpe kant af glaskapillar (indeholdende proteinopløsningen) ind i et af hullerne i kobber disk i afkølingstrinnet.
  8. Mens observere gennem mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan, 10x objektiv), omhyggeligt gennemtrænge immersionsolie lag med glaskapillar spids, og tryk på glas sprøjten (meget forsigtigt) at levere en lille mængde (~ 10 nl) af proteinet Opløsningen at skabe en 200 um dråber.
  9. Dæk hullet i afkølingstrinnet med det dobbelte lag dækglas igen (se de indledende procedurer).

3. TH Activity Måling

  1. Press køling knap og indstil temperaturen til -40 ° C.
  2. Indledningsvis vil opløsningen dråbe være klar. Ved lave temperaturer, typisk i området -30 ° C til -35 ° C, dråben skifter farve, hvilket indikerer, at løsningen er blevet frosset. Umiddelbart efter at prøven er frosset, øges temperaturen langsomt, indtil hovedparten isen begynder at smelte. En gradvis øgning af temperaturen er nødvendig for at undgå overskridelse af den temperatur, som kunne resultere i fuldstændig smeltning af prøven.
  3. Skifte til en 50x objektiv og begynder at smelte isen ved at justere temperaturen. Denne justering er interaktivt, og de sidste trin er typisk udført ved anvendelse af små temperaturforskelle trin på 0,002 ° C. Fortsætter med at smelte, indtil en enkelt krystal tilbage. Den endelige størrelse af krystal skal være omkring 10 um. Den højeste temperatur, ved hvilken smeltning er ophørt bestemmes til at være smeltepunktet og bestemmes nøjagtigt i den senere videoanalyse fase.
  4. <li> Indstil temperaturen til nogle få hundrededele af en grad Celsius under smeltepunktet af krystallen og begynde en temperaturstigning med en 10 min forsinkelse. Juster ramping sats som ønsket. I dette tidsrum, vil krystallen blive udsat for IBPs.
  5. Ved afslutningen af ​​10 min eksponeringstid, vil temperaturen falde automatisk under styring af LabVIEW rutine.
  6. Observere krystalform, efterhånden som temperaturen falder. På et tidspunkt kan den pludselige af iskrystal observeres. Temperaturen, ved hvilken dette sker er noteret som krystal burst temperatur.
  7. Brug video analyse for at bestemme den nøjagtige smeltepunkt og burst temperatur. Dels ved hjælp af video-analyse, finder den nøjagtige smeltepunkt. Minde om, at den højeste temperatur, ved hvilken smeltning er ophørt bestemmes til at være smeltepunktet. Dokumentere dette smeltepunktet i et regnearksprogram. Derefter bestemme præcis krystal burst temperatur, og dokumentere denne værdisamt. Forskellen mellem smeltepunktet og frysepunktet, eller krystal burst temperatur, er den termiske hysterese aktivitet IBP opløsningen.

4. Måling af Tidsafhængig TH Aktivitet

  1. Følge protokollen beskrevet i afsnit 3,1-3,3 til fremstilling af en enkeltkrystal af is.
  2. Efter dannelse af krystallen, indsætte forsinkelsestiden af ​​rampen som ønsket, og tænd rampen.
  3. Temperaturen vil falde med en fast rente (ifølge operatørernes krav) automatisk, når rampe forsinkelsestiden er passeret.
  4. Dokumentere den temperatur, ved hvilken krystallen burst sker. Beregn eksponeringen (den tid mellem krystal formation og krystal burst).
  5. Gentag forsøget for forskellige forsinkelsestider og plotte TH-aktivitet som funktion af eksponeringstiden at evaluere tidsafhængighed for TH-aktivitet.

Representative Results

Måling af TH tidsafhængighed

The LabVIEW-betjent nanoliter osmometer letter udførelsen af ​​nøjagtige TH-aktivitet målinger. Den konstante temperatur nedsættelsessats tillod måling af TH tid afhængighed. Den nøjagtige temperaturstyring aktiveret af nanoliter osmometer var afgørende for disse eksperimenter. En eksponeringstid på en iskrystal til IBPs i opløsning er defineret som tidsperioden fra dannelsen af ​​krystallen (afslutningen af ​​smelteprocessen), indtil den pludselige vækst af is omkring krystallen (crystal burst). Vi fandt, at en eksponeringstid på de iskrystaller til IBPs afgørende påvirket TH-aktivitet. Korte perioder med IBP eksponering (nogle få sekunder) gav en lav TH-aktivitet i Mp IBP-GFP opløsning (2,4 uM) (figur 5). TH aktivitet steg med IBP eksponering, indtil det nåede et plateau ved 4 min IBP eksponering. Ved højere IBP koncentrationer pladenau blev opnået på kortere tid.

Figur 1
Figur 1. Skematisk diagram IBPs adsorberet til is. Vedtaget med tilladelse fra 10.

Figur 2
Figur 2. Den køletrin. A) Forbundet til rør på mikroskopet. B) uden de øverste bly. C) Skematisk diagram.

Figur 3
Figur 3. Screenshot af LabVIEW interface. ClICK her for at se større figur.

Figur 4
Figur 4. Temperaturstabilitet graf. Temperaturregulatoren blev indstillet til at sænke temperaturen 0,01 ° C hver 15 sek.

Figur 5
Figur 5. Mp IBP TH-aktivitet som en funktion af iskrystal eksponeringstid til IBPs. Hvert tidspunkt er gennemsnittet af 3-6 eksperimenter.

Discussion

Dette arbejde demonstrerer driften af ​​en computer-styret nanoliter osmometer der muliggør nøjagtige målinger af TH aktivitet med ekstraordinær temperaturstyring. I enhver temperaturfølsom system skal uønskede temperaturgradienter undgås. For at undgå temperaturgradienter i apparatet præsenteres her, skal testopløsningen dråbe anbringes i midten af ​​et hul i kobber disc køletrin (trin 2.7). Desuden bør enkelt krystal være i midten af ​​dråben ikke i nærheden af ​​kanterne (i de fleste tilfælde vil dette ske spontant). Den tid beskrevne afhængighed angiver, at afkølingshastigheden kan påvirke TH aflæsninger. Således foreslår vi bl.a. en rapport af den tid, hvor krystallen var udsat for opløsningen forud for afkøling, og afkølingshastigheden. Vi typisk ventede 10 minutter før nedkørsel, temperaturen ved 0,01 ° C trin hver 4 sek.

De LabVIEW-kontrollerede cooling fase blev tilpasset til anvendelse med et omvendt mikroskop, som mikrofluidenheder kan termisk manipuleres. Dette system letter udførelsen af løsning udveksle forsøg med iskrystaller og IBPs markeret med eGFP 9, 10, 16. LabVIEW-styret system, kan tilpasses til en Clifton trin ved at forbinde 3040 temperaturregulator via en udpeget tilpasning elektrisk kredsløb. Et sådant system drives i Davies lab 17. Den LabVIEW software og den udpegede tilpasning elektrisk kredsløb design til Clifton scenen er tilgængelige efter anmodning.

Afslutningsvis beskriver vi en nanoliter osmometer der letter følsomme kontrol og manipulation af temperatur og hastigheden af ​​temperaturstigning og fald (med 0,002 ° C følsomhed), koordineret med en video-interface gennem en LabVIEW rutine for real-time analyse. Dette system kan udføre reproducerbare rate-kontrollerede forsøg, der er important for at undersøge kinetikken af ​​IBP interaktioner med is. Sådanne eksperimenter kan behandle flere lange omdiskuterede emner omkring virkningsmekanismen for IBPs.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af ISF, NSF, og ERC. Vi vil gerne anerkende teknisk hjælp med temperatur etape fra Randy Milford, Michael Koren, Doug Shafer, og Jeremy Dennison. Assistance med softwareudvikling blev leveret af Or Chen, Di Xu, Rajesh Sannareddy, og Sumit Bhattachary. Vi vil gerne takke vores samarbejdspartnere Prof. Peter L. Davies og Dr. Laurie A. Graham for Mp IBP protein og personer diskussioner. Vi takker også lab medlemmer Dr. Maya Bar-Dolev, Yangzhong Qin, Dr. Yeliz Celik, Dr. Natalya Pertaya, Ortal Mizrahy, og Shlomit Guy for deres brugerfeedback.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Immersion oil Type B Cargille Laboratories 16484
Drierite W.A. Hammond Drierite 043063 2270g
Micro 90 cleaning solution Cole-Parmer EW-18100-11
Capillary puller Narishige PB-7
Glass capillary tubes Brand GNBH 7493 21 75 mm long, 1.15 diameter
Temperature controller Newport, Irvine, California, United States Model 3040 Model 3040
Light microscope Olympus Model BH2
10x objective Olympus S Plan 10, 0.3, 160/0.17
50x objective Nikon CF plan, 50X/0.55 EPI ELWD
CCD Camera Provideo CVC-140
Tygon tubes Saint-Gobain, Paris, France Tygon Formulation S-50-HL Tubing
Glass syringe (2 ml) Poulten-Graf, Wertheim, Germany 7 10227
GPIB-PCI card National instruments, Austin, Texas, USA 778032-01
Video frame grabber IMAQ-PCI-1407 National instruments, Austin, Texas, USA 322156B-01
LabVIEW System Design Software National instruments, Austin, Texas, USA Version 8
DiVx Author software DiVx LLC, San Diego, CA, USA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DeVries, A. L. Glycoproteins as biological antifreeze agents in antarctic fishes. Science. 172, 1152-1155 (1971).
  2. Worrall, D., Elias, L., Ashford, D., Smallwood, M., Sidebottom, C., Lillford, P., Telford, J., Holt, C., Bowles, D. A carrot leucine-rich-repeat protein that inhibits ice recrystallization. Science. 282, 115-117 (1998).
  3. Raymond, J. A., Knight, C. A. Ice binding, recrystallization inhibition, and cryoprotective properties of ice-active substances associated with Antarctic sea ice diatoms. Cryobiology. 46, 174-181 (2003).
  4. Tomchaney, A. P., Morris, J. P., Kang, S. H., Duman, J. G. Purification, composition, and physical properties of a thermal hysteresis "antifreeze" protein from larvae of the beetle, Tenebrio molitor. Biochemistry. 21, 716-721 (1982).
  5. Kiko, R. Acquisition of freeze protection in a sea-ice crustacean through horizontal gene transfer. Polar Biology. 33, 543-556 (2010).
  6. Robinson, C. H. Cold adaptation in Arctic and Antarctic fungi. New Phytol. 151, 341-353 (2001).
  7. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150, 171-180 (2004).
  8. Raymond, J. A., DeVries, A. L. Adsorption inhibition as a mechanism of freezing resistance in polar fishes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 2589-2593 (1977).
  9. Pertaya, N., Marshall, C. B., DiPrinzio, C. L., Wilen, L., Thomson, E. S., Wettlaufer, J. S., Davies, P. L., Braslavsky, I. Fluorescence microscopy evidence for quasi-permanent attachment of antifreeze proteins to ice surfaces. Biophys. J. 92, 3663-3673 (2007).
  10. Celik, Y., Graham, L. A., Mok, Y. F., Bar, M., Davies, P. L., Braslavsky, I. Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 5423-5428 (2010).
  11. Gilbard, J. P., Farris, R. L., Santamaria, J. Osmolarity of tear microvolumes in keratoconjunctivitis sicca. Arch. Ophthalmol. 96, 677-681 (1978).
  12. Gilbert, J. A., Davies, P. L., Laybourn-Parry, J. A hyperactive, Ca2+-dependent antifreeze protein in an Antarctic bacterium. FEMS Microbiol. Lett. 245, 67-72 (2005).
  13. Soriano, J., Braslavsky, I., Xu, D., Krichevsky, O., Stavans, J. Universality of persistence exponents in two-dimensional ostwald ripening. Phys. Rev. Lett. 103, (2009).
  14. Tomczak, M. M., Marshall, C. B., Gilbert, J. A., Davies, P. L. A facile method for determining ice recrystallization inhibition by antifreeze proteins. Biochem. Bioph. Res. Co. 311, 1041-1046 (2003).
  15. Knight, C. A., Hallett, J., Devries, A. L. Solute Effects on Ice Recrystallization - an Assessment Technique. Cryobiology. 25, 55-60 (1988).
  16. Celik, Y., Drori, R., Pertaya-Braun, N., Altan, A., Barton, T., Bar-Dolev, M., Groisman, A., Davies, P. L., Braslavsky, I. Microfluidic experiments reveal that antifreeze proteins bound to ice crystals suffice to prevent their growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 1309-1314 (2013).
  17. Middleton, A. J., Marshall, C. B., Faucher, F., Bar-Dolev, M., Braslavsky, I., Campbell, R. L., Walker, V. K., Davies, P. L. Antifreeze protein from freeze-tolerant grass has a beta-roll fold with an irregularly structured ice-binding site. J. Mol. Biol. 416, 713-724 (2012).
LabVIEW betjent Novel nanoliter Osmometer for Ice bindingsprotein Undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. J. Vis. Exp. (72), e4189, doi:10.3791/4189 (2013).More

Braslavsky, I., Drori, R. LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations. J. Vis. Exp. (72), e4189, doi:10.3791/4189 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter