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Bioengineering

एक प्रयोगशाला पैमाने पर सिंथेटिक स्पाइडर सिल्क उत्पादन

Published: July 18, 2012 doi: 10.3791/4191
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Pacific

Summary

मकड़ी रेशम की बकाया यांत्रिक और जैव रासायनिक गुणों के बावजूद, इस सामग्री बड़ी मात्रा में पारंपरिक तरीकों से नहीं काटा जा सकता है. यहाँ हम एक कुशल कृत्रिम मकड़ी सिल्क फाइबर, जो जांचकर्ताओं के लिए मकड़ी सिल्क उत्पादन और अगली पीढ़ी के biomaterials के रूप में उनके उपयोग का अध्ययन एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है स्पिन रणनीति का वर्णन.

Abstract

के रूप में समाज की प्रगति और संसाधनों scarcer हो जाते हैं, यह तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है नई प्रौद्योगिकियों को विकसित कि इंजीनियर उच्च प्रदर्शन गुण के साथ अगली पीढ़ी, biomaterials. इन नई संरचनात्मक सामग्री का विकास तेजी से, लागत प्रभावी हो सकता है और प्रसंस्करण के तरीके और उत्पादों है कि पर्यावरण के अनुकूल हैं और टिकाऊ को शामिल करना चाहिए. मकड़े विभिन्न यांत्रिक गुणों के साथ अलग अलग फाइबर प्रकार के एक भीड़ स्पिन, कि प्रतिद्वंद्वी सर्वोत्तम मानव निर्मित और प्राकृतिक सामग्री biomimicry के लिए अगली पीढ़ी के इंजीनियरिंग सामग्रियों की एक समृद्ध स्रोत की पेशकश की. प्राकृतिक मकड़ी रेशम की एक बड़ी मात्रा के संग्रह के बाद से अव्यावहारिक है, कृत्रिम रेशम उत्पादन धागे के एक असीमित की आपूर्ति करने के लिए उपयोग के साथ वैज्ञानिकों को प्रदान करने की क्षमता है. इसलिए, यदि कताई प्रक्रिया को सुव्यवस्थित और सिद्ध हो सकते हैं, कृत्रिम मकड़ी फाइबर शरीर कवच से लेकर आवेदन की एक व्यापक रेंज, शल्य सीवन के लिए क्षमता का उपयोगरस्सियों, और केबल, टायर, संगीत वाद्ययंत्र के लिए तार, और विमानन और एयरोस्पेस प्रौद्योगिकी के लिए कंपोजिट. क्रम में कृत्रिम रेशम उत्पादन प्रक्रिया अग्रिम करने के लिए और फाइबर है कि उनकी सामग्री के गुण में स्पिन स्पिन से कम विचरण प्रदर्शित उपज है, हम एक गीला कताई प्रोटोकॉल है कि बैक्टीरिया, शुद्धि, और प्रोटीन की एकाग्रता में पुनः संयोजक मकड़ी सिल्क प्रोटीन की अभिव्यक्ति को एकीकृत विकसित फाइबर बाहर निकालना और एक यांत्रिक उपचार के बाद स्पिन के द्वारा पीछा किया. यह पहला दृश्य प्रतिनिधित्व है कि एक कदम दर कदम प्रक्रिया से पता चलता है स्पिन करने के लिए और एक प्रयोगशाला पैमाने पर कृत्रिम रेशम के तंतुओं का विश्लेषण है. यह भी जानकारी प्रदान करता है ही कताई डोप से फाइबर काता के बीच परिवर्तनशीलता की शुरूआत कम से कम. सामूहिक, इन तरीकों कृत्रिम रेशम उत्पादन की प्रक्रिया में वृद्धि, उच्च गुणवत्ता फाइबर कि प्राकृतिक मकड़ी रेशम पार करने के लिए अग्रणी.

Introduction

मकड़ी सिल्क असाधारण यांत्रिक गुणों उच्च खिंचनेवाला इस्पात, केवलर और नायलॉन सहित कि बाहर कई मानव निर्मित सामग्री करता है, मकड़े 1. कम से कम 6-7 अलग फाइबर प्रकार है कि विविध यांत्रिक गुण प्रदर्शित करते हैं, तन्य शक्ति और तानाना की मात्रा बदलती के साथ बनाया गया प्रत्येक स्पिन विशिष्ट जैविक कार्य करते हैं. 2 रिसर्च के वैज्ञानिकों को उनके उत्कृष्ट यांत्रिक गुणों, उनके biocompatibility के, और उनके गैर विषैले और हरे रंग सामग्री प्रकृति की वजह से अगली पीढ़ी biomaterials के रूप में मकड़ी रेशम का उपयोग तेजी से पीछा कर रहे हैं 3,4. नरभक्षी की वजह से और अरचिन्ड का विषैला प्रकृति, मकड़ी रेशम की खेती के माध्यम से कटाई औद्योगिक पैमाने निर्माण के लिए आवश्यक मांगों को पूरा करने के लिए एक व्यावहारिक रणनीति नहीं है. इसलिए, वैज्ञानिकों ने इन विट्रो में के साथ मिलकर से सिंथेटिक फाइबर की कताई ट्रांसजेनिक जीवों में पुनः संयोजक सिल्क प्रोटीन के उत्पादन के लिए बदल गया हैसे शुट्ठ प्रोटीन. के 5-8 पूर्ण लंबाई पुनः संयोजक मकड़ी सिल्क प्रोटीन अभिव्यक्ति तकनीकी रूप से कठिन उनके जीन दृश्यों के आंतरिक गुणों, जो उनके अत्यधिक दोहरावदार प्रकृति और शारीरिक लंबाई (> 15 केबी) जीसी अमीर सामग्री दिया गया है और पक्षपाती alanine और ग्लाइसिन codon उपयोग. 9-11 तिथि करने के लिए, सबसे प्रयोगशालाओं प्रमुख ampullate रेशम प्रोटीन MaSp1 या MaSp2 की आंशिक सीडीएनए दृश्यों या सिंथेटिक जीन का उपयोग कर के संक्षिप्त रूपों को व्यक्त करने पर ध्यान केंद्रित किया है 12-15 स्पिनिंग सिंथेटिक मकड़ी रेशम की आवश्यकता है कि एक चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है पूरी तरह से और कई वैज्ञानिक विषयों, और कताई प्रक्रिया की जटिलताओं में महारत ज्ञान नहीं है वीडियो प्रतिनिधित्व द्वारा आम जनता को पता चला. वास्तव में, दुनिया भर में प्रयोगशालाओं में से केवल एक मुट्ठी मकड़ी रेशम cDNAs को व्यक्त करने के लिए, शुद्ध रेशम प्रोटीन, सिंथेटिक फाइबर स्पिन और प्रदर्शन के बाद स्पिन आकर्षित विशेषज्ञता है, और फिर अंत में उनके biomaterial के गुण परीक्षण 8.16,17 कताई सिंथेटिक फाइबर के लिए अलग दृष्टिकोण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गीला और सूखी कताई electrospinning तरीकों घेर लिया है 16,18,19 सभी प्रक्रियाओं आम में एक लक्ष्य है - एक प्रोटोकॉल है कि यांत्रिक गुणों के साथ सिंथेटिक मकड़ी रेशम उत्पादन के विकास कि प्रतिद्वंद्वी प्राकृतिक धागे बड़े पैमाने पर व्यावसायिक निर्माण की प्रक्रिया के लिए.

यहाँ हम एक प्रयोगशाला पैमाने पर कृत्रिम मकड़ी रेशम गीला कताई एक पद्धति का उपयोग करते हुए उत्पन्न करने की प्रक्रिया का वर्णन. अन्य कताई तरीकों के सापेक्ष, गीला कताई फाइबर विश्लेषण के लिए सबसे संगत परिणाम का उत्पादन किया गया है. हम बैक्टीरिया में पुनः संयोजक रेशम प्रोटीन, उनके शोधन के बाद की अभिव्यक्ति के साथ इस प्रक्रिया की शुरुआत रूपरेखा, और फिर एक ड्रॉ के बाद स्पिन पद्धति "के रूप में काता है कि फाइबर के साथ धागे पैदावार के लिए लागू सहित कताई, प्रोटीन तैयारी के लिए चरणों का वर्णन सामग्री गुण है कि प्राकृतिक मकड़ी रेशम की गुणवत्ता के दृष्टिकोण. हमारे methodology को बारीकी से प्राकृतिक रेशम के तंतुओं की कताई प्रक्रिया की नकल बनाया गया है और यह वास्तुकला और गोला - सिल और मकड़ियों बुनाई. इसके अलावा 20-22 से रेशम उत्पादन ग्रंथियों के समारोह के बारे में हमारी विशेषज्ञता पर भारी ड्रॉ, हम आवश्यक के साथ समाप्त सिंथेटिक फाइबर का उपयोग करने के लिए एक तनाव तनाव घटता है, जो जांचकर्ताओं को परम शक्ति, परम तनाव, और फाइबर की बेरहमी गणना करने की अनुमति साजिश tensometer की सामग्री गुण निर्धारित करने के लिए कदम. अंत में, लेकिन महत्वपूर्ण मूल्य के, कताई, स्पूलन, और ड्राइंग apparatuses हो सकता है विस्तृत और महंगा अनुकूलित उपकरणों की खरीद के बजाय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध भागों का उपयोग कर घर बनाया.

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Protocol

11 चित्रा
ग्राफ़िकल अवलोकन: स्पिनिंग प्रक्रिया की Biomimicry

प्राकृतिक मकड़ी रेशम उत्पादन मार्ग की biomimicry: कृत्रिम रेशम निर्माण का मार्ग इस छवि स्वर्ण गोला बुनकर, Nephila clavipes, और प्राकृतिक रेशम उत्पादन (सफेद पाठ) के लिए उपयोग घटकों के से प्रमुख ampullate के ग्रंथि से पता चलता है. पूंछ क्षेत्र सिल्क प्रोटीन कि कलसा, कताई डोप के लिए एक भंडारण क्षेत्र के लिए ले जाया जाता है की बड़ी मात्रा में synthesizes. यह केंद्रित डोप कताई वाहिनी जहां समाधान आयन एक्सचेंज और निर्जलीकरण फाइबर बाहर निकालना पहले अनुभव के माध्यम से extruded है. biomimetic हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता प्रक्रियाओं लाल पाठ से संकेत कर रहे हैं. पुनः संयोजक रेशम उत्पादन के ट्रांसजेनिक बैक्टीरिया, प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर शुद्धि के बाद का उपयोग करते हुए उत्पन्न होता है. अगले, शुद्ध प्रोटीन उप हैlyophilization के लिए परियोजना के लिए सामग्री ध्यान केंद्रित. अन्त में, प्रोटीन HFIP में फिर से भंग और एक isopropanol स्नान में एक सिरिंज सुई से extruded.

1. प्लाज्मिड निर्माण और बैक्टीरियल सेल संस्कृति तैयार

  1. पीसीआर प्रदर्शन करना वांछित मकड़ी रेशम सीडीएनए और विशिष्ट प्राइमर सेट का उपयोग कर. जेल से निकालने और एक prokaryotic अभिव्यक्ति वेक्टर जैसे ThioFusion / pBAD Topo (छवि 1 ए) में परिलक्षित सीडीएनए कटी घमनी को बांधना. यह वेक्टर thioredoxin एन टर्मिनल टैग रेशम प्रोटीन solubilization और एक सी टर्मिनल प्रोटीन शुद्धीकरण के लिए अपने टैग 6x की सुविधा है. सक्षम ई. में बदलना बंधाव उत्पादों कोलाई कोशिकाओं.
  2. कालोनियों का चयन करें कि पुनः संयोजक क्लोनिंग वेक्टर होते हैं और एक कॉलोनी का उपयोग करने के लिए बाँझ लेग एम्पीसिलीन (छवि 1 बी) के साथ पूरक की 200 एमएल का टीका लगाना. एक कक्षीय इनक्यूबेटर में 200 rpm पर झटकों से 37 पर इस संतृप्ति के लिए रातोंरात संस्कृति विकसित करने डिग्री सेल्सियस
  3. Saturat की 200 एमएल का मिश्रणताजा लेग संस्कृति की 800 एमएल के साथ एड संस्कृति. 4 घंटे के लिए 0.2% arabinose (w / v) जोड़कर मकड़ी सिल्क प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रेरित. एंटीबायोटिक चयन के तहत संस्कृति रखने के लिए सुनिश्चित करें.
  4. गोली 4 डिग्री सेल्सियस (छवि 1C) पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG कोशिकाओं. सादगी के लिए, गोली एक कंटेनर में पूरी मात्रा. एकाधिक centrifugation कदम centrifugation ट्यूब की मात्रा क्षमता के आधार पर आवश्यक हो सकता है. यदि आवश्यक हो, पसाना कताई और फिर गोली अतिरिक्त सामग्री के लिए पूरे सेल गोली एक कंटेनर में है सुनिश्चित करने के बाद तरल मात्रा. सेल छर्रों -80 में संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस तक की जरूरत है.
  5. खर्च संस्कृति मीडिया के निपटान से पहले, ब्लीच जोड़ने या बाँझ आटोक्लेव.

2. सेल

  1. 1 एल सेल गोली 1x lysis बफर (2A छवि) के 20 एमएल जोड़ें. के गोली सेल पूरी तरह से resuspend सुनिश्चित करें.
  2. 1 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए lysozyme जोड़ने के लिए आगे बढ़ावा देने केसेल. DNase भी इस कदम पर गुणसूत्र डीएनए को पचाने में मदद के लिए समाधान की चिपचिपाहट को कम करने के लिए जोड़ा जा सकता है. एक कक्षीय हिलनेवाला पर नमूना प्लेस और धीरे 20 मिनट के लिए रॉक.
  3. 1 मिनट के लिए अधिकतम पर समाधान Sonicate.
  4. 10 मिनट के लिए 4 बजे समाधान, 16,000 XG अपकेंद्रित्र स्पष्ट डिग्री सेल्सियस (छवि 2B).

3. प्रोटीन शुद्धीकरण: नी NTA आत्मीयता कॉलम क्रोमैटोग्राफी

  1. सतह पर तैरनेवाला निकालें और यह एक 25 एमएल क्रोमैटोग्राफी स्तंभ साफ में स्थानांतरित. सुनिश्चित करें कि सतह पर तैरनेवाला गैर चिपचिपा और स्पष्ट है. यदि समाधान चिपचिपा और बादल है, और DNase या sonicate और / या फिर गोली सतह पर तैरनेवाला (दोहराने 2.3-2.4 कदम).
  2. स्तंभ में नी - NTA घोल (0.5 एमएल मोती) 1 एमएल जोड़ें. कसकर टोपी और पानी निकलने की टोंटी सुरक्षित, और तब घुमाव पर सेट करने के लिए 1 घंटे के लिए संतुलित करना उसकी टैग 6x की नी NTA मोती (छवि 3A) के लिए बाध्य की अनुमति है.
  3. स्तंभ पर सीधे सेटखड़े और नी NTA मोती लगभग 2 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. एक हल्के नीले रंग की परत के नीचे पर देखा जा सकता है जब मोती पूरी तरह से बसे हुए हैं.
  4. टोपी निकालें और समाधान पानी निकलने की टोंटी के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. आगे के विश्लेषण (3B छवि) के लिए इस समाधान लीजिए.
  5. 1x धो बफर के 20 एमएल जोड़ें और मोती को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. पानी निकलने की टोंटी खोलें और समाधान के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. चार आगे के विश्लेषण के लिए 5 एमएल aliquots में इस समाधान लीजिए नोट: अतिरिक्त धोने संस्करणों contaminating के प्रोटीन को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, तथापि, वहाँ अंतिम प्रोटीन उपज में कमी की संभावना है.
  6. 1x क्षालन बफर के 20 एमएल जोड़ें और राल व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं. पानी निकलने की टोंटी खोलें और समाधान के माध्यम से प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं. आगे के विश्लेषण के लिए चार 5 एमएल aliquots में नोट: इस समाधान को ले लीजिए. अतिरिक्त क्षालन मात्रा नी NTA राल से एकत्र किया जा सकता है अगर क्षालन नहीं पूरा हो गया है.
  7. नमूने 4 में संग्रहीत किया जा सकता हैडिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस कम या लंबी अवधि के भंडारण, क्रमशः के लिए.
  8. आकार - fractionate एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण का उपयोग कर नमूने. चांदी या Coomassie खूब R-250 ब्लू (छवि -3 सी) के साथ प्रोटीन कल्पना. केवल शुद्ध भिन्न निम्न चरणों का पालन के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए नोट: पश्चिमी धब्बा विश्लेषण शुद्ध प्रोटीन की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

4. डायलिसिस और lyophilization

  1. 2 दिनों के लिए कम से कम 100x नमूना मात्रा (विआयनीकृत पानी का उपयोग करें) के खिलाफ नमूने Dialyze. पानी के घोल सभी लवण को दूर करने के लिए हर 6 घंटे बदलें नोट: डायलिसिस टयूबिंग की आणविक वजन, आकार में कटौती बंद पुनः संयोजक सिल्क प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है.
  2. छह 1.5 एमएल खाली microfuge ट्यूब वजन और जनता उनके रिकॉर्ड. यह पंचर छोटे छेद या slits के पूर्व फ्रीज के लिए वजन करने के लिए lyophilization की सुविधा (4A छवि) सुखाने के लिए ट्यूबों के टोपियां पर उपयोगी हो सकता है.
  3. वायु सेनाआतंकवाद डायलिसिस, हस्तांतरण 6 पूर्व से तौला microfuge ट्यूबों (4B छवि) में से प्रत्येक में 1 dialyzed नमूने के एमएल. फ़्लैश तरल नाइट्रोजन का उपयोग करते हुए स्थिर और एक फ्रीज ड्रायर (छवि 4C) का उपयोग कर नीचे नमूने सूखी.
  4. एक बार सूखा, छह ट्यूबों के प्रत्येक में डायलिसिस नमूना के एक और 1 एमएल हस्तांतरण. दोहराएँ जब तक पूरे डायलिसिस नमूना microfuge ट्यूबों में किया गया है सूखे.
  5. -80 डिग्री दीर्घकालिक भंडारण के लिए सी रुक सूखे नमूने संग्रहीत किया जा सकता है.

5. कताई डोप तैयारी

  1. Microfuge सूखे प्रोटीन पाउडर युक्त ट्यूब के प्रत्येक वजन. खाली ट्यूबों के प्रारंभिक जन घटाना कुल शुष्क प्रोटीन जन प्राप्त करें: प्रोटीन उपज पर निर्भर करता है, तुम कताई प्रक्रिया के लिए अतिरिक्त सामग्री को शुद्ध करने की आवश्यकता हो सकती है.
  2. (HFIP) Hexafluoroisopropanol की मात्रा की गणना के लिए प्रत्येक ट्यूब को जोड़ने के लिए 200 मिलीग्राम / एमएल के लिए 500 मिलीग्राम / एमएल, या 20% से 50% मात्रा प्रति वजन प्राप्त. उपयुक्त जोड़ेंप्रत्येक ट्यूब (छवि 4D) में HFIP की राशि खाया नोट: अत्यधिक अस्थिर और विषाक्त HFIP है, पिपेट ध्यान से और जितनी जल्दी हो सके ट्यूब टोपी. HFIP एक सुरक्षा हुड के नीचे नियंत्रित किया जाना चाहिए.
  3. ट्यूब और एक घुमाव पर जगह Parafilm प्रोटीन solubilize. भंवर और अपकेंद्रित्र कभी कभी solubilization की सुविधा के लिए. यह 2 दिन तक लग सकते हैं.

6. सिरिंज तैयारी और सेटअप उपकरण

  1. सिरिंज में solubilized कताई डोप के कम से कम 25 μL लोड. यकीन है कि वहाँ कोई समुच्चय के रूप में यह सिरिंज रोकना कर सकते हैं वर्तमान नोट: यह नमूना अविश्वसनीय रूप से चिपचिपा है, तो ध्यान रखना जब pipetting.
  2. सिरिंज के सामने खड़ी डोप धक्का, सभी हवाई बुलबुले (छवि 5A) को हटाने नोट: वायु बुलबुले फाइबर में विसंगतियों बनाएँ.
  3. सिरिंज पंप करने के लिए लॉक. एक 400 एमएल 95% isopropanol ऊपर से भरा बीकर उठाएँ तो सिरिंज की नोकसिर्फ शराब की सतह (छवि 5 ब) को तोड़ने.
  4. 15 / μL मिनट सिरिंज पंप सेट और कार्यक्रम शुरू. के रूप में काता isopropanol में 20 मिनट के लिए बैठ फाइबर पूरी तरह से नोट संतुलित करना करने के लिए अनुमति दें: इन तंतुओं अभी भी एमएस / एमएस विश्लेषण से फाइबर में प्रोटीन की पहचान की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

7. स्पिन के बाद ड्रा और नमूना संग्रह

  1. डबल पक्षीय टेप स्पूलन डिवाइस पर कंघी की दोनों पक्षों के लिए लागू करें. स्पूलन युक्ति gluing धातु कंघी से डिजिटल कैलिपर (6A छवि) बनाया गया था. एक मोटर स्पूलन युक्ति संलग्न छवि 6B. हम 2 rpm पर धागे स्पूलन करें नोट: तेजी से बदलाव की एक बड़ी मात्रा में फाइबर गुणवत्ता और reproducibility में स्पूलन दरों परिणाम.
  2. संदंश का प्रयोग धीरे फाइबर के एक छोर ले लो और धीरे धीरे इसे बाहर खींच isopropanol की, यह स्पूल पर कंघी हथियार के किनारे करने के लिए संलग्न (अंजीर. 6C). अगले कुछ कदम बाहर सुखाने से फाइबर को रोकने के ठहराव के बिना किया जाना चाहिए.
  3. मोटर पर बारी और धीरे डिवाइस स्पूलन नोट पर फाइबर गाइड स्पूलन के दौरान, फाइबर को दोगुना करने के लिए और एक दूसरे के शीर्ष पर ढेर की अनुमति नहीं देते.
  4. एक बार पूरे फाइबर spooled है, मोटर से अलग स्पूल और डबल पक्षीय टेप पर प्रत्येक रेशम फाइबर की बढ़त (6D छवि) गोंद लागू होते हैं. इस तंत्र पर मकड़ी रेशम fastens नोट: डबल पक्षीय टेप करने के लिए गोंद बाद स्पिन ड्राइंग के पूर्व लागू करने से, यह फिसल से पूरे फाइबर रोकता है और नली का व्यास के भीतर फाइबर के आंतरिक क्षेत्रों के चयनात्मक खींच लिए अनुमति देता है हथियार.
  5. रैखिक actuator (छवि 7A) स्पूल संलग्न. कैलीपर का उपयोग कर फाइबर के प्रारंभिक लंबाई रिकार्ड ध्यान दें कि इस फाइबर की आंतरिक लंबाई है, सरेस से जोड़ा हुआ लंबाई शामिल नहीं की गिरफ्तारी लिपटेस्पूल ound.
  6. स्पूल एक 75% isopropanol स्नान में कम है. फाइबर 10 नोट मिनट के लिए संतुलित करना करने के लिए अनुमति दें: अन्य Dehydrating की समाधान प्रक्रिया के लिए कताई मेथनॉल, एसीटोन, और अमोनियम सल्फेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
  7. 1.5 मिमी / सेकंड के लिए रैखिक actuator गति सेट. प्रारंभिक लंबाई के आधार पर वांछित ड्रॉ के बाद स्पिन अनुपात के लिए अंतिम लंबाई की गणना. राशि बढ़ाकर गति या लंबाई के आधार पर नियंत्रित किया जा सकता है, सेट अप के आधार पर. उदाहरण के लिए, 15 मिमी और एक वांछित के बाद स्पिन 3x आकर्षित अनुपात के एक प्रारंभिक लंबाई के साथ, अंतिम लंबाई 45 मिमी होना चाहिए. यह भी 1.5 मिमी / सेकंड की दर पर 20 सेकंड के लिए रैखिक actuator शक्ति के रूप में परिकलित किया जा सकता है.
  8. एक बार वांछित पोस्ट स्पिन आकर्षित पूरा हो गया है, धीरे धीरे स्पूल isopropanol से बाहर उठाना. Isopropanol की बूंदों 1 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति है, और तब (छवि 7B) नमूने इकट्ठा. नमूने पुर परीक्षण के लिए cardstock या पन्नी फ्रेम पर रखा जाना चाहिएबन गया है.
  9. यदि आगे के बाद स्पिन आकर्षित अनुपात वांछित हैं, 75% isopropanol स्नान में स्पूल वापस कम. अनुमति 10 मिनट के लिए फाइबर संतुलित करना, और फिर अगले पोस्ट स्पिन आकर्षित अनुपात करने के लिए आगे बढ़ना.

8. खिंचनेवाला परीक्षण

  1. नमूने एकत्र यांत्रिक परीक्षण से पहले कम से कम 1 घंटे के लिए मानक प्रयोगशाला वातावरण को संतुलित करना करने के लिए अनुमति देते हैं. नमी और तापमान के रूप में वे फाइबर के यांत्रिक गुणों को प्रभावित कर सकते हैं दर्ज किया जाना चाहिए. मानक नमी और तापमान की स्थिति लगभग 40% और 25 ° सेल्सियस होना चाहिए, क्रमशः.
  2. गोंद cardstock या पन्नी के किनारों को सुरक्षित करने के लिए फ्रेम पर फाइबर. फ्रेम के उद्घाटन के आकार को ध्यान में रखना. यह अपने परीक्षण फाइबर के प्रारंभिक लंबाई है. एक 1 इंच (25.4 मिमी) खोलने फ्रेम यहाँ दिखाया गया है (छवि 8A).
  3. 100x या अधिक से अधिक बढ़ाई के साथ एक प्रकाश सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, फाइबर अक्ष के साथ अनुदैर्ध्य व्यास माप ले.कम से कम 3 माप दर्ज किया जाना चाहिए. उच्च बढ़ाई इस्तेमाल किया और अधिक माप, बेहतर सटीकता लिया.
  4. एक tensometer यांत्रिक लोड हो रहा है फ्रेम (छवि 8B) फ्रेम सुरक्षित. दोनों पक्षों पर फ्रेम में कटौती तो तनाव केवल फाइबर के माध्यम से चल रहा है. धड़ा tensometer और डेटा इकट्ठा. प्रति सेकंड 2% की एक मानक तनाव दर की सिफारिश की है.
  5. एकत्र डेटा और औसत व्यास का प्रयोग, एक तनाव तनाव वक्र साजिश रची जा सकता है.
  6. अब टूटी हुई फाइबर एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन रूपात्मक विश्लेषण और तोड़ने बिंदु व्यास मापन के लिए माइक्रोस्कोप (SEM) ठूंठ पर घुड़सवार किया जा सकता है. फाइबर को तोड़ने बिंदु से दूर खंड का अनुमान है और प्रारंभिक प्रकाश माइक्रोस्कोप से मापा व्यास की जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

9. प्रतिनिधि परिणाम

चरण 3 से, भिन्न भिन्न एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जाना चाहिए और प्रोटीन चांदी के साथ कल्पनाया Coomassie खूब ब्लू R-250. एक मानक नी NTA स्तंभ स्थितियों से,> 90% शुद्धता के साथ क्षालन भिन्न छवि (9) प्राप्त किया जा सकता है. लघु contaminating के प्रोटीन आगे व्यापक डायलिसिस से हटाया जा सकता है. 20% (w / वी) में डोप कताई की 25 μL का प्रयोग, कम से कम 30 अलग फाइबर नमूने स्पूल (13 मिमी की एक प्रारंभिक लंबाई प्रयोग किया जाता है) पर निरंतर घाव फाइबर से एकत्र किया जा सकता है. यांत्रिक गुणों tensometer परीक्षण छवि (10) के द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है. पुनः संयोजक रेशम कताई प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन पर निर्भर करता है, अधिकतम के बाद स्पिन आकर्षित अनुपात empirically का निर्धारित किया जा आवश्यकता होगी. सामान्य में पोस्ट, स्पिन 4.0x के अनुपात को आकर्षित फाइबर विफलता छवि (10) के बिना हासिल किया जा सकता है. काता फाइबर, पोस्ट स्पिन ड्रा के पहले या बाद में, एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (फैटी कल्पना 11A छवि, बी) के साथ विश्लेषण किया जा सकता है. काता फाइबर भी यांत्रिक परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, परिणाम प्रदर्शितकि एक के बाद स्पिन आकर्षित अनुपात नमूना समूह के भीतर कम परिवर्तन छवि (10) के साथ.

चित्रा 1
चित्रा 1 बैक्टीरिया में मकड़ी सीडीएनए रेशम की अभिव्यक्ति. ए) pBAD / Topo ग्रीक थियोन (गंथक) का समास मे प्रयुक्त रूप मकड़ी रेशम ब्याज की सीडीएनए युक्त वेक्टर सक्षम ई. में तब्दील हो जाता है कोलाई कोशिकाओं. बी) एक एकल कॉलोनी लेग के 200 एमएल में टीका है और संतृप्ति के लिए रात में बड़े हो. टीका के बाद, ताजा पौंड की 800 एमएल और संस्कृति arabinose का उपयोग कर अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित किया है. सी) प्रेरण के समापन पर, इस संस्कृति centrifugation द्वारा pelleted है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2 मकड़ी सिल्क प्रोटीन अधिष्ठापन के बाद बैक्टीरियल कोशिकाओं के lysis. ए) बीस milliliसेल गोली 1x lysis बफर और DNase का मंत्रियों जोड़ा जाता है और एक कक्षीय हिलनेवाला पर रखा और कोशिकाओं को lyse sonicated. बी) सेल lysate एक अपकेंद्रित्र में घूमती है सेलुलर मलबे की सतह पर तैरनेवाला साफ, और सतह पर तैरनेवाला एकत्र किया जाता है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3 मकड़ी सिल्क आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर पुनः संयोजक प्रोटीन का शोधन. ए) सेल lysate सतह पर तैरनेवाला और नी - NTA मोती क्रोमैटोग्राफी स्तंभ में जुड़ जाते हैं और 1 घंटे के लिए incubated रहे. बी) बाद flowthrough एकत्र किया जाता है, धो बफर और क्षालन बफर के 20 एमएल की 20 एमएल अनुक्रम में उपयोग किया जाता है और 5 एमएल भिन्न में एकत्र. सी) भिन्न भिन्न एसडीएस पृष्ठ से विश्लेषण कर रहे हैं, लक्ष्य प्रोटीन युक्त नमूने शुद्ध एक डायलिसिस बैग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और डि पानी के लिए के खिलाफ dialyzedपूरा होने की. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4 गीला कताई के लिए शुद्ध मकड़ी सिल्क प्रोटीन की तैयारी. ए) dialyzed उत्पाद 1 एमएल aliquots में पूर्व तौला अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए स्थानांतरित किया है. बी) 1 एमएल aliquots तरल नाइट्रोजन के साथ जमे हुए फ़्लैश हैं. सी) जमे हुए नमूने lyophilized और अधिक डायलिसिस नमूना जोड़ा जाता है. डी) सूखे द्रव्यमान की गणना है और HFIP शुष्क पाउडर के लिए जोड़ा जाता है के लिए एक 20% (w / v) कताई डोप उत्पादन बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5 गीला कताई के लिए गिलास सिरिंज में कताई डोप लोड हो रहा है. एक) जबकि syrin पकड़ेजीई खड़ी, डोप कताई सिरिंज स्तंभ के शीर्ष करने के लिए धक्का दिया है, हवाई बुलबुले को दूर. बी) लोड सिरिंज सिरिंज पंप से जुड़ा हुआ है और 95% isopropanol स्नान में कम इतना टिप सिर्फ स्नान की सतह टूट रहा है.

चित्रा 6
चित्रा 6 मकड़ी सिल्क फाइबर की एक कस्टम चपेट में डिवाइस पर सिंथेटिक स्पूलन. ए) स्पूलन युक्ति संलग्न धातु कंघी के साथ एक डिजिटल नली का व्यास से निर्माण किया है. डबल पक्षीय टेप में कंघी दोनों पक्षों के लिए लागू किया जाता है के लिए फाइबर समाप्त होता है देते हैं. बी) स्पूल धीमी गति का उपयोग कर मोटर एक मगरमच्छ क्लिप के लिए जुड़ा हुआ है. सी फाइबर) धीरे शराब स्नान से खींच लिया है और स्पूल के आसपास घाव. डी) गोंद प्रत्येक फाइबर खंड के किनारे करने के लिए लागू किया जाता है उन्हें जगह में पकड़ है. दिखाया दो अलग अलग प्रोटीन से काता फाइबर हैं.

7 चित्रा 7 चित्रा स्पिन के बाद एक घर उपकरण का उपयोग सिंथेटिक फाइबर की आकर्षित. ए) स्पूलन डिवाइस रैखिक actuator मगरमच्छ क्लिप का उपयोग कर सेटअप करने के लिए जुड़ा हुआ है. बी) एक के बाद स्पिन आकर्षित कदम के बाद, स्पूल स्नान से उठाया है. Isopropanol बूंदों लिए फाइबर संग्रह से पहले लुप्त हो जाना करने के लिए अनुमति दी जाती है.

संख्या 8
8 चित्रा यांत्रिक अध्ययन के लिए एक cardstock पर कृत्रिम रेशम के तंतुओं की बढ़ते. ए) संग्रहित फाइबर cardstock फ्रेम पर एक 1 "x 1" cutout के साथ बढ़ रहे हैं. फाइबर शुरू में डबल पक्षीय टेप के साथ जगह में आयोजित की जाती हैं, और फिर गोंद के साथ तय की. बी) cardstock फ्रेम tensometer पर तय हो गई है. पक्ष तो इतना तनाव फाइबर हालांकि केवल चल रहा है काट रहे हैं.

9 चित्रा
9 पुनः संयोजक MaSp1 protei शुद्ध का आंकड़ा विभाजन का आकारn एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण का उपयोग भिन्न चांदी धुंधला के साथ दृश्य के बाद. प्रोटीन सीढ़ी केडीए में दर्शाया जाता है. दो धोने नमूने मोतियों के लिए गैर विशिष्ट बंधन दिखाने के लिए, जबकि क्षालन नमूने कुल प्रोटीन वसूली सुनिश्चित करने के लिए 6 संग्रह के लिए की जरूरत है पता चलता है.

10 चित्रा
फाइबर के 10 चित्रा तनाव तनाव घटता पुनः संयोजक TuSp1 प्रोटीन से घूमती है. 8 रंग फाइबर कि अलग पोस्ट स्पिन आकर्षित अनुपात, 6x 2.5x से लेकर के अधीन थे दिखाने के. फाइबर उनके अनुपात समूह के भीतर कम बदलाव दिखा, के बाद स्पिन आकर्षित अनुपात में वृद्धि के रूप में, फाइबर की ताकत बढ़ जाती है जबकि तानाना की कमी हुई है.

11 चित्रा
11 चित्रा पुनः संयोजक TuSp1 प्रोटीन से काता फाइबर की छवियों स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. ए) 500x बढ़ाई, चिकनी बाहरीसतह देखा जा सकता है. बी) 5000X में, घने आंतरिक कोर फाइबर की प्राकृतिक तोड़ने से मनाया जा सकता है.

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Discussion

इस पद्धति से काता सिंथेटिक फाइबर प्राकृतिक रेशों की तुलना में परिमाण के एक ही आदेश पर यंत्रवत् हैं. स्पूलन और पोस्ट स्पिन आकर्षित प्रक्रियाओं mechanizing के द्वारा मानव त्रुटि की राशि को कम करके, नमूनों के बीच प्रयोगात्मक परिवर्तन और अधिक नियंत्रित और बहुत कम हैं.

हमारी पद्धति अन्य फाइबर है कि पुनः संयोजक मकड़ी जीन परिवार के अन्य सदस्यों की cDNAs से इनकोडिंग प्रोटीन से काता के यांत्रिक गुणों की जांच करने के लिए क्षमता प्रदान करता है. संभावित, यह फ़ाइब्राइन भीतर या अलग फ़ाइब्राइन प्रकार के बीच विभिन्न प्रोटीन मॉड्यूल के यांत्रिक भूमिका निर्धारित 23. यह भी कंपोजिट के रूप में रेशमी तंतुओं के परीक्षण के लिए अनुमति देता है, के रूप में एक से अधिक रेशम प्रोटीन या अन्य अणुओं या संयुक्त किया जा सकता है जोड़ा सकता है और एक प्रोटीन मिश्रण के रूप में घूमती है.

इस कताई पद्धति के अन्य प्रयोगशालाओं के लिए एक मंच पर आसानी से विस्तार अप्पा के रूप में है,ratuses एक सतही तरीके से निर्माण किया जा सकता है. यह भी प्रत्येक कदम का अनुकूलन या अद्वितीय यांत्रिक गुणों के साथ विशिष्ट फाइबर का डिजाइन अनुकूलित के साथ मापदंडों का समायोजन के लिए अनुमति देता है. भविष्य बढ़ जाती है के लिए हरी biomaterials के लिए जरूरत के रूप में, इस पद्धति है कि अगली पीढ़ी के अनुप्रयोगों के एक मेजबान की सेवा करने के लिए फाइबर उत्पादन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम NSF के RUI MCB-0950372 और DMR-1105310 अनुदान हकदार "काली विधवा मकड़ी रेशम और मकड़ी गोंद रेशम के यांत्रिक व्यवहार की आण्विक विशेषता," क्रमशः द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit Invitrogen K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x Promega V857C
Ni-NTA Agarose Qiagen 30210 Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit Sigma-Aldrich PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer Labconco 7960041 FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP) Sigma-Aldrich 52512
Syringe Hamilton 7657-01 250 μL
Needle Hamilton 7780-01 26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump Harvard Apparatus 702208 11Plus
Digital Caliper Carrera CP5906 0-150 mm range
Stainless steel forceps World Precision Instruments 501764 Mini Dumont #M5S
Motor Nature Mill 7090529 12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator Warner Electric 01-D024-0050-A06-LP-IP65 24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope Leica Microsystems Leica MZ16
Digital microscope camera Leica Microsystems DFC320 Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors World Precision Instruments 500260
Microtensometer Aurora Scientific 310C 5N Dual-Mode System

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References

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