Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Syntetisk edderkoppespind Produktionen på laboratorieskala

Published: July 18, 2012 doi: 10.3791/4191
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Pacific

Summary

Trods de fremragende mekaniske og biokemiske egenskaber af spindemider silke, kan dette materiale ikke kan høstes i store mængder ved hjælp af konventionelle midler. Her beskriver vi en effektiv strategi til at spinde kunstige edderkoppespind fibre, hvilket er en vigtig proces for efterforskerne at studere edderkoppespind produktion og deres anvendelse som næste generation biomaterialer.

Abstract

Som samfund skrider frem, og ressourcerne bliver færre, er det stadig mere vigtigt at opdyrke nye teknologier, ingeniør næste generation biomaterialer med højtydende egenskaber. Udviklingen af ​​disse nye strukturelle materialer skal være hurtig, omkostningseffektiv og involverer behandling metoder og produkter, der er miljøvenlig og bæredygtig. Edderkopper spinder et væld af forskellige fibertyper med forskellige mekaniske egenskaber, som tilbyder en rig kilde til næste generation af konstruktionsmaterialer for biomimetik, at rivaliserende de bedste menneskeskabte og naturlige materialer. Siden indsamling af store mængder af naturlige edderkoppespind er upraktisk, syntetisk silke produktion har evnen til at give forskerne adgang til en ubegrænset forsyning af tråde. Derfor, hvis udspinding kan strømlines og perfektioneret, kunstige edderkopper fibre har potentiale brug for en bred vifte af applikationer lige fra skudsikre veste, kirurgisk suturs og tovværk, dæk, strygere til musikinstrumenter, og kompositter til luftfart og rumfart teknologi. For at fremme den syntetiske silke fremstillingsprocessen og til opnåelse af fibre, der vises lav varians i deres materialeegenskaber fra spin at spinde, har vi udviklet en vådspinding protokol, der integrerer ekspression af rekombinante edderkoppesilkeproteiner i bakterier, oprensning og koncentrering af proteinerne , efterfulgt af fiber ekstrudering og en mekanisk efter centrifugering behandling. Dette er det første visuelle repræsentation, som afslører en trin-for-trin proces at spinde og analysere kunstige silke fibre på en laboratorieskala. Det giver også nærmere at minimere indførelsen af ​​variabilitet blandt fibre spundet af den samme roterende DOPE. Tilsammen vil disse metoder drive processen med kunstig silke produktion, hvilket fører til højere kvalitet fibre, der overgår naturlige edderkop silke.

Introduction

Edderkoppespind har ekstraordinære mekaniske egenskaber, der ud udfører flere menneskeskabte materialer, herunder højstyrkestål, Kevlar og nylon. 1 Edderkopper snurre mindst 6-7 forskellige fibertyper, der viser forskellige mekaniske egenskaber, hver designet med varierende mængder af trækstyrke og udvidelsesmuligheder til at udføre specifikke biologiske opgaver 2. Forskere er hurtigt at forfølge brugen af spider silke som næste generation biomaterialer på grund af deres fremragende mekaniske egenskaber, deres biokompatibilitet, og deres ikke-giftige og grønt-materielle natur. 3,4 grund af kannibalistiske og giftige karakter af spindlere, høst spider silke gennem landbrug er ikke en praktisk strategi for at opfylde de krav, der er nødvendige for industriel skala produktion. Derfor har forskere vendt til fremstilling af rekombinante silke proteiner i transgene organismer koblet med in vitro spinding af syntetiske fibre frafor sig oprensede proteiner. 5-8 Ekspression af fuld-længde rekombinante edderkoppesilkeproteiner er teknisk vanskeligt på grund af de iboende egenskaber ved de gensekvenser, der indbefatter deres yderst repetitive natur og fysiske længder (> 15 kb), GC-rigt indhold og forspændt alanin og glycin kodonanvendelse. 9-11 Til dato har de fleste laboratorier fokuseret på at udtrykke trunkerede former af de store ampullate silkeproteiner MaSp1 eller MaSp2 hjælp partielle cDNA-sekvenser eller syntetiske gener. 12-15 Spinning syntetisk spider silke er en vanskelig proces, der kræver beherskelse og viden i flere videnskabelige discipliner, og snørklede af spinding processen er ikke blevet fuldt afsløret for offentligheden ved hjælp af video repræsentation. Faktisk har kun en håndfuld laboratorier over hele verden ekspertise til at udtrykke de edderkoppespind cDNA'erne, rense silkeproteiner, spin syntetiske fibre og udførelse af post-spin uafgjort, og så endelig teste deres biomateriale egenskaber. 8,16,17 Forskellige tilgange til spinding syntetiske fibre er omfattet våde og tørre spinning samt electrospinning metoder 16,18,19 Alle procedurer har ét mål tilfælles -. Udvikling af en protokol, der producerer syntetisk edderkoppespind med mekaniske egenskaber, at rivaliserende naturlige tråde for store kommercielle fremstillingsprocesser.

Her beskrives proceduren til frembringelse kunstige spider silke i laboratoriemålestok under anvendelse af en vådspinding metode. I forhold til andre roterende metoder har vådspinding produceret de mest konsistente resultater for fiber-analyse. Vi beskrive denne procedure begynder med ekspressionen af ​​de rekombinante silke proteiner i bakterier, efterfulgt af deres oprensning og beskriver derefter proteinpræparatet trin til spinding, herunder post-spin-trækning, der anvendes ved AS-spundne "fibre, som giver tråde med materialeegenskaber, der nærmer sig kvaliteten af ​​naturlige spider silke. Vores methodology er designet til nøje at efterligne den naturlige udspinding af silke fibre, og det trækker kraftigt på vores ekspertise, arkitektur og funktion af silke-producerende kirtler fra Orb-og cob-vævning edderkopper. 20-22 Derudover, må vi konkludere med den nødvendige trin til at bestemme de væsentlige egenskaber ved de syntetiske fibre med en tensometer afbilde stress-strain kurver, som tillader forskere til at beregne den endelige styrke, endelige stamme, og sejheden af ​​fibre. Endelig, men af ​​betydelig værdi, kan de roterende, spole, og tegne apparater være hjemme-bygget ved hjælp af kommercielt tilgængelige dele, snarere end at købe omfattende og dyrt tilpasset udstyr.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Figur 11
Grafisk oversigt: Biomimicry af spindingsproces

Biomimicry af den naturlige edderkoppespind produktionsvej:. En rute til at fremstille syntetisk silke Dette billede viser den store ampullate kirtlen fra den gyldne Orb Weaver, Nephila clavipes, og de ​​komponenter, der anvendes til naturlig silke produktion (hvid tekst). Halen regionen syntetiserer store mængder af silke proteiner, der transporteres til ampulla, et lager region for det roterende dope. Denne koncentrerede additiv ekstruderes gennem den roterende kanal, hvor opløsningen oplever ionbytter og dehydrering før fiberekstrudering. De biomimetiske processer, der anvendes i vores laboratorium er markeret med den røde tekst. Rekombinant silkeproduktion genereres ved hjælp af transgene bakterier, efterfulgt af protein-oprensning ved kromatografi. Dernæst det oprensede protein er subfattet lyofilisering at koncentrere materiale. Endelig er proteinet genopløses i HFIP og ekstruderet fra en kanyle i en isopropanol-bad.

1. Plasmid Byggeri og bakteriel Cell Culture Forberedelse

  1. Udføre PCR under anvendelse af de ønskede edderkoppespind cDNA og specifikke primersæt. Gel-ekstrakt og ligere det amplificerede cDNA ind i en prokaryotisk ekspressionsvektor f.eks pBAD / TOPO ThioFusion (fig. 1A). Denne vektor har en N-terminal thioredoxin tag for at lette silkeprotein solubilisering og en C-terminal 6x his-tag til proteinoprensning. Omdanne ligeringsprodukter ind i kompetent E. coli-celler.
  2. Vælge kolonier, der indeholder den rekombinante kloningsvektor og anvende én koloni at pode 200 ml sterilt LB suppleret med ampicillin (fig. 1B). Dyrke denne kultur natten over mætning ved rystning ved 200 rpm i en orbital inkubator ved 37 ° C.
  3. Kombinere 200 ml saturated kultur med 800 ml frisk LB-kultur. Inducere edderkoppespind proteinekspression i 4 timer ved tilsætning af 0,2% arabinose (w / v). Sørg for at holde kulturen under antibiotisk selektion.
  4. Pelletere cellerne ved 16.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C (Fig. 1C). For enkelhedens skyld pelleten hele volumenet i en beholder. Multiple centrifugeringstrin kan være nødvendigt, afhængigt af volumenet kapacitet centrifugering rør. Om nødvendigt. Væsken volumen efter spinding og re-pellet yderligere materiale for at sikre, at hele cellepellet i en beholder Cellepellets kan opbevares ved -80 ° C indtil brug.
  5. Før bortskaffelse af brugte dyrkningsmedium, tilsættes blegemiddel eller autoklaveres for at sterilisere.

2. Cellelyse

  1. Der tilsættes 20 ml 1x lysepuffer til en L cellepelleten (fig. 2A). Sørg for at resuspendere cellepelleten helt.
  2. Tilsættes lysozym til en koncentration på 1 mg / ml til at fremme yderligerecellelyse. DNase kan også tilsættes på dette trin for at fordøje kromosomalt DNA til at reducere viskositeten af ​​opløsningen. Placere prøven på en orbitalryster og forsigtigt rokke i 20 min.
  3. Sonikeres opløsningen ved maksimal i 1 minut.
  4. Til klaring af opløsningen, centrifugen ved 16.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C (fig. 2B).

3. Protein Purification: Ni-NTA affinitetssøjlekromatografi

  1. Fjern supernatanten og overføre det til et rent 25 ml kromatografisøjle. Sørge supernatanten er ikke-viskos og klar. Hvis opløsningen er tyktflydende og uklar, tilføje flere DNase eller sonikatet og / eller re-pellet supernatanten (gentage trin 2,3-2,4).
  2. Tilsæt 1 ml Ni-NTA-opslæmning (0,5 ml perler) i kolonnen. Tæt fastgøre hætten og stophanen og derefter sat på en vippearm at ækvilibrere i 1 time for at tillade binding af 6x His-tag til Ni-NTA-perler (figur 3A).
  3. Sæt kolonnen lodret på enstå og tillader Ni-NTA-perler til bundfældning i omkring 2 minutter. En lyseblå lag kan ses nederst, når perlerne er helt afgjort.
  4. Fjerne hætten og tillade opløsningen at strømme gennem stophanen. Indsamle denne opløsning til yderligere analyse (fig. 3B).
  5. Der tilsættes 20 ml 1x vaskepuffer og tillade perlerne bundfælde sig. Åbne hanen og tillade opløsningen at strømme igennem. Samle denne opløsning i fire 5 ml portioner til yderligere analyse Bemærk: yderligere vask mængder kan anvendes til at reducere kontaminerende proteiner, men der er mulighed for en reduktion i den endelige proteinudbytte..
  6. Der tilsættes 20 ml 1x elueringsbuffer og tillade harpiksen at bundfælde sig. Åbne hanen og tillade opløsningen at strømme igennem. Samle denne opløsning i fire 5 ml portioner til videre analyse. Bemærk: Yderligere elueringsvolumener kan opsamles fra Ni-NTA-resin, hvis elueringen ikke er afsluttet.
  7. Prøver kan opbevares i 4° C eller -80 ° C i kortere eller længere tids opbevaring, hhv.
  8. Størrelsen-fraktionere prøver under anvendelse af SDS-PAGE-analyse. Visualisere proteinerne med sølv eller Coomassie Brilliant Blue R-250 (fig. 3C). Kun rene fraktioner bør anvendes ved de følgende trin. Bemærk: Western blot-analyse kan anvendes til at bekræfte identiteten af det oprensede protein.

4. Dialyse og lyofilisering

  1. Dialysere prøverne mod mindst 100x prøvevolumenet (anvende deioniseret vand) i 2 dage. Ændre vandopløsningen hver 6. time for at fjerne alle salte. Bemærk: Molekylvægten størrelse afskæring af dialyseslangen afhænger af størrelsen af det rekombinante silkeprotein.
  2. Afvej seks 1,5 ml tomme mikrocentrifugerør og registrere deres masser. Kan det være nyttigt at punktere små huller eller spalter på hætterne af rørene før vejning for frysetørring for at lette lyofilisering (fig. 4A).
  3. After dialyse, overførsel 1 ml af den dialyserede prøve i hver af de seks tarerede mikrofuge rør (fig. 4B). Flash fryse anvendelse af flydende nitrogen og tør prøverne ned med en frysetørrer (fig. 4C).
  4. Når først tørt, overfører en anden 1 ml af dialyse prøven i hver af de seks rør. Gentages, indtil hele dialyse prøven er blevet tørret ned i mikrocentrifugerør.
  5. Frysetørrede prøver kan opbevares ved -80 ° C til langtidsopbevaring.

5. Spinning Dope Forberedelse

  1. Afvej hver mikrocentrifugerør indeholdende det tørrede protein pulver. Fratræk den oprindelige masse af de tomme rør for at opnå total tør proteinmasse. Bemærk: Afhængigt af proteinindhold, kan du blive nødt til at rense yderligere materiale til spinding processen.
  2. Beregne mængden af ​​hexafluorisopropanol (HFIP) for at tilføje til hvert rør for at opnå 200 mg / ml til 500 mg / ml eller 20% til 50% vægt per volumen. Tilsæt hensigtsspiste mængde HFIP i hvert rør (Fig. 4D). Bemærk: HFIP er meget flygtigt og giftigt, pipette forsigtigt og lægge loft over røret så hurtigt som muligt. HFIP skal håndteres under en sikkerheds hætte.
  3. Parafilm rørene og sted på en rocker til at opløse proteinet. Vortex, og der centrifugeres lejlighedsvis for at lette opløsning. Dette kan tage op til 2 dage.

6. Klargøring af sprøjte og Apparat Setup

  1. Belastning på mindst 25 pi af solubiliserede roterende dopen i sprøjten. Sørg for, at der ikke er nogen aggregater til stede, da det kan tilstoppe sprøjten. Bemærk: Denne prøve er utroligt tyktflydende, så vær forsigtig, når pipettering.
  2. Skub dope til forsiden af sprøjten lodret, fjerne alle luftbobler (Fig. 5A). Bemærk: Luftbobler skabe uoverensstemmelser i fiberen.
  3. Låse sprøjten til pumpen. Tilvejebringe en 400 ml bægerglas fyldt med 95% isopropanol op, så spidsen af ​​sprøjtener lige bryde overfladen af alkoholen (fig. 5B).
  4. Indstille sprøjtepumpen til 15 uL / ​​minut, og programmet startes. Tillade som spundet fiber til at sidde i isopropanol i 20 minutter for fuldstændigt at ækvilibrere. Bemærk: Disse fibre kan stadig anvendes ved MS / MS-analyse for at bekræfte identiteten af proteinerne i fibrene.

7. Post-spin-Draw og Prøvetagning

  1. Anvendes dobbeltsidet tape til begge sider af kammen på opspolingen enheden. Opspolingen indretning blev skabt limning metal kamme til en digital skydelære (fig. 6A). Fastgøre spooling enheden til en motor (fig. 6B). Vi anbefaler spooler trådene ved 2 opm. Bemærk: hurtigere spole hastigheder resulterer i store mængder af variation i fiberkvaliteten og reproducerbarhed.
  2. Ved hjælp af en pincet forsigtigt gribe den ene ende af fiberen og langsomt trække den ud af isopropanol, at fastgøre det til kanten af ​​et af kammen arme på spolen (Fig. 6C). De næste trin bør udføres uden stop for at forhindre fibrene i at tørre ud.
  3. Tænd for motoren og forsigtigt styre fiber på spooling enhed. Bemærk: Under spooling, tillader ikke, at fiber til at doble op og stables oven på hinanden.
  4. Når hele fiberen spoles, løsnes spolen fra motoren og anvende lim til kanten af hver silke fiber på dobbeltklæbende tape (fig. 6D). Dette fastgør edderkoppespind på apparatet. Bemærk: Ved at anvende lim til dobbeltsidet tape forud for post-centrifugering tegning, forhindrer det hele fiberen i at glide og tillader selektiv strækning af de indre segmenter af fibre i tykkelse arme.
  5. Fastgøre spolen til den lineære aktuator (fig. 7A). Registrere den oprindelige længden af fibrene ved hjælp af tykkelsen Bemærk at dette er den indre længde af fiberen. Det omfatter ikke limet længde og pakkes around spolen.
  6. Sænke spolen i en 75% isopropanol-bad. Fibrene til at ækvilibrere i 10 minutter. Bemærk: Andre dehydratiseringsmidler opløsninger kan anvendes til spindeprocessen, såsom methanol, acetone og ammoniumsulfat.
  7. Indstilles lineære aktuator hastigheden til 1,5 mm / sek. Baseret på den oprindelige længde, den endelige længde beregne den ønskede efter centrifugering trækforhold. Den strakte Mængden kan styres på grundlag af hastigheden eller længden, afhængig af opstillingen. For eksempel med en første længde på 15 mm og en ønsket efter centrifugering trækforhold på 3x bør den endelige længde være 45 mm. Dette kan også beregnes som fremdriver lineære aktuator i 20 sekunder ved en hastighed på 1,5 mm / sek.
  8. Når den ønskede stilling centrifugering draw er fuldstændig, langsomt øge spolen ud af isopropanol. Tillade dråber af isopropanol for at tørre i 1 minut og derefter indsamle prøver (Fig. 7B). Prøver skal monteres på karton eller folie rammer for afprøvning purudgør.
  9. Hvis yderligere indlæg spin-trækforhold ønskes, sænke spolen tilbage i 75% isopropanol bad. Fibrene til at ækvilibrere i 10 minutter, og derpå videre til den næste post centrifugering trækforhold.

8. Trækprøvning

  1. Tillade de opsamlede prøver at ækvilibrere til standarden laboratoriemiljø i mindst 1 time før mekanisk afprøvning. Den luftfugtighed og temperatur bør registreres, da de kan påvirke fiber mekaniske egenskaber. Normal luftfugtighed og temperatur bør være ca 40% og 25 ° C, hhv.
  2. Lim kanter karton eller folie for at fastgøre fibrene på rammen. Vær opmærksom på størrelsen af ​​åbningen af ​​rammen. Dette er den indledende længden af ​​din testede fiber. En en tomme (25,4 mm) åbning rammen er vist her (fig. 8A).
  3. Ved hjælp af et lysmikroskop med en 100x eller større forstørrelse, at diametermålinger langs den langsgående fiberaksen.Mindst 3 målinger skal registreres. Jo højere forstørrelse anvendes, og de flere målinger, jo bedre nøjagtighed.
  4. Fastgøre rammen til en tensometer mekanisk belastning rammen (fig. 8B). Skær rammen på begge sider, således at spændingen kun kører gennem fiberen. Tarere tensometer og indsamle data. En standard belastning på 2% pr sekund anbefales.
  5. Ved hjælp af de indsamlede data og den gennemsnitlige diameter, kan en spænding deformationskurve afsættes.
  6. Den brudte fibre kan nu monteres på et scanningselektronmikroskop (SEM) stub for morfologiske analyser og brudpunkt diameter målinger. Fiberen segment bort fra knækpunkt kan anvendes til at estimere og kontrollere den oprindelige diameter, målt ved lysmikroskop.

9. Repræsentative resultater

Fra trin 3, bør de forskellige fraktioner analyseres ved SDS-PAGE-analyse, og proteinerne visualiseret med sølveller Coomassie Brilliant Blue R-250. Fra en standard Ni-NTA-søjle betingelser kan elueringsfraktionerne med> 90% renhed opnås (fig. 9). Små kontaminerende proteiner kan yderligere fjernes ved omfattende dialyse. Anvendelse af 25 pi spinding smørelse ved 20% (w / v), kan mindst 30 forskellige fibre prøver indsamles fra den kontinuerlige viklet fiber på spolen (antager en første længde på 13 mm anvendes). De mekaniske egenskaber kan analyseres ved tensometer tests (fig. 10). Afhængigt af den rekombinante silkeprotein anvendes til udspinding vil de maksimale efterfølgende centrifugering trækforhold skal bestemmes empirisk. I almindelighed sende centrifugering trækforhold på 4,0 x kan opnås uden fibersvigt (fig. 10). Spundne fibre, før eller efter efterfølgende centrifugering træk, kan analyseres med et scannende elektronmikroskop at visualisere ultrastruktur (Fig. 11A, B). Spundne fibre kan også anvendes til mekanisk afprøvning, viser resultaterneat med lav variation i en stilling centrifugering trækforhold prøvegruppe (fig. 10).

Figur 1
Figur 1. Ekspression af edderkoppespind cDNA i bakterier. A) pBAD TOPO / Thio vektor indeholdende edderkoppespind cDNA'et af interesse er transformeret ind i kompetente E. coli-celler. B) En enkelt koloni inokuleres i 200 ml LB og dyrkes til mætning natten over. Efter inokulation er 800 ml frisk LB tilsat, og kulturen induceret til ekspression ved hjælp af arabinose. C) Ved afslutningen af induktion, er kulturen pelleteret ved centrifugering. Klik her for at se større figur .

Figur 2
Figur 2. Lysis af bakterielle celler efter edderkoppespind protein induktion. A) Tyve milliliformen, der vedrører 1x lysisbuffer og DNase tilsat til cellepelleten, og anbringes på en orbitalryster og sonikeret for at lysere cellerne. B) Cellelysatet centrifugeres i en centrifuge for at fjerne supernatanten fra celleaffald, og supernatanten opsamles. se større figur .

Figur 3
Figur 3. Oprensning af edderkoppespind rekombinante proteiner ved anvendelse af affinitetschromatografi. A) Cellelysatet supernatanten og Ni-NTA-perler tilsættes til en kromatografisøjle og inkuberet i 1 time. B) Når gennemstrømningen opsamles, er 20 ml vaskepuffer og 20 ml af elueringsbuffer anvendes i rækkefølge og opsamlet i 5 ml fraktioner. C) De forskellige fraktioner analyseres ved SDS-PAGE; rene prøver indeholdende målproteinet overføres til en dialysepose og dialyseres mod DI vandfærdiggørelse. Klik her for at se større figur .

Figur 4
Figur 4. Fremstillinq af oprensede edderkoppespind protein til vådspinding. A) Den dialyserede produkt overføres til et tareret centrifugerør i 1 ml alikvoter. B) 1 ml aliquoter lynfryses i flydende nitrogen. C) De frosne prøver lyofiliseres og mere dialyse prøve tilsættes. D) tørrede masse beregnet og HFIP tilsættes til det tørre pulver til fremstilling af en 20% (w / v) spinning DOPE. se større figur .

Figur 5
Figur 5. Belastning af spinding dopen i glassprøjte for vådspinding. A) Mens du holder syringe lodret, er den roterende dopen skubbet til toppen af ​​sprøjten kolonnen fjerne luftbobler. B) indlæses sprøjte er fastgjort til sprøjtepumpen, og sænkes ned i 95% isopropanol-bad, således at spidsen kun bryder overfladen af ​​badet.

Figur 6
Figur 6. Spooling af de syntetiske edderkoppespind fibrene på en brugerdefineret rulleindretning. A) opspolingen indretning er konstrueret af en digital skydelære med påsat metal kamme. Dobbeltsidet tape påført på begge sider af kammen for at fastgøre fiberenderne. B) spolen er fastgjort til den langsomme motoren ved hjælp af et krokodillenæb. C) Fiberen langsomt trukket ud fra alkoholen badet og vikles omkring spolen. D) Lim påføres kanten af ​​hver fiber segment for at holde dem på plads. Vist to forskellige fibre spundet af forskellige proteiner.

Figur 7 Figur 7. Post-spin trække de syntetiske fibre med en hjemmelavet apparat. A) opspolingen indretningen er fastgjort til den lineære aktuator opstilling ved anvendelse krokodillenæb. B) Efter et indlæg tur uafgjort trin, er spolen løftes fra badet. Isopropanol dråber får lov at fordampe, før fiberen samling.

Figur 8
Figur 8. Montering af de syntetiske silkefibre ned på en karton til mekaniske studier. A) opsamlede fibre er monteret på karton rammer med en 1 "x 1" udskæring. Fibrene indledningsvis holdes på plads med dobbeltsidet tape og derefter fikseret med lim. B) karton rammen er fastgjort på en tensometer. Siderne bliver derefter skåret, så spændingen kun kører om fiberen.

Figur 9
Figur 9. Størrelsesfraktionering af oprenset rekombinant MaSp1 protein fraktioner under anvendelse af SDS-PAGE-analyse efterfulgt af visualisering med sølvfarvning. Protein stige er vist i kDa. De to vasketrin prøver viser ikke-specifik binding til perlerne, mens elueringstider prøverne viser behovet for 6 samlinger at sikre total protein-indvinding.

Figur 10
Figur 10. Stress strain kurver af fibre spundet fra rekombinante TuSp1 proteiner. 8 farver viser, fibre, der var genstand for forskellige indlæg spin-trækforhold, der spænder fra 2,5 x til 6x. Fibrene udviser lav variation i deres forhold gruppe som efter centrifugering trækforhold stigning er styrken af ​​fiberen forøges, medens strækbarhed formindskes.

Figur 11
Figur 11. Scanningselektronmikroskopi billeder af fibre spundet af rekombinante TuSp1 proteiner. A) I 500x forstørrelse, den glatte udvendigeOverfladen kan ses. B) med 5000X, kan den tætte indre kerne ses fra en naturlig pause fiber.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Syntetiske fibre spundet af denne metodik er mekanisk på samme størrelsesorden i forhold til de naturlige fibre. Ved at nedsætte mængden af ​​menneskelige fejl ved mekanisering køen og efterfølgende centrifugering draw fremgangsmåder er den eksperimentelle variation mellem prøver mere kontrolleret og i høj grad reduceret.

Vores metode giver mulighed for at undersøge de mekaniske egenskaber af andre fibre, der er spundet af rekombinante proteiner kodet af cDNA'erne for andre medlemmer af edderkop genfamilien. Potentielt kunne bestemme den mekaniske rolle af forskellige protein moduler i en fibroin eller mellem de forskellige fibroin typer. 23. Det giver også mulighed for undersøgelse af silkefibre som kompositter, som mere end én silkeprotein eller andre molekyler kan kombineres eller tilsættes og centrifugeret som en proteinblanding.

Dette spinning metode er en platform for andre laboratorier for nemt at udvide, da appAratuses kan konstrueres på en let måde. Dette giver også mulighed for at justere parametre langs hvert trin for at optimere eller tilpasse udformningen af ​​specifikke fibre med unikke mekaniske egenskaber. Da behovet for grønne biomaterialer til de fremtidige vokser, kan denne metode kan tilpasses til fremstilling af fibre, der tjener en række næste generation af applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NSF RUI Tilskud MCB-0950372 og DMR-1105310 med titlen "Molekylær Karakterisering af sort enke edderkop silke og mekaniske opførsel af Spider Lim Silks," hhv.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit Invitrogen K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x Promega V857C
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210 Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit Sigma-Aldrich PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer Labconco 7960041 FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP) Sigma-Aldrich 52512
Syringe Hamilton 7657-01 250 μL
Needle Hamilton 7780-01 26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump Harvard Apparatus 702208 11Plus
Digital Caliper Carrera CP5906 0-150 mm range
Stainless steel forceps World Precision Instruments 501764 Mini Dumont #M5S
Motor Nature Mill 7090529 12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator Warner Electric 01-D024-0050-A06-LP-IP65 24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope Leica Microsystems Leica MZ16
Digital microscope camera Leica Microsystems DFC320 Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors World Precision Instruments 500260
Microtensometer Aurora Scientific 310C 5N Dual-Mode System

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
  2. Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
  3. Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
  4. Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
  5. Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
  6. Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
  7. Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
  8. Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
  9. Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
  10. Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
  11. Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
  12. Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
  13. Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
  14. Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
  15. Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
  16. An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
  17. Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
  18. Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
  19. Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
  20. Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
  21. Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
  22. La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
  23. Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).

Tags

Bioengineering biokemi edderkoppespind fibroins syntetisk edderkoppespind silke-producerende kirtler vådspinding post-spin tegne
Syntetisk edderkoppespind Produktionen på laboratorieskala
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsia, Y., Gnesa, E., Pacheco, R.,… More

Hsia, Y., Gnesa, E., Pacheco, R., Kohler, K., Jeffery, F., Vierra, C. Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale. J. Vis. Exp. (65), e4191, doi:10.3791/4191 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter