Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

الاصطناعية إنتاج حرير العنكبوت على نطاق المختبر

Published: July 18, 2012 doi: 10.3791/4191
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Pacific

Summary

على الرغم من الخصائص المتميزة الميكانيكية والكيميائية الحيوية للعنكبوت الحرير، لا يمكن أن تحصد هذه المواد بكميات كبيرة بالوسائل التقليدية. نحن هنا وصف استراتيجية فعالة لزيادة ونقصان ألياف اصطناعية حرير العنكبوت، والتي هي عملية هامة بالنسبة للمحققين الذين يدرسون العنكبوت إنتاج الحرير واستخدامها على النحو الجيل المقبل من المواد الحيوية.

Abstract

كما تقدم المجتمع، وأصبحت أكثر ندرة الموارد، يصبح من المهم على نحو متزايد لزراعة التكنولوجيات الجديدة التي الحيوية مهندس الجيل القادم مع خصائص عالية الأداء. يجب تطوير مواد هذه الهيكلية الجديدة ستكون سريعة وفعالة من حيث التكلفة وتنطوي على منهجيات المعالجة والمنتجات التي هي صديقة للبيئة والتنمية المستدامة. العناكب تدور العديد من أنواع مختلفة من الألياف مع الخواص الميكانيكية المختلفة، وتقدم مصدرا غنيا للجيل المقبل المواد الهندسية لتقليد الطبيعة أن المنافس أفضل المواد الاصطناعية والطبيعية. منذ جمع كميات كبيرة من حرير العنكبوت الطبيعية أمر غير عملي، الاصطناعية إنتاج الحرير لديه القدرة على توفير العلماء من أجل الحصول على امدادات غير محدودة من المواضيع. ولذلك، إذا كانت عملية الغزل ويمكن أن تكون مبسطة والكمال، والألياف الاصطناعية العنكبوت لديهم إمكانية استخدام لمجموعة واسعة من التطبيقات التي تتراوح بين الدروع الواقية للبدن، خياطة جراحيةق والحبال والكابلات، والإطارات، وسلاسل للآلات الموسيقية، والمواد المركبة للطيران وتكنولوجيا الطيران. وضعنا من أجل المضي قدما في إنتاج حرير صناعي وعملية لانتاج الألياف التي تعرض التباين المنخفض في خصائص المواد الخاصة بهم من زيادة ونقصان لزيادة ونقصان، وبروتوكول الرطب الغزل يدمج التعبير عن بروتينات حرير العنكبوت المؤتلف في تنقية والبكتيريا وتركيز البروتينات ، تليها قذف الألياف ومعالجة ميكانيكية في مرحلة ما بعد زيادة ونقصان. وهذا هو أول تمثيل المرئية التي تكشف عن عملية خطوة بخطوة لزيادة ونقصان وتحليل ألياف الحرير الصناعي على نطاق المختبر. كما يوفر تفاصيل لتقليل اعتماد التباين بين ألياف نسج من مخدر الغزل نفسه. بشكل جماعي، وهذه الأساليب دفع عملية إنتاج الحرير الصناعي، مما أدى إلى ألياف عالية الجودة التي تفوق العنكبوت الحرير الطبيعي.

Introduction

حرير العنكبوت لديه الخصائص الميكانيكية غير العادية التي يقوم بها مواد من صنع الإنسان عدة، بما فيها عالية الشد الصلب، كيفلر والنايلون. 1 العناكب تدور على الأقل 6-7 أنواع الألياف المختلفة التي تعرض الخواص الميكانيكية المختلفة، تم تصميم كل منها مع كميات متفاوتة من الشد والتمدد لتنفيذ مهام محددة البيولوجية. العلماء البحث 2 يسعون بسرعة استخدام الحرير العنكبوت كما الحيوية الجيل القادم بسبب خصائصها الميكانيكية المعلقة، توافق مع الحياة الخاصة بهم، وطبيعتها غير السامة والمواد الخضراء. 3،4 بسبب أكل لحوم البشر و طبيعة السامة من العناكب، حصاد الحرير العنكبوت من خلال الزراعة ليست استراتيجية عملية لتلبية المطالب اللازمة للتصنيع على نطاق صناعي. لذلك، تحولت العلماء الى انتاج بروتينات الحرير المؤتلف في الكائنات المعدلة وراثيا في المختبر إلى جانب الغزل من ألياف تركيبية منحد ذاتها تنقية البروتينات. وكان 5-8 التعبير عن كامل مدة المؤتلف بروتينات حرير العنكبوت من الصعب من الناحية الفنية نظرا للخصائص الذاتية للتسلسل الجيني، والتي تشمل طبيعتها المتكررة جدا وأطوال المادية (> 15 كيلوبايت)، GC-غنية المحتوى ومنحاز ألانين وجليكاين كودون الاستخدام. 9-11 وحتى الآن، ركزت معظم المختبرات في التعبير عن أشكال اقتطاعها من البروتينات أمبولي الشكل الحرير الرئيسية MaSp1 أو MaSp2 باستخدام تسلسل [كدنا] جزئي أو الجينات الاصطناعية. 12-15 غزل الحرير الاصطناعي العنكبوت هي عملية صعبة تتطلب ولم يتم التمكن والمعرفة في عدة تخصصات علمية، وتعقيدات عملية الغزل وكشف تماما لعامة الناس عن طريق التمثيل الفيديو. في الواقع، سوى عدد قليل من المختبرات في جميع أنحاء العالم لديهم الخبرة للتعبير عن cDNAs حرير العنكبوت، تنقية بروتينات الحرير، وتدور الألياف الاصطناعية، وتأدية ما بعد تدور التعادل، ثم أخيرا اختبار خواصها مادة بيولوجية. 8،16،17 مناهج مختلفة للألياف تركيبية الغزل وشملت الغزل الرطب والجاف وكذلك أساليب electrospinning 16،18،19 جميع الإجراءات لديها هدف واحد مشترك - وضع بروتوكول الاصطناعية التي تنتج حرير العنكبوت مع الخواص الميكانيكية التي الطبيعية المواضيع منافس على نطاق واسع عمليات التصنيع التجاري.

نحن هنا وصف الإجراء لتوليد الحرير العنكبوت الاصطناعي على نطاق المختبر باستخدام منهجية الرطب الغزل. بالنسبة لأساليب الغزل وغيرها، وقد أنتجت الغزل الرطب أكثر النتائج متسقة لتحليل الألياف. نحن الخطوط العريضة بداية هذا الإجراء مع التعبير عن بروتينات الحرير المؤتلف في البكتيريا، تليها تنقية بهم، ومن ثم وصف الخطوات إعداد بروتين للغزل، بما في ذلك منهجية التعادل بعد تدور تطبق على الألياف "، كما نسج" يمكن أن ينتج عن المواضيع مع خصائص المواد التي تقترب من جودة الحرير العنكبوت الطبيعية. لدينا منهجيهتم تصميم Y لمحاكاة عن كثب عملية طبيعية غزل من ألياف الحرير، وأنه يعتمد بشدة على خبرتنا في الهندسة المعمارية وظيفة من وظائف الغدد المنتجة للحرير من محجر العين، وقطعة خبز نسيج العنكبوت. 20-22 وعلاوة على ذلك، فإننا نستنتج مع ما يلزم من خطوات لتحديد خصائص المواد من الألياف الاصطناعية باستخدام مقياس التوتر لرسم منحنيات الإجهاد والانفعال، والتي تسمح للمحققين لحساب قوة في نهاية المطاف، السلالة في نهاية المطاف، وصلابة من الألياف. وأخيرا، ولكن ذات قيمة كبيرة، لا يمكن للأجهزة الغزل، التخزين المؤقت، ورسم يكون في المنزل التي تم إنشاؤها باستخدام أجزاء المتاحة تجاريا، بدلا من شراء معدات مخصصة متقنة ومكلفة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

الشكل 11
رسوم بيانية لمحة عامة: تقليد الطبيعة من عملية الغزل

تقليد الطبيعة من المسار العنكبوت إنتاج الحرير الطبيعي:. الطريق لتصنيع حرير صناعي هذه الصورة تبين غدة أمبولي الشكل الرئيسي من ويفر فلك الذهبي، clavipes Nephila، ومكونات تستخدم لانتاج الحرير الطبيعي (نص أبيض). منطقة الذيل يجمع كميات كبيرة من بروتينات الحرير التي يتم نقلها إلى أمبولة، وهي منطقة تخزين للمنشطات الغزل. هذا مخدر المركزة هو مقذوف من خلال القناة الغزل حيث حل يواجه التبادل الأيوني والجفاف قبل قذف الألياف. يشار إلى أن عمليات بيوميمتيك المستخدمة في مختبرنا من قبل نص أحمر. يتم توليد المؤتلف إنتاج الحرير باستخدام بكتيريا معدلة وراثيا، تليها تنقية البروتين باستخدام اللوني. المقبل، والبروتين النقي هو دونject إلى lyophilization للتركيز للمادة. وأخيرا، هو البروتين إعادة حله في HFIP ومقذوف من إبرة الحقنة في حمام الأيزوبروبانول.

1. البلازميد البناء والبكتيرية تحضير خلية ثقافة

  1. أداء PCR باستخدام حرير العنكبوت المطلوب مجموعات التمهيدي [كدنا] ومحددة. هلام استخراج وligate [كدنا] تضخيم الى ناقلات التعبير بروكاريوتيك ThioFusion pBAD / TOPO على سبيل المثال (الشكل 1A). هذا المتجه لديه بطاقة thioredoxin N-محطة لتسهيل الحرير الإذابة بروتين و6X C-محطة له، شعارا لتنقية البروتين. تحويل المنتجات إلى ربط E. المختصة كولاي الخلايا.
  2. حدد المستعمرات التي تحتوي على ناقلات الاستنساخ المؤتلف واستخدام واحد مستعمرة لتطعيم 200 مل من LB معقم تستكمل مع الأمبيسيلين (الشكل 1B). تنمو هذه الثقافة بين عشية وضحاها إلى التشبع عن طريق هز بسرعة 200 دورة في الدقيقة في حاضنة في المدار 37 درجة مئوية.
  3. الجمع بين 200 مل من saturatإد ثقافة مع 800 مل من ثقافة LB الطازجة. حث العنكبوت التعبير بروتين الحرير لمدة 4 ساعات وذلك بإضافة أرابينوز 0.2٪ (W / V). تأكد للحفاظ على ثقافة تحت اختيار المضادات الحيوية.
  4. بيليه الخلايا في 16000 XG لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية (الشكل 1C). عن البساطة، وبيليه وحدة التخزين بالكامل في حاوية واحدة. قد خطوات الطرد المركزي متعددة يكون من الضروري تبعا لقدرة حجم أنابيب الطرد المركزي. إذا لزم الأمر، صب حجم السائل بعد الغزل وإعادة بيليه مواد إضافية لضمان الخلية بأكملها بيليه هو في حاوية واحدة. ويمكن تخزين كريات خلية في -80 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
  5. قبل التخلص منها وسائل الإعلام ثقافة المستهلك، إضافة مبيض أو الأوتوكلاف لتعقيم.

2. انحلال الخلايا

  1. إضافة 20 مل من عازلة تحلل 1X إلى بيليه 1 خلية L (الشكل 2A). تأكد من resuspend وبيليه الخلية تماما.
  2. أضف الليزوزيم إلى التركيز من 1 ملغ / مل لمواصلة تعزيزانحلال الخلايا. ويمكن أيضا أن يضاف الدناز في هذه الخطوة لهضم الحمض النووي الصبغي للمساعدة في خفض اللزوجة من الحل. وضع عينة على شاكر المدارية وصخرة بلطف لمدة 20 دقيقة.
  3. يصوتن الحل في الحد الأقصى لمدة 1 دقيقة.
  4. لتوضيح الحل، وأجهزة الطرد المركزي في 16000 XG لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية (الشكل 2B).

3. تنقية البروتين: ني NTA الانجذاب كروماتوغرافيا العمود

  1. إزالة طاف وتحويلها إلى بيئة نظيفة 25 عمود اللوني مل. تأكد من أن طاف هو غير لزجة واضحة. إذا الحل هو لزج وغائم، إضافة المزيد من الدناز أو يصوتن و / أو إعادة بيليه طاف (كرر الخطوات 2،3-2،4).
  2. إضافة 1 مل من ني NTA الطين (0.5 مل الخرز) في العمود. تأمين غطاء محكم ومحبس، ووضع بعد ذلك على الكرسي الهزاز لتتوازن لمدة 1 ساعة للسماح ملزم لل6X له، علامة على حبات ني NTA (الشكل 3A).
  3. تعيين عمود قائم علىالوقوف والسماح للالخرز ني NTA لتسوية لحوالي 2 دقيقة. يمكن رؤية طبقة الضوء الأزرق في أسفل عندما يتم تسويتها تماما الخرز.
  4. إزالة الغطاء، والسماح للحل لتتدفق من خلال محبس. جمع هذا الحل لمزيد من التحليل (الشكل 3B).
  5. إضافة 20 مل من عازلة غسيل 1X والسماح حبات لتسوية. فتح محبس والسماح بالتدفق من خلال حل. جمع هذا الحل في aliquots مل 4 (5) لمزيد من التحليل ملاحظة: يمكن استخدام وحدات التخزين غسيل إضافية للحد من تلوث البروتينات، ولكن هناك احتمال وجود انخفاض في العائد النهائي من البروتين.
  6. إضافة 20 مل من عازلة شطف 1X والسماح للراتنج لتسوية. فتح محبس والسماح بالتدفق من خلال حل. جمع هذا الحل في aliquots 5 4 مل لمزيد من التحليل. ملاحظة: يمكن جمع كميات إضافية من شطف الراتنج ني NTA إذا لم يتم الانتهاء من شطف.
  7. قد يتم تخزين العينات في 4درجة مئوية أو -80 درجة مئوية للتخزين على المدى القصير أو الطويل، على التوالي.
  8. الحجم يجزئ العينات باستخدام SDS-PAGE تحليل. تصور البروتينات مع الفضة أو Coomassie بريليانت الأزرق R-250 (الشكل 3C). وينبغي أن تستخدم الكسور فقط نقي للخطوات التالية ملاحظة: يمكن استخدام تحليل اللطخة الغربية لتأكيد هوية من البروتين النقي.

4. غسيل الكلى وLyophilization

  1. Dialyze العينات ضد ما لا يقل عن 100X حجم العينة (استخدام الماء منزوع الأيونات) لمدة 2 ايام. تغيير محلول كل 6 ساعات لازالة جميع الأملاح ملاحظة: حجم الوزن الجزيئي قطع من أنابيب غسيل الكلى يعتمد على حجم بروتين الحرير المؤتلف.
  2. وزن 6 1،5 مل microfuge أنابيب فارغة وتسجيل كتلها. قد يكون من المفيد لثقوب ثقب صغير أو الشقوق في مباراة دولية من الأنابيب قبل وزنها عن تجميد تجفيف لتسهيل lyophilization (الشكل 4A).
  3. AFثالثا غسيل الكلى، ونقل 1 مل من العينة مدال في كل من ال 6 السابقة للوزن أنابيب microfuge (الشكل 4B). فلاش تجميد باستخدام النيتروجين السائل وتجفيف العينات لأسفل باستخدام مجفف تجميد (الشكل 4C).
  4. جفاف مرة واحدة، ونقل آخر 1 مل من العينة لغسيل الكلى في كل من أنابيب 6. كرر حتى يتم تجفيفها على عينة غسيل كامل لأسفل في أنابيب microfuge.
  5. ويمكن تخزين عينات تجميد المجفف في -80 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.

5. الغزل تحضير المخدر

  1. وزن كل واحد من أنابيب microfuge التي تحتوي على مسحوق البروتين المجفف. طرح الكتلة الأولية للأنابيب فارغة للحصول على مجموع كتلة بروتين جاف ملاحظة: اعتمادا على محصول البروتين، قد تحتاج لتنقية مواد إضافية لعملية الغزل.
  2. حساب حجم Hexafluoroisopropanol (HFIP) لإضافة إلى كل أنبوب للحصول على 200 ملغ / مل إلى 500 ملغ / مل، أو 20٪ إلى 50٪ في حجم الوزن. إضافة اعتماداتأكلت كمية من HFIP في كل أنبوب (الشكل 4D) ملاحظة:. HFIP متقلبة جدا وسامة، ماصة بعناية وغطاء الأنبوب في أسرع وقت ممكن. وينبغي التعامل مع HFIP تحت غطاء سلامة.
  3. Parafilm الأنابيب ومكان على الكرسي الهزاز إلى ذوبان البروتين. دوامة والطرد المركزي من حين لآخر لتسهيل الإذابة. وهذا قد يستغرق ما يصل الى 2 يوما.

6. تحضير حقنة وجهاز الإعداد

  1. تحميل لا يقل عن 25 ميكرولتر من مخدر الغزل solubilized إلى الحقنة. تأكد من عدم وجود المجاميع تقديم لأنها قد تسد حقنة ملاحظة: هذا النموذج هو لزج بشكل لا يصدق، حتى تأخذ الرعاية عندما pipetting.
  2. دفع مخدر إلى الجزء الأمامي من حقنة عموديا، وإزالة جميع فقاعات الهواء (الشكل 5A) ملاحظة:. فقاعات الهواء خلق تناقضات في الألياف.
  3. قفل المحقنة إلى المضخة. رفع كوب 400 مل مملوءة حتى الأيزوبروبانول 95٪ لذلك غيض من حقنةوكسر للتو على سطح الكحول (الشكل 5B).
  4. تعيين مضخة محقنة إلى 15 ميكروليتر / دقيقة، وبدء تشغيل البرنامج. السماح للألياف ونسج على الجلوس في الأيزوبروبانول لمدة 20 دقيقة لكي تتوازن تماما ملاحظة: لا تزال هذه الألياف يتم استخدامها من قبل MS / MS تحليل للتأكد من هوية من البروتينات في الألياف.

7. بعد زيادة ونقصان رسم وجمع العينات

  1. تنطبق على الوجهين الشريط لكلا الجانبين من مشط على الجهاز التخزين المؤقت. تم إنشاء جهاز التخزين المؤقت من الأمشاط المعدنية الإلتصاق إلى الفرجار الرقمية (الشكل 6A). نعلق جهاز التخزين المؤقت لمحرك (الشكل 6B). نوصي التخزين المؤقت على المواضيع في 2 دورة في الدقيقة. ملاحظة: أسرع نتيجة التخزين المؤقت في معدلات كميات كبيرة من التباين في جودة الألياف والتكاثر.
  2. باستخدام ملقط انتزاع بلطف واحدة من نهاية الألياف وسحب ببطء للخروج من الأيزوبروبانول، إرفاقها إلى حافة واحدة من الأسلحة مشط على بكرة (التين. 6C). وينبغي القيام بالخطوات القليلة المقبلة من دون توقف لمنع الألياف من الجفاف.
  3. تشغيل المحرك وتوجيه بلطف والألياف على مذكرة جهاز التخزين المؤقت: خلال التخزين المؤقت، لا تسمح للألياف لمضاعفة وكومة فوق بعضها البعض.
  4. بمجرد أن يتم لف الألياف كامل، فصل بكرة من المحرك وتطبيق الغراء على حافة كل من الألياف الحريرية على الشريط مزدوجة من جانب (الشكل 6D). هذا تسمر على حرير العنكبوت على جهاز ملاحظة: من خلال تطبيق الغراء على الشريط على الوجهين قبل بعد زيادة ونقصان الرسم، يمنع الليف كامل من الانزلاق، ويسمح للانتقائية التي تمتد من القطع الداخلية من ألياف داخل الفرجار الأسلحة.
  5. نعلق بكرة على خطي المحرك (الشكل 7A). تسجيل طول الأولية للألياف باستخدام الفرجار لاحظ أن هذا هو طول الداخلية من الألياف، بل لا يشمل طول لاصق وملفوفة ARound التخزين المؤقت.
  6. خفض التخزين المؤقت إلى حمام الأيزوبروبانول 75٪. السماح للألياف لكي تتوازن لمدة 10 دقائق ملاحظة: يمكن استخدام حلول أخرى التجفيف لعملية الغزل، مثل كبريتات والميثانول، والأسيتون والأمونيوم.
  7. تعيين سرعة المحرك الخطي إلى 1.5 مم / ثانية. بناء على طول الأولي، حساب طول النهائية لنسبة التعادل المطلوب في مرحلة ما بعد زيادة ونقصان. يمكن التحكم في كمية امتدت استنادا إلى سرعة أو طول، اعتمادا على اقامة. على سبيل المثال، مع وجود طول الأولي 15 ملم، والمطلوب نسبة التعادل بعد دوران 3X، يجب أن يكون الطول النهائي 45 مم. ويمكن أيضا أن تحسب هذه والمحرك لخطي المحرك لمدة 20 ثانية وبمعدل 1.5 مم / ثانية.
  8. مرة واحدة تدور آخر المرجوة التعادل كاملة، ورفع ببطء التخزين المؤقت للخروج من الأيزوبروبانول. السماح لقطرات من الأيزوبروبانول لتجف لمدة 1 دقيقة، ثم جمع عينات (الشكل 7B). يجب أن يتم تنظيمها على عينات من إطارات البطاقات أو احباط لاختبار بوريطرح.
  9. إذا ما المطلوب مزيد من نسب التعادل آخر تدور، وانخفاض مرة أخرى إلى التخزين المؤقت للحمام الأيزوبروبانول 75٪. السماح للألياف لكي تتوازن لمدة 10 دقائق، ثم انتقل إلى نسبة المشاركة اللاحقة تعادل زيادة ونقصان.

8. اختبار الشد

  1. تسمح العينات التي تم جمعها لتتوازن في بيئة معملية مستوى لا يقل عن 1 ساعة قبل الاختبار الميكانيكي. وينبغي تسجيل نسبة الرطوبة ودرجة الحرارة لأنها قد تؤثر على خصائص الألياف والميكانيكية. وينبغي أن الرطوبة والشروط القياسية درجة الحرارة تكون حوالي 40٪ و 25 درجة مئوية، على التوالي.
  2. الغراء على حواف البطاقات أو احباط لتأمين الألياف على الإطار. يحيط علما حجم افتتاح الإطار. هذا هو طول الأولية للألياف الخاص التي تم اختبارها. ويرد إطار افتتاح 1 بوصة (25.4 ملم) هنا (الشكل 8A).
  3. باستخدام مجهر الضوء مع التكبير 100X أو أكثر، وأخذ قياسات القطر على طول محور الألياف الطولية.وينبغي تسجيل ما لا يقل عن 3 القياسات. كلما ارتفع التكبير المستخدمة وأكثر القياسات التي اتخذت، كان ذلك أفضل للدقة.
  4. تأمين إطار لتحميل إطار مقياس التوتر الميكانيكية (8B الشكل). خفض الإطار على الجانبين وبالتالي فإن التوتر يعمل إلا من خلال الألياف. الفارغة على مقياس التوتر وجمع البيانات. ينصح معدل سلالة معيار من 2٪ في الثانية الواحدة.
  5. باستخدام البيانات التي تم جمعها وقطر متوسط، يمكن منحنى إجهاد المرسومة.
  6. ويمكن الآن لكسر الألياف يمكن تركيبه على المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) كعب للتحاليل والقياسات المورفولوجية انقطاع القطر نقطة. ويمكن استخدام جزء من الألياف بعيدا عن نقطة فاصل لتقدير والتحقق من قطر الأولي تقاس ضوء المجهر.

9. ممثل النتائج

من الخطوة 3، ينبغي تحليل للأجزاء المختلفة من قبل SDS-PAGE وتحليل البروتينات تصور مع الفضةأو Coomassie بريليانت الأزرق R-250. من الشروط القياسية عمود ني NTA، يمكن الحصول على الكسور شطف مع الطهارة> 90٪ (الشكل 9). يمكن أن تكون صغيرة من البروتينات تلويث أبعد من غسيل الكلى واسعة النطاق. باستخدام 25 ميكرولتر من الغزل منشطات في 20٪ (W / V)، يمكن جمع ما لا يقل عن 30 عينات من الألياف منفصلة عن الألياف الجرح المستمر على بكرة (يفترض وجود طول الأولي 13 ملم المستخدمة و). ويمكن تحليل الخصائص الميكانيكية عن طريق اختبارات مقياس التوتر (شكل 10). اعتمادا على بروتين الحرير المؤتلف المستخدمة في عملية الغزل، وسوف تدور نسب آخر تعادل الحد الأقصى يجب أن يتم تحديد تجريبيا. بشكل عام، إضافة تدور رسم نسب 4.0x لا يمكن أن يتحقق من دون فشل الألياف (الشكل 10). ألياف شباك، قبل أو بعد تعادله زيادة ونقصان آخر، يمكن تحليل مع المجهر الإلكتروني الماسح لتصور التركيب الدقيق (الشكل رقم 11A، B). ويمكن أيضا الألياف شباك لإجراء اختبارات ميكانيكية، وعرض النتائجمع أن التباين المنخفض في فخ التعادل تدور مجموعة آخر عينة نسبة (الشكل 10).

الشكل 1
الشكل 1. التعبير من حرير العنكبوت [كدنا] في البكتيريا. أ) يتم تحويل TOPO / ثيو pBAD ناقلات تحتوي على حرير العنكبوت [كدنا] من الاهتمام إلى هاء المختصة كولاي الخلايا. ب) يتم تلقيح مستعمرة واحدة في 200 مل من LB ونمت من التشبع بين عشية وضحاها. بعد التلقيح، ويضاف 800 مل من LB الطازجة والتي يسببها للثقافة للتعبير باستخدام أرابينوز. C) في ختام الاستقراء، والثقافة هي مكعبات بواسطة الطرد المركزي. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2
الشكل 2. تحلل من الخلايا البكتيرية بعد حرير العنكبوت الاستقراء بروتين. أ) عشرون milliliيضاف النسب من عازلة تحلل 1X والدناز إلى بيليه الخلية وضعت على شاكر المدارية وsonicated إلى ليز الخلايا. B) ونسج والمحللة خلية في جهاز للطرد المركزي لمسح طاف من الحطام الخلوية، ويتم جمعها وطاف. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل 3. تنقية البروتينات حرير العنكبوت المؤتلف باستخدام التقارب اللوني. أ) يتم إضافة خلية المحللة طاف والخرز ني NTA إلى عمود اللوني وحضنت لمدة 1 ساعة. B) بعد أن يتم جمع flowthrough، وتستخدم 20 مل من عازلة غسيل و 20 مل من شطف العازلة في تسلسل وجمعت في 5 مل من الكسور. C) ويتم تحليل كسور مختلفة بواسطة SDS-PAGE، ويتم نقل العينات التي تحتوي على بروتين نقي هدف إلى كيس غسيل الكلى ومدال ضد الماء إلى DIالانتهاء. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 4
الشكل 4. إعداد حرير العنكبوت لتنقية البروتين الغزل الرطب. أ) يتم نقل المنتجات إلى مدال أنابيب الطرد المركزي قبل وزنه في aliquots 1 مل. B) وميض وaliquots 1 مل المجمدة مع النيتروجين السائل. ج) مجفف بالتجميد العينات المجمدة ويتم إضافة المزيد من عينة لغسيل الكلى. D) ويتم حساب كتلة المجفف ويضاف HFIP إلى مسحوق جاف لإنتاج مخدر 20٪ (W / V) الغزل. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 5
الشكل 5. التحميل من مخدر الغزل في محقنة زجاجية للالغزل الرطب. أ) على الرغم من اجراء syrinجنرال الكتريك عموديا، يتم الضغط على مخدر الغزل إلى أعلى العمود حقنة، وإزالة فقاعات الهواء. ب) ويرد المحاقن تحميلها إلى المضخة المحاقن وإنزالها في حمام من الأيزوبروبانول 95٪ لذلك الطرف هو كسر للتو على سطح الحمام.

الشكل (6)
الشكل (6). تغليف من ألياف تركيبية حرير العنكبوت على جهاز مخصص تترنح. أ) يتم إنشاء جهاز التخزين المؤقت من الفرجار الرقمية مع الأمشاط المعدنية المرفقة. يتم تطبيق الشريط مزدوجة من جانب لكلا الجانبين من مشط لنعلق نهايات الألياف. ب) ويرد التخزين المؤقت إلى محرك سرعة بطيئة باستخدام مشبك التمساح. ج) يتم سحبها ببطء والالياف من حمام الكحول وجرح حوالي التخزين المؤقت. D) يتم تطبيق الغراء على حافة كل قطعة من الألياف لعقد لهم في المكان. أظهرت نوعان من الألياف مختلف نسج من البروتينات المختلفة.

الشكل 7 الشكل 7. في مرحلة ما بعد زيادة ونقصان رسم من الألياف الاصطناعية باستخدام جهاز محلية الصنع. A) ويرد جهاز التخزين المؤقت إلى الإعداد المحرك الخطي باستخدام مقاطع التمساح. ب) بعد التعادل خطوة آخر زيادة ونقصان، ورفع بكرة من الحمام. ويسمح قطرات الأيزوبروبانول لتتبخر قبل مجموعة من الألياف.

الشكل 8
الرقم 8. تركيب ألياف حرير صناعي في الصعود إلى البطاقات للدراسات الميكانيكية. A) هي التي شنت الألياف التي يتم جمعها على إطارات البطاقات مع 1 انقطاع "س 1". وتعقد في البداية الألياف في مكان مع الشريط مزدوجة من جانب، وثابتة ثم مع الغراء. ب) تم إصلاح الإطار البطاقات في الصعود إلى مقياس التوتر. ثم يتم قطع الاطراف وبالتالي فإن التوتر يعمل فقط على الرغم من أن الألياف.

الشكل 9
الشكل 9. الحجم تجزئة من تنقية البروتينات المؤتلف MaSp1ن الكسور باستخدام SDS-PAGE تحليل تليها التصور مع تلطيخ الفضة. ويصور سلم بروتين في كيلو دالتون. العينات يغسل 2 تظهر غير محددة ملزمة للحبات، في حين أن العينات شطف تكشف عن الحاجة لمدة 6 مجموعات لضمان انتعاش إجمالي البروتين.

الشكل 10
الشكل 10. منحنيات إجهاد من ألياف نسج من البروتينات TuSp1 المؤتلف. 8 ألوان تظهر الألياف التي كانت خاضعة لنسب مختلفة تدور التعادل آخر، بدءا من 2.5x و حتى 6x. ألياف إظهار التباين المنخفض ضمن مجموعة نسبتهم، كما تدور آخر تعادل نسب الزيادة، وزاد من قوة من الألياف بينما انخفضت التمدد.

الشكل 11
الرقم 11. مسح الصور المجهر الإلكتروني من ألياف نسج من البروتينات TuSp1 المؤتلف. أ) في تكبير 500x، وخارجي سلسويمكن رؤية السطح. ب) في 5000X، يمكن ملاحظة جوهر الداخلية الكثيفة من فاصل طبيعي للألياف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ألياف تركيبية من نسج هذه المنهجية هي ميكانيكيا على نفس الترتيب من حيث الحجم مقارنة مع الألياف الطبيعية. من خلال خفض كمية من خطأ بشري من قبل ميكنة التخزين المؤقت وعمليات السحب آخر زيادة ونقصان، والاختلاف بين العينات التجريبية هي أكثر رقابة وتقلص إلى حد كبير.

منهجيتنا يوفر القدرة على التحقيق في الخواص الميكانيكية للألياف الأخرى التي يتم نسج من البروتينات المؤتلف المشفرة من cDNAs من الأعضاء الآخرين في أسرة جين العنكبوت. يحتمل أن تكون، يمكن أن تحدد دور الميكانيكية من وحدات بروتين مختلفة داخل فبروين، أو بين أنواع مختلفة فبروين (23). كما أنه يسمح للاختبار من ألياف الحرير والمواد المركبة، كما يمكن الجمع بين أكثر من بروتين الحرير أو جزيئات أخرى أو إضافتها ونسج على شكل مزيج من البروتين.

هذه المنهجية الغزل هو منبر للمختبرات أخرى لتوسيع بسهولة عليها، كما ابايمكن بناؤها ratuses بطريقة سهلة. وهذا يسمح أيضا لتعديل المعلمات على طول كل خطوة لتحسين أو تخصيص تصميم معين من الألياف مع خصائص ميكانيكية فريدة من نوعها. كذلك الحاجة إلى الحيوية الخضراء للزيادات في المستقبل، يمكن تكييف هذه المنهجية لانتاج الألياف التي تخدم مجموعة من تطبيقات الجيل المقبل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جبهة الخلاص الوطني منح RUI MCB-0950372 و 1105310 DMR-بعنوان "التوصيف الجزيئي من الحرائر عنكبوت الأرملة السوداء، والسلوك الميكانيكي للالحرائر الغراء العنكبوت"، على التوالي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit Invitrogen K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x Promega V857C
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210 Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit Sigma-Aldrich PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer Labconco 7960041 FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP) Sigma-Aldrich 52512
Syringe Hamilton 7657-01 250 μL
Needle Hamilton 7780-01 26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump Harvard Apparatus 702208 11Plus
Digital Caliper Carrera CP5906 0-150 mm range
Stainless steel forceps World Precision Instruments 501764 Mini Dumont #M5S
Motor Nature Mill 7090529 12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator Warner Electric 01-D024-0050-A06-LP-IP65 24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope Leica Microsystems Leica MZ16
Digital microscope camera Leica Microsystems DFC320 Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors World Precision Instruments 500260
Microtensometer Aurora Scientific 310C 5N Dual-Mode System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
  2. Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
  3. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
  4. Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
  5. Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
  6. Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
  7. Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
  8. Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
  9. Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
  10. Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
  11. Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
  12. Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
  13. Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
  14. Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
  15. Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
  16. An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
  17. Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
  18. Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
  19. Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
  20. Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
  21. Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
  22. La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
  23. Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 65، الكيمياء الحيوية، حرير العنكبوت، fibroins تركيبية عنكبوت الحرير، والحرير المنتجة الغدد، والرطب، الغزل، بعد زيادة ونقصان رسم
الاصطناعية إنتاج حرير العنكبوت على نطاق المختبر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsia, Y., Gnesa, E., Pacheco, R.,… More

Hsia, Y., Gnesa, E., Pacheco, R., Kohler, K., Jeffery, F., Vierra, C. Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale. J. Vis. Exp. (65), e4191, doi:10.3791/4191 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter