Summary
Malgré les excellentes propriétés mécaniques et biochimiques de soies de l'araignée, ce matériau ne peut être récolté en grandes quantités par des moyens conventionnels. Nous décrivons ici une stratégie efficace pour faire tourner fibres artificielles de soie d'araignée, ce qui est un processus important pour les enquêteurs qui étudient la production de soie d'araignée et de leur utilisation en tant que prochaine génération de biomatériaux.
Abstract
Comme la société progresse et les ressources se raréfient, il est de plus en plus important de cultiver de nouvelles technologies qui biomatériaux ingénieur de la prochaine génération avec des propriétés de haute performance. Le développement de ces nouveaux matériaux structurels doit être rapide, rentable et sur les méthodologies de traitement et des produits qui sont respectueux de l'environnement et durable. Araignées tissent une multitude de différents types de fibres avec diverses propriétés mécaniques, offrant une riche source de matériaux d'ingénierie prochaines génération pour le biomimétisme qui rivalisent avec les meilleurs matériaux naturels et anthropiques. Depuis la collecte de grandes quantités de soie d'araignée naturelle n'est pas possible, la production de soie synthétique a la capacité de fournir aux scientifiques d'avoir accès à un approvisionnement illimité de threads. Par conséquent, si le procédé de filage peut être simplifié et perfectionné, les fibres d'araignée artificielle ont le potentiel de l'utilisation pour un large éventail d'applications allant des gilets pare-balles, suture chirurgicales, cordes et cordages, les pneus, les cordes pour instruments de musique, et les matériaux composites pour l'aviation et de la technologie aérospatiale. Afin de faire progresser le processus de soie synthétique de production et de céder des fibres qui affichent une faible variance dans leurs propriétés des matériaux à partir de spin à tourner, nous avons développé un protocole de filage au mouillé qui intègre l'expression de protéines recombinantes de soie d'araignée dans les bactéries, la purification et la concentration des protéines , suivie par extrusion de fibres et une post-rotation mécanique de traitement. Il s'agit de la première représentation visuelle qui révèle un processus étape par étape pour faire tourner et d'analyser les fibres de soie artificielle sur une échelle de laboratoire. Il fournit également des détails afin de minimiser l'introduction de la variabilité entre les fibres filées à partir de la dope même filature. Collectivement, ces méthodes va propulser le processus de production de la soie artificielle, ce qui conduit à des fibres de meilleure qualité qui dépassent les soies d'araignée naturelle.
Introduction
Soie de l'araignée a des propriétés mécaniques extraordinaires qui effectue des matériaux synthétiques, y compris plusieurs en acier haute résistance, le kevlar et le nylon. 1 araignées tissent au moins 6-7 différents types de fibres qui affichent diverses propriétés mécaniques, chacun étant conçu avec des quantités variables de résistance à la traction et l'extensibilité pour effectuer des tâches spécifiques. biologiques 2 Les chercheurs sont rapidement la poursuite de l'utilisation de la soie d'araignée en tant que biomatériaux de la prochaine génération en raison de leurs excellentes propriétés mécaniques, leur biocompatibilité et leur nature non-toxiques et vert-matériau. 3,4 En raison de la cannibale et la nature venimeuse des arachnides, la récolte des soies d'araignée à travers l'agriculture n'est pas une stratégie concrète pour répondre aux exigences nécessaires à la fabrication à l'échelle industrielle. Par conséquent, les scientifiques se sont tournés vers la production de protéines recombinantes de soie dans des organismes transgéniques couplé avec in vitro la filature de fibres synthétiques à partir de lasoi protéines purifiées. 5-8 Expression de pleine longueur des protéines recombinantes de soie d'araignée a été techniquement difficile compte tenu des propriétés intrinsèques de leurs séquences de gènes, qui comprennent leur nature hautement répétitive et les longueurs physiques (> 15 kb), riche en GC contenu et partiale alanine et la glycine codon usage 9-11. À ce jour, la plupart des laboratoires ont mis l'accent sur l'expression de formes tronquées des protéines majeures de soie ampullaires MASP1 ou MaSp2 utilisant des séquences partielles d'ADNc ou des gènes synthétiques. 12-15 Spinning synthétique araignée soie est un processus difficile qui exige maîtrise et des connaissances dans plusieurs disciplines scientifiques, et les subtilités du processus de filage n'ont pas été pleinement révélé au grand public par la représentation vidéo. En fait, seule une poignée de laboratoires à travers le monde ont l'expertise nécessaire pour exprimer les ADNc de soie d'araignée, de purifier les protéines de soie, le filage de fibres synthétiques et des fonctions de post-spin tirage, et puis finalement de tester leurs propriétés de biomatériaux. 8,16,17 Différentes approches pour le filage de fibres synthétiques ont englobé filage au mouillé et sec ainsi que des méthodes électrofilage 16,18,19 Toutes les procédures ont un but commun -. Élaboration d'un protocole qui produit la soie d'araignée synthétique ayant des propriétés mécaniques qui rivalisent avec les fils naturels à grande échelle des processus de fabrication commerciale.
Nous décrivons ici la procédure pour générer des soies d'araignée artificielle sur une échelle de laboratoire en utilisant une méthodologie de filage au mouillé. Par rapport aux autres procédés de filage, filage au mouillé a produit les résultats les plus cohérents pour l'analyse des fibres. On exposer cette procédure commençant avec l'expression des protéines de soie recombinant dans des bactéries, suivie par leur purification, puis décrire les étapes de préparation de protéines pour la filature, comprenant une méthodologie de post-étirage de spin appliquée à "comme" fibres filées et qui donne fils avec propriétés des matériaux qui se rapprochent de la qualité de la soie d'araignée naturelle. Notre démarche méthodologiquey est conçu pour imiter au mieux le processus naturel de filage de fibres de soie et il s'appuie largement sur notre expertise de l'architecture et la fonction des glandes produisant la soie de l'ORB-et torchis tissage araignées. 20-22 De plus, nous concluons avec la nécessaire des mesures pour déterminer les propriétés des matériaux des fibres synthétiques en utilisant un tensiomètre pour tracer courbes contrainte-déformation, qui permettent aux enquêteurs de calculer la résistance à la rupture, déformation ultime, et la ténacité des fibres. Enfin, mais de grande valeur, les appareils de filature, bobinage, et le dessin peuvent être à la maison construit en utilisant des pièces disponibles dans le commerce, plutôt que l'achat de matériel élaboré et coûteux personnalisé.
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Protocol
Aperçu graphique: Biomimicry du procédé de filage
Le biomimétisme de la voie de la production de soie d'araignée naturelle:. Un itinéraire pour la fabrication de la soie synthétique Cette image montre la glande ampullaires majeur du tisserand d'or orbe, Nephila clavipes, et les composants utilisés pour la production de soie naturelle (texte blanc). La région de la queue synthétise de grandes quantités de protéines de soie qui sont transportés à l'ampoule, une zone de stockage pour la solution de filage. Cette drogue concentrée est extrudé à travers le conduit de rotation où la solution subit les échanges ioniques et la déshydratation avant l'extrusion de fibres. Les processus biomimétiques utilisées dans notre laboratoire sont indiquées par le texte en rouge. La production recombinante de soie est généré en utilisant des bactéries transgéniques, suivie d'une purification de protéines en utilisant la chromatographie. Ensuite, la protéine purifiée est sousjet à une lyophilisation à concentrer le matériau. Enfin, la protéine est re-dissous dans HFIP et extrudé à partir d'une aiguille de seringue dans un bain d'isopropanol.
1. Construction du plasmide et bactérienne préparation de culture cellulaire
- Effectuer PCR en utilisant les ensembles de soie d'araignée souhaités amorces d'ADNc et spécifique. Gel-extraire et ligaturer l'ADNc amplifié dans un vecteur d'expression procaryote, par exemple pBAD / TOPO ThioFusion (fig. 1A). Ce vecteur a une balise thiorédoxine N-terminale pour faciliter la solubilisation de protéines de soie et un 6x son extrémité C-terminale-tag pour la purification des protéines. Transformer les produits de ligature dans E. compétente des cellules de E..
- Sélectionnez les colonies qui contiennent le vecteur recombinant de clonage et l'utilisation d'une colonie pour inoculer 200 ml de LB stérile additionné d'ampicilline (Fig. 1B). Cultiver cette culture du jour au lendemain de la saturation en agitant à 200 rpm dans un incubateur orbital à 37 ° C.
- Mélanger 200 ml de l'saturatla culture ed avec 800 mL de la culture LB frais. Induire l'expression de protéine de soie d'araignée pendant 4 heures en ajoutant l'arabinose 0,2% (p / v). Assurez-vous de conserver la culture en vertu de sélection antibiotique.
- Pellet les cellules à 16.000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C (Fig. 1C). Par souci de simplicité, d'une pastille de la totalité du volume contenu dans un récipient. Plusieurs étapes de centrifugation peut être nécessaire en fonction de la capacité du volume des tubes de centrifugation. Si nécessaire, décanter le volume de liquide après le filage et re-culot matériau supplémentaire pour assurer la cellule entière culot est contenu dans un récipient. Les culots cellulaires peuvent être stockés à -80 ° C jusqu'à ce que nécessaire.
- Avant de jeter les milieux de culture usés, ajouter l'eau de Javel ou à l'autoclave pour stériliser.
2. Lyse cellulaire
- Ajouter 20 ml de tampon de lyse 1x au 1 cellule L culot (figure 2A). Assurez-vous de remettre en suspension le culot cellulaire complètement.
- Ajouter le lysozyme à une concentration de 1 mg / ml de promouvoir en outrela lyse des cellules. DNase peuvent également être ajoutés à cette étape pour digérer l'ADN chromosomique pour aider à réduire la viscosité de la solution. Placer l'échantillon sur un agitateur orbital et balancer doucement pendant 20 min.
- Soniquer la solution au maximum pendant 1 minute.
- Afin de clarifier la solution, centrifugeuse à 16.000 xg pendant 10 minutes à 4 ° C (figure 2B).
3. Protein Purification: colonne Ni-NTA chromatographie d'affinité
- Eliminer le surnageant et le transférer dans un endroit propre colonne de chromatographie 25 mL. Assurez-vous que le surnageant est non-visqueux et clair. Si la solution est visqueuse et trouble, ajouter plus de DNase ou sonicat et / ou re-pastille le surnageant (2,3-2,4 répétez les étapes).
- Ajouter 1 mL de Ni-NTA suspension (0,5 mL perles) dans la colonne. Fixer solidement le bouchon et le robinet, puis définissez sur une bascule à s'équilibrer pendant 1 heure pour permettre la liaison de l'6x His-tag pour les perles Ni-NTA (figure 3A).
- Définissez la colonne verticale sur unese tenir debout et permettre aux billes de Ni-NTA se contenter d'environ 2 minutes. Une couche de lumière bleue peut être vu au fond lorsque les billes sont complètement réglé.
- Retirez le bouchon et laisser la solution de s'écouler à travers le robinet. Recueillir des cette solution pour une analyse ultérieure (figure 3B).
- Ajouter 20 ml de tampon de lavage 1x et permettre aux billes de régler. Ouvrez le robinet et laisser la solution de s'écouler à travers. Recueillir cette solution en aliquotes mL quatre 5 pour une analyse plus approfondie Note: Les volumes de lavage supplémentaires peuvent être utilisés pour réduire les protéines contaminantes, mais il ya une possibilité d'une baisse de rendement de protéine finale..
- Ajouter 20 ml de tampon d'élution 1x et permettre à la résine à régler. Ouvrez le robinet et laisser la solution de s'écouler à travers. Recueillir cette solution en quatre aliquotes de 5 ml pour une analyse plus approfondie. Remarque: volumes d'élution supplémentaires peuvent être collectées à partir de la résine Ni-NTA si l'élution n'est pas terminée.
- Échantillons peuvent être conservés à 4° C ou -80 ° C pour le stockage à court terme ou à long, respectivement.
- Taille-fractionner les échantillons à l'aide analyse SDS-PAGE. Visualisez les protéines avec de l'argent ou bleu de Coomassie R-250 (Fig. 3C). Seuls les fractions pures devraient être utilisés pour les étapes suivantes. Remarque: l'analyse par Western blot peut être utilisée pour confirmer l'identité de la protéine purifiée.
4. Dialyse et lyophilisation
- Dialyser les échantillons contre au moins 100 fois le volume de l'échantillon (utiliser de l'eau déminéralisée) pendant 2 jours. Changer la solution d'eau à tous les 6 heures pour éliminer tous les sels note:. La taille du poids moléculaire de coupure de la tubulure de dialyse dépend de la taille de la protéine de soie recombinant.
- Peser six tubes de 1,5 mL à centrifuger vides et enregistrer leurs masses. Il peut être utile pour percer des trous ou des fentes petites sur les bouchons des tubes avant de pesage pour lyophilisation pour faciliter la lyophilisation (figure 4A).
- After de dialyse, le transfert de 1 mL de l'échantillon dialysé dans chacun des 6 pré-pesée des tubes de centrifugeuse (figure 4B). Un gel à l'aide d'azote liquide et sécher les échantillons jusqu'à l'aide d'un lyophilisateur (figure 4C).
- Une fois sec, transférer un autre 1 mL de l'échantillon dialyse dans chacun des six tubes. Répétez jusqu'à ce que l'échantillon de dialyse a été entièrement séché dans les microtubes.
- Échantillons lyophilisés peuvent être stockés à -80 ° C pour le stockage à long terme.
5. Spinning Préparation Dope
- Peser chacun des microtubes contenant la poudre de protéine séchée. Soustraire la masse initiale des tubes vides pour obtenir la masse totale des protéines sèches. Remarque: Selon le rendement en protéines, vous devrez peut-être pour purifier du matériel supplémentaire pour le processus de filage.
- Calculer le volume de l'hexafluoroisopropanol (HFIP) à ajouter à chaque tube pour obtenir 200 mg / ml à 500 mg / ml, ou 20% à 50% en poids par volume. Ajouter l'appromangé quantité de HFIP dans chaque tube (Fig. 4D) Note:. HFIP est très volatile et toxique, une pipette soigneusement et hermétiquement le tube dès que possible. HFIP doivent être manipulés sous une hotte de sécurité.
- Parafilm les tubes et les placer sur une bascule pour solubiliser la protéine. Vortex et centrifuger occasionnellement pour faciliter la solubilisation. Cela peut prendre jusqu'à 2 jours.
6. Préparation des seringues et Appareil d'installation
- Charger au moins 25 pi de la dope de filage solubilisé dans la seringue. Assurez-vous qu'il n'y a pas de présenter comme des agrégats, il peut obstruer la seringue. Note: Cet échantillon est incroyablement visqueux, afin de prendre soin lors du pipetage.
- Poussez la dope à l'avant de la seringue verticalement, enlever toutes les bulles d'air (figure 5A). Note: Les bulles d'air créer des incohérences dans la fibre.
- Verrouiller la seringue à la pompe. Soulever un bécher de 400 ml remplie avec jusqu'à 95% d'isopropanol de sorte que la pointe de la seringueest tout rompre la surface de l'alcool (Fig. 5B).
- Réglez la pompe seringue à 15 ul / min et démarrer le programme. Autoriser la fibre tel que filé à siéger dans l'isopropanol pendant 20 minutes pour s'équilibrer complètement. Remarque: Ces fibres peuvent encore être utilisés par MS / MS pour confirmer l'identité des protéines dans les fibres.
7. Post-rotation Draw et de prélèvement des échantillons
- Appliquer un adhésif double face sur les deux côtés de la crête sur le dispositif d'enroulement. Dispositif de bobinage a été créé à partir de collage métallique peignes à un compas numérique (figure 6A). Attacher le dispositif de bobinage d'un moteur (fig. 6B). Nous recommandons le bobinage des fils à 2 tours par minute. Remarque: résultat plus rapide bobinage taux en grandes quantités de variation dans la qualité des fibres et la reproductibilité.
- En utilisant des pinces doucement attraper un bout de la fibre et tirez-le lentement de l'isopropanol, de l'attacher sur le bord de l'un des bras peigne sur la bobine (Fig. 6C). Les prochaines étapes devraient se faire sans un arrêt pour éviter que les fibres de se dessécher.
- Allumez le moteur et guidez la fibre sur la note d'enroulement périphérique:. Au cours de bobinage, ne permettent pas la fibre de doubler et d'empiler les uns sur les autres.
- Une fois l'ensemble de fibres est enroulé, la bobine détacher du moteur et appliquer de la colle sur le bord de chaque fibre de soie sur la bande à double face (fig. 6D). Cette attache la soie d'araignée sur le dispositif de note:. Par l'application de la colle sur la bande adhésive double face avant de post-rotation dessin, il empêche toute la fibre de glisser et permet sélective étirement des segments intérieurs des fibres dans l'étrier bras.
- Fixer la bobine à l'actionneur linéaire (fig. 7A). Noter la longueur initiale des fibres à l'aide de l'étrier Notez que ceci est la longueur interne de la fibre;. Il ne comprend pas la longueur collé et enveloppé arolide la bobine.
- Abaissez la bobine dans un bain d'isopropanol 75%. Permettre aux fibres à équilibrer pendant 10 minutes correspondance. Autres solutions de déshydratation peut être utilisé pour le processus de filage, tels que le sulfate de méthanol, d'acétone et d'ammonium.
- Régler la vitesse d'actionnement linéaire à 1,5 mm / sec. Sur la base de la longueur initiale, calculer la longueur finale pour le taux d'étirage après-spin désirée. La quantité étiré peut être commandé sur la base de la vitesse ou la longueur, en fonction de la mise en place. Par exemple, avec une longueur initiale de 15 mm et un rapport d'étirage souhaité post-spin de 3x, la longueur finale doit être de 45 mm. Cela peut également être calculé comme alimenter l'actionneur linéaire pendant 20 secondes à une vitesse de 1,5 mm / sec.
- Une fois le tirage au sort poste convoité essorage est terminé, soulevez lentement la bobine de l'isopropanol. Autoriser les gouttelettes de l'isopropanol à sécher pendant 1 minute, puis recueillir des échantillons (figure 7B). Les échantillons doivent être montés sur des châssis de papier cartonné ou papier pour tester purpose.
- Si d'autres ratios de poste de spin nul sont, abaisser l'arrière bobine dans le bain d'isopropanol 75%. Autoriser les fibres s'équilibrer pendant 10 minutes, puis passer à la poste taux d'étirage prochaine rotation.
8. Essai de traction
- Laisser les échantillons recueillis à s'équilibrer à l'environnement de laboratoire standard pour au moins 1 heure avant les essais mécaniques. L'humidité et la température doit être enregistrée comme ils peuvent affecter les propriétés mécaniques de la fibre. Etalon d'humidité et de température doit être d'environ 40% et 25 ° C, respectivement.
- Coller les bords de la feuille ou carton pour fixer la fibre sur le châssis. Prendre note de la taille de l'ouverture du cadre. Il s'agit de la longueur initiale de votre fibre testée. Un cadre ouvrant 1 pouce (25,4 mm) est présentée ici (figure 8A).
- Utilisation d'un microscope optique à un grossissement 100x ou supérieure, prendre des mesures de diamètre le long de l'axe longitudinal de la fibre.Au moins 3 mesures doivent être enregistrées. Plus le grossissement est utilisé et les mesures prises plus, meilleure est la précision.
- Fixer le cadre d'un cadre de chargement tensiomètre mécanique (figure 8B). Couper la trame des deux côtés de sorte que la tension est en cours d'exécution par le biais de la fibre. Tare du tensiomètre et de recueillir les données. Un taux de souche standard de 2% par seconde est recommandé.
- En utilisant les données recueillies et le diamètre moyen, une courbe contrainte-déformation peuvent être tracées.
- La rupture de fibre peuvent désormais être monté sur un microscope électronique à balayage (MEB) stub pour des analyses morphologiques et les mesures de diamètre Point Break. Le segment de fibre à partir du point rupture peut être utilisée pour estimer et contrôler le diamètre initial mesurée par le microscope optique.
9. Les résultats représentatifs
De l'étape 3, les différentes fractions doivent être analysés par analyse SDS-PAGE et les protéines visualisées avec de l'argentou Bleu de Coomassie R-250. De quelques conditions normales colonne Ni-NTA, fractions d'élution avec une pureté> 90% peut être obtenue (Fig. 9). Les petites protéines contaminantes peut encore être éliminé par dialyse extensive. Utilisation 25 pl de solution de filage à 20% (p / v), au moins 30 échantillons de fibres séparées peuvent être collectées à partir de la fibre continue enroulée sur la bobine (assume une longueur initiale de 13 mm est utilisée). Les propriétés mécaniques peuvent être analysées par des tests tensiomètre (Fig. 10). En fonction de la protéine de soie recombinant utilisé pour le processus de filage, les rapports maximaux poste de spin d'étirage devra être déterminée empiriquement. En général, poster de spin des rapports d'étirage de 4.0x peut être atteint sans défaillance de fibre (Fig. 10). Fibres filées, avant ou après le match nul de spin après, peuvent être analysées avec un microscope électronique à balayage pour visualiser l'ultrastructure (Fig. 11A, B). Fibres filées peut également être utilisé pour les essais mécaniques, l'affichage des résultatsque, avec une faible variation au sein d'un groupe post rotation de prélèvement d'échantillons rapport (Fig. 10).
Figure 1. Expression de la soie d'araignée d'ADNc dans des bactéries. A) Le pBAD TOPO / Thio vecteur contenant la soie d'araignée ADNc d'intérêt se transforme en compétence E. des cellules de E.. B) Une seule colonie est inoculé dans 200 ml de LB et a grandi à la saturation du jour au lendemain. Après inoculation, 800 ml de LB frais est ajouté et la culture est induite pour l'expression en utilisant arabinose. C) À la fin de l'induction, la culture est culotté par centrifugation. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. La lyse des cellules bactériennes après l'induction des protéines de soie d'araignée. A) Vingt millilitres de 1x lyse et le tampon DNase est ajouté au culot cellulaire et placé sur un agitateur orbital et soniquées pour lyser les cellules. B) Le lysat cellulaire est centrifugé dans une centrifugeuse pour effacer le surnageant de débris cellulaires, et le surnageant est recueilli. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. Purification de protéines recombinantes de soie d'araignée en utilisant la chromatographie d'affinité. A) Le lysat cellulaire surnageant et Ni-NTA billes sont ajoutées à une colonne de chromatographie et incubées pendant 1 heure. B) Après le flux continu est collecté, 20 ml de tampon de lavage et 20 ml de tampon d'élution sont utilisés dans l'ordre et recueilli dans des fractions de 5 ml. C) les fractions sont analysées par SDS-PAGE; les échantillons purs contenant la protéine cible sont transférées à une poche de dialyse et dialyse contre de l'eau DI àd'achèvement. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Préparation de la protéine purifiée de soie d'araignée pour extrusion par voie humide. A) Le produit dialysée est transféré dans des tubes à centrifuger pré-pesées en aliquotes de 1 mL. B) Les aliquotes de 1 mL sont surgelés avec de l'azote liquide. C) Les échantillons congelés sont lyophilisés et échantillon plus dialyse est ajouté. D) de masse séchée est calculé et HFIP est ajouté à la poudre sèche pour produire un dopant de 20% (p / v) de filature. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Chargement de la solution de filage dans la seringue en verre pour wet-spinning. A) Tout en maintenant le SYRINge verticalement, la solution de filage est poussé vers le haut de la colonne de seringue, éliminer les bulles d'air. B) charger la seringue est fixé à la pompe à seringue et descendu dans le bain de 95% d'isopropanol sorte que la pointe est de rupture de la surface du bain.
Figure 6. Enrouleurs des fibres synthétiques de soie d'araignée sur un dispositif personnalisé de bobinage. A) Le dispositif de bobinage est construit à partir d'un étrier numérique avec joint métallique peignes. Ruban adhésif double face est appliqué sur les deux côtés du peigne pour fixer les extrémités de fibres. B) La bobine est fixée au moteur à vitesse lente en utilisant une pince crocodile. C) La fibre est lentement tiré du bain d'alcool et enroulé autour de la bobine. D) la colle est appliquée sur le bord de chaque segment de fibre pour maintenir en place les. Affichés sont deux fibres filées à partir de différentes protéines différentes.
Figure 7. Post-rotation établit des fibres synthétiques en utilisant un appareil de maison. A) Le dispositif de bobinage est attaché à la configuration actionneur linéaire à l'aide des pinces crocodiles. B) Après une étape de pioche après essorage, la bobine est retiré de la salle de bain. Gouttelettes d'isopropanol sont autorisés à s'évaporer avant de collecte des fibres.
Figure 8. De montage des fibres de soie synthétique sur un carton pour les études mécaniques. A) fibres recueillies sont montés sur des châssis de papier cartonné avec un 1 "x 1" découpe. Les fibres sont initialement maintenu en place avec du ruban adhésif double face, puis fixé avec de la colle. B) Le cadre carton est fixé sur un dynamomètre. Les côtés sont ensuite découpés de sorte que la tension ne fonctionne que si la fibre.
Figure 9. Taille de fractionnement du recombinant purifié protei MASP1n fractions en utilisant analyse SDS-PAGE suivie de la visualisation avec coloration à l'argent. Échelle des protéines est représenté en kDa. Les deux échantillons de lavage démontrer la non-liaison spécifique à des perles, tandis que les échantillons d'élution montrent la nécessité pour les 6 collections pour assurer la récupération des protéines totales.
Courbes Figure 10. Contrainte-déformation des fibres filées à partir recombinantes TuSp1 protéines. 8 couleurs montrent les fibres qui ont été soumises à différents ratios de poste de spin nul, allant de 2,5 x à 6x. Fibres présentent une variation faible dans leur groupe rapport; que poste tirage rapports augmentation de spin, la force de la fibre est augmenté, tandis que l'extensibilité est diminué.
Figure 11. Numérisation d'images de microscopie électronique de fibres filées à partir recombinantes TuSp1 protéines. A) Au grossissement 500x, l'externe lissela surface peut être vu. B) Au 5000x, le noyau intérieur dense peut être observée à partir d'une pause naturelle de fibres.
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Discussion
Les fibres synthétiques filées à partir de cette méthodologie sont mécaniquement sur le même ordre de grandeur par rapport aux fibres naturelles. En diminuant la quantité d'erreur humaine en mécanisant le bobinage et les processus post-tirage de spin, la variation expérimentale entre les échantillons sont plus contrôlée et fortement réduit.
Notre méthodologie offre la possibilité d'enquêter sur les propriétés mécaniques des fibres d'autres qui sont filés à partir de protéines recombinantes codées par les ADNc des autres membres de famille de gènes d'araignée. Potentiellement, il pourrait déterminer le rôle mécanique de modules de protéines différentes dans un fibroïne, ou entre les types de fibroïne de différentes 23. Il permet également de tester les fibres de soie que les composites, comme plus d'une protéine de soie ou d'autres molécules peuvent être combinés ou ajoutés et filé en mélange protéique.
Cette méthodologie de filage est une plate-forme pour d'autres laboratoires d'étendre facilement sur, comme l'APPAratuses peuvent être construits d'une manière facile. Cela permet également d'ajuster les paramètres le long de chaque étape afin d'optimiser ou personnaliser la conception de fibres spécifiques avec des propriétés mécaniques uniques. Comme la nécessité pour les biomatériaux verts pour les augmentations futures, cette méthodologie peut être adaptée pour produire des fibres qui servent une multitude d'applications de prochaine génération.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la NSF Subventions RUI MCB-0950372 et 1105310 DMR-droit "Caractérisation moléculaire de Black Widow Soies d'araignée et le comportement mécanique des Soies d'araignée colle», respectivement.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
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