Syntetisk Spider Silk Produksjonen på en laboratorieskala

Summary

Til tross for de fremragende mekaniske og biokjemiske egenskaper edderkopp silke, kan dette materialet ikke kan høstes i store mengder på konvensjonell måte. Her beskriver vi en effektiv strategi for å spinne kunstige edderkopp silke fiber, som er en viktig prosess for etterforskerne som studerte edderkopp silke produksjon og deres bruk som neste generasjons biomaterialer.

Abstract

Som samfunn utvikler seg og ressursene blir knappere, er det stadig viktigere å dyrke nye teknologier som ingeniør neste generasjons biomaterialer med høy ytelse egenskaper. Utviklingen av disse nye strukturelle materialer må være rask, kostnadseffektiv og involvere prosessering metoder og produkter som er miljøvennlige og bærekraftige. Edderkopper spinner en rekke forskjellige fibertyper med ulike mekaniske egenskaper, og tilbyr en rik kilde til neste generasjons ingeniører materialer for biomimicry som konkurrerer med de beste menneskeskapte og naturlige materialer. Siden samlingen av store mengder naturlig edderkopp silke er upraktisk, har syntetisk silke produksjon evnen til å gi forskere med tilgang til en ubegrenset tilførsel av tråder. Derfor, hvis spinnende prosessen kan være strømlinjeformet og perfeksjonert, kunstige edderkopp fibre har potensial bruk for et bredt spekter av applikasjoner som spenner fra kroppen rustning, kirurgisk suturs, tau og kabler, dekk, strenger for musikkinstrumenter, og kompositter for luftfart og romfart teknologi. For å fremme syntetisk silke produksjonsprosessen og for å gi fibre som viser lav varians i sine materialegenskaper fra spinn til å spinne, utviklet vi en våt-spinning-protokollen som integrerer uttrykket av rekombinante edderkopp silke proteiner i bakterier, rensing og konsentrasjon av proteiner , etterfulgt av fiber ekstrudering og en mekanisk post-spinn behandling. Dette er det første visuelle representasjonen som avslører en steg-for-steg prosess for å spinne og analysere kunstsilke fiber på et laboratorium skala. Det gir også informasjon for å minimalisere introduksjon av variasjonen blant fibre spunnet av samme spinnende dop. Samlet vil disse metodene drive prosessen med kunstsilke produksjon, fører til høyere kvalitet fibre som overgår naturlig edderkopp silke.

Introduction

Edderkopp silke har ekstraordinære mekaniske egenskaper som utkonkurrerer flere menneskeskapte materialer, inkludert høyfast stål, kevlar og nylon. ¹ edderkopper spinner minst 6-7 forskjellige fibertyper som viser ulike mekaniske egenskaper, hver er utformet med varierende mengder strekkstyrke og utvidelsesmuligheter til å utføre bestemte biologiske oppgaver. ² forskerne raskt forfølge bruk av edderkoppen silke som neste generasjons biomaterialer grunn av sine fremragende mekaniske egenskaper, deres biokompatibilitet, og deres ikke-giftig og grønn-materiale natur. ^3,4 grunn av kannibalistiske og giftigste natur edderkoppdyr, høsting edderkopp silke gjennom landbruk er ikke en praktisk strategi for å møte kravene som er nødvendige for industriell skala produksjon. Derfor har forskere slått til produksjon av rekombinante silke proteiner i transgene organismer kombinert med in vitro spinning av syntetiske fibre fraSE rensede proteiner. ^5-8 Expression av full-lengde rekombinante edderkopp silke proteiner har vært teknisk vanskelig gitt de iboende egenskapene til sine gensekvenser, som inkluderer deres svært repeterende natur og fysiske lengde (> 15 kb), GC-rikt innhold og partisk alanin og glycin kodon bruk. ^9-11 Hittil har de fleste labs fokusert på å uttrykke avkortede former for de store ampullate silke proteiner MaSp1 eller MaSp2 bruker ufullstendige cDNA sekvenser eller syntetiske gener. ^12-15 Spinning syntetisk edderkopp silke er en utfordrende prosess som krever mestring og kunnskap i flere vitenskapelige disipliner, og vanskelighetene med å spinne prosessen ikke har vært fullt avslørt for allmennheten ved video representasjon. Faktisk bare en håndfull laboratorier over hele verden har kompetanse til å uttrykke edderkopp silke cDNAs, rense silke proteiner, spinne syntetiske fibre og utføre post-spin uavgjort, og til slutt teste sine biomateriale egenskaper. ^8,16,17 Ulike tilnærminger for spinning syntetiske fibre har omfattet våte og tørre spinnende samt electrospinning metoder ^16,18,19 Alle prosedyrer har ett mål i felles -. Utvikling av en protokoll som produserer syntetisk edderkopp silke med mekaniske egenskaper som rivaliserende naturlige tråder for storskala kommersielle produksjonsprosesser.

Her beskriver vi fremgangsmåten for å generere kunstige edderkopp silke på et laboratorium skala ved hjelp av en våt-spinning metodikk. I forhold til andre spinnende metoder, har våte spinnende produsert de mest konsistente resultatene for fiber analyse. Vi fremgangsmåte som begynner med uttrykket av de rekombinante silke proteiner i bakterier, etterfulgt av rensing deres, og deretter beskrive protein forberedelse trinn for spinning, inkludert en post-spin uavgjort metode brukes til "as-spunnet" fibre som gir tråder med materialegenskaper som nærmer kvaliteten av naturlige spider silke. Vår methodology er designet for å nøye etterligne den naturlige spinnende prosessen med silke fiber og den trekker tungt på vår kompetanse på arkitektur og funksjon av silke-produserende kjertler fra kule-og cob-veving edderkopper. ^20-22 Videre konkluderer vi med nødvendig fremgangsmåten for å fastslå de materielle egenskapene til de syntetiske fibrene ved hjelp av en tensometer å plotte stress-tøyningskurver, som tillater etterforskere å beregne den ultimate styrke, ultimate belastning, og seighet av fiber. Til slutt, men av betydelig verdi, kan det roterende, spoling, og tegning apparater være hjemme-bygget ved hjelp av kommersielt tilgjengelige deler, snarere enn å kjøpe forseggjort og kostbar tilpasset utstyr.

Protocol

Grafisk oversikt: Biomimicry av Spinning Process

Biomimicry av den naturlige edderkopp silke produksjon vei:. En rute for å produsere syntetisk silke Dette bildet viser den store ampullate kjertel fra den gylne orb Weaver, Nephila clavipes, og komponentene benyttes for naturlig silke produksjon (hvit tekst). Halen regionen syntetiserer store mengder silke proteiner som transporteres til ampulla, en lagringsplass region for den roterende dop. Dette konsentrert dope er ekstrudert gjennom spinnende kanalen der løsningen opplever ion utveksling og dehydrering før fiber ekstrudering. De biomimetic prosesser som brukes i vårt laboratorium er merket med rød tekst. Rekombinant silke produksjonen er generert ved hjelp transgene bakterier, etterfulgt av protein rensing bruke kromatografi. Neste er renset protein subInnvirkningen av lyophilization å konsentrere materialet. Endelig er det protein igjen oppløst i HFIP og ekstrudert fra en sprøyte nål i en isopropanol bad.

1. Plasmid Bygg og bakteriecellen Kultur Forberedelse

1. Utfør PCR bruke de ønskede edderkopp silke cDNA og spesifikk primer sett. Gel-ekstrakt og ligate den forsterkede cDNA til en prokaryot uttrykk vektor f.eks pBAD / TOPO ThioFusion (Fig. 1A). Denne vektoren har en N-terminal thioredoxin tag for å lette silke protein solubilization og en C-terminal 6x hans-tag for protein rensing. Transformere ligation produkter inn kompetente E. coli-celler.
2. Velg kolonier som inneholder rekombinant kloning vektor og bruke en koloni til å vaksinere 200 ml steril LB supplert med ampicillin (Fig. 1B). Grow denne kulturen natten til metning ved å riste på 200 omdreininger i en orbital inkubator ved 37 ° C.
3. Kombiner 200 ml saturatEd kultur med 800 ml av frisk LB kultur. Fremkall edderkopp silke protein uttrykk for 4 timer ved å legge 0,2% Arabinose (w / v). Sørg for å holde kulturen i henhold antibiotika valg.
4. Pellet cellene ved 16 000 xgi 10 minutter ved 4 ° C (Fig. 1c). For enkelhets skyld pellet hele volumet i en container. Flere Sentrifugering skritt kan være nødvendig avhengig av volum kapasitet Sentrifugering rør. Hvis nødvendig, dekanter væsken volum etter spinning og re-pellet ekstra materiale å sikre hele cellepelleten er i en container. Cell pellets kan lagres ved -80 ° C inntil nødvendig.
5. Før du kaster de brukte dyrkingsmedier, legger blekemiddel eller autoklaver å sterilisere.

2. Cellelyse

1. Tilsett 20 mL 1x lysis buffer til en L cellepelleten (Fig. 2A). Sørg for å resuspender cellen pellet helt.
2. Legg lysozyme til en konsentrasjon på 1 mg / ml for å fremme ytterligerecellelyse. DNase kan også legges ved dette trinnet for å fordøye kromosomale DNA for å redusere viskositeten av løsningen. Plasser prøven på en orbital shaker og rist i 20 min.
3. Sonicate løsningen på maks i 1 minutt.
4. For å klargjøre løsningen, sentrifuger ved 16 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C (Fig. 2B).

3. Protein Purification: Ni-NTA Affinity Column Kromatografi

1. Fjern supernatanten og overføre den til en ren 25 ml kromatografi kolonne. Pass på at bunnfallet er ikke-viskøs og klar. Hvis løsningen er tyktflytende og skydekke, legge til mer DNase eller sonicate og / eller re-pellet supernatanten (gjenta trinn 2.3-2.4).
2. Tilsett 1 mL Ni-NTA slurry (0,5 ml perler) i kolonnen. Tett sikre lokket og vannkranen, og deretter satt på en rocker til stabilisering i en time for å tillate binding av 6x hans-tag til de Ni-NTA perler (Fig. 3A).
3. Sett kolonnen stående på enstå og la Ni-NTA perler til takke med ca 2 minutter. En lys blå laget kan sees nederst når perlene er helt avgjort.
4. Fjern lokket og la oppløsningen renne gjennom vannkranen. Samle denne løsningen for videre analyse (Fig. 3B).
5. Tilsett 20 mL 1x vaskebuffer og la perlene å bosette. Åpne vannkranen og la oppløsningen renne gjennom. Samle denne løsningen i fire fem ml alikvoter for videre analyse Merk: Ytterligere vask volumer kan brukes til å redusere forurensende proteiner, men det er en mulighet for en reduksjon i finalen protein avkastning..
6. Tilsett 20 mL 1x eluering buffer og la harpiks å bosette. Åpne vannkranen og la oppløsningen renne gjennom. Samle denne løsningen i fire 5 ml alikvoter for videre analyse. Merk: Ytterligere eluering volumer kan hentes på Ni-NTA resin hvis eluering ikke er fullført.
7. Prøver kan oppbevares i 4° C eller -80 ° C for kort-eller langsiktig lagring, henholdsvis.
8. Størrelse-fraksjonerer prøvene med SDS-PAGE-analyse. Visualisere proteiner med sølv eller Coomassie Brilliant Blue R-250 (Fig. 3C). Bare rene fraksjoner skal brukes til følgende. Merk: Western blot analyse kan brukes til å bekrefte identiteten til renset protein.

4. Dialyse og lyophilization

1. Dialyser prøvene mot minst 100x prøven volum (bruk deionisert vann) i 2 dager. Bytt vann løsningen hver 6. time for å fjerne alle salter. Merk: Molekylvekten størrelse cut-off av dialyse slange avhenger av størrelsen på rekombinant silke protein.
2. Vei seks 1,5 ml tomme microfuge rør og spille inn sine massene. Det kan være nyttig å punktere små hull eller innsnitt på caps av rørene før veiing for fryse tørking å legge til rette lyophilization (Fig. 4A).
3. AfTer dialyse, en overføring mL av dialyzed prøven i hver av de seks pre-veide microfuge rør (Fig. 4B). Flash fryse bruker flytende nitrogen og tørke prøvene ned med en fryse tørketrommel (Fig. 4C).
4. Når det er tørt, overføre en annen en mL av dialyse prøven i hver av de seks rørene. Gjenta til hele dialysen prøven er tørket ned i microfuge rør.
5. Frys tørkede prøver kan oppbevares ved -80 ° C for langtidslagring.

5. Spinning Dope Forberedelse

1. Vei hver av de microfuge rør som inneholder tørket protein pulver. Trekk den første massen av de tomme rør for å oppnå total tørr proteinmasse. Merk: Avhengig av protein avkastning, må du kanskje rense ekstra materiale for å spinne prosessen.
2. Beregn volumet av Hexafluoroisopropanol (HFIP) for å legge til hvert rør for å få 200 mg / ml til 500 mg / ml, eller 20% til 50% vekt per volum. Legg til hensiktsmessigspiste mye HFIP i hver tube (Fig. 4D). Merk: HFIP er svært volatil og giftig, pipette nøye og cap røret så snart som mulig. HFIP bør behandles under ett sikkerhet hette.
3. Parafilm rørene og legg dem på en rocker til solubilize protein. Vortex og sentrifuger innimellom for å lette solubilization. Dette kan ta opptil 2 dager.

6. Sprøyte Klargjøring og Apparatus Setup

1. Load minst 25 mL av solubilisert spinnende dope opp i sprøyten. Pass på at det finnes ingen tilslag som det kan tette sprøyten. Merk: Dette eksempelet er utrolig seig, så vær forsiktig når pipettering.
2. Skyv dope til fronten av sprøyten vertikalt, fjerne alle luftbobler (Fig. 5A). Merk: Luftbobler skape uoverensstemmelser i fiber.
3. Lås sprøyten til pumpen. Hev en 400 mL begerglass fylt med 95% isopropanol opp slik at tuppen av sprøytener bare å bryte overflaten av alkohol (Fig. 5B).
4. Sett sprøyten pumpen til 15 mL / min og start programmet. La as-spunnet fiber til å sitte i isopropanol i 20 minutter for å fullt ut stabilisere. Merk: Disse fibrene kan fortsatt brukes av MS / MS-analyse for å bekrefte identiteten til proteiner i fibrene.

7. Post-spin Draw og Prøvetaking

1. Påfør dobbeltsidig tape på begge sider av kammen på spoleapparatet. Spoleapparatet ble opprettet fra liming av metall kammer til en digital caliper (Fig. 6A). Fest spoleapparatet til en motor (Fig. 6B). Vi anbefaler spolet gjengene ved 2 rpm. Merk: raskere spoling priser fører til store mengder variasjon i fiber kvalitet og reproduserbarhet.
2. Bruk pinsett forsiktig ta den ene enden av fiber og trekk den ut av isopropanol, feste den til kanten av en av kammen armene på spolen (Fig. 6C). De neste skritt bør gjøres uten stans for å hindre at fibrene tørker ut.
3. Slå på motoren og forsiktig lede fiber på spoleapparatet. Merk: Under spoling, ikke la fiber å doble opp og stable oppå hverandre.
4. Når hele fiber er kø, ta spolen fra motoren og påfør lim på kanten av hver silke fiber på dobbeltsidig tape (Fig. 6D). Dette fester edderkopp silke på apparatet. Merk: Ved å bruke limet til dobbeltsidig teip før etter spin tegning, hindrer det hele fiber sklir og gir mulighet for selektiv strekking av de indre deler av fibrene i kalipperen armene.
5. Fest spolen til lineær aktuator (Fig. 7A). Ta opp den første lengden på fibrene ved hjelp av kalipperen Merk at dette er den interne lengden av fiber,. Det inkluderer ikke lengden limes og pakket around spolen.
6. Senk spolen i en 75% isopropanol bad. La fibrene til stabilisering i 10 minutter. Merk: Andre dehydrerende løsninger kan brukes til spinning prosessen, for eksempel metanol, aceton og ammonium sulfat.
7. Sett lineær aktuator hastigheten til 1,5 mm / sek. Basert på den første lengden, beregne den endelige lengden på ønsket post-spin uavgjort forholdet. Beløpet strakte kan styres basert på hastigheten eller lengden, avhengig av oppsettet. For eksempel, med en innledende lengde på 15 mm og en ønsket post-spin trekning forholdet 3x, bør den endelige lengden være 45 mm. Dette kan også beregnes som slår den lineær aktuator i 20 sekunder med en rate på 1,5 mm / sek.
8. Når ønsket innlegget spinn uavgjort er fullført, sakte heve spolen ut av isopropanol. La dråpene av isopropanol tørke i ett minutt, og deretter samle inn prøver (Fig. 7B). Prøvene skal monteres på kartong eller folie rammer for testing purpositurer.
9. Hvis flere innlegg spin uavgjort forholdstall er ønsket, senke spolen tilbake i 75% isopropanol bad. La fibrene til stabilisering i 10 minutter, og deretter gå videre til neste post spinn trekning ratio.

8. Strekkprøving

1. La de innsamlede prøvene skal stabilisere seg til standarden lab miljøet i minst en time før mekanisk testing. Fuktigheten og temperaturen bør registreres da de kan påvirke fiber mekaniske egenskaper. Standard fuktighet og temperaturforhold bør være ca 40% og 25 ° C, henholdsvis.
2. Lim kantene på kartongen eller folie for å sikre fiber på rammen. Vær oppmerksom på størrelsen på åpningen av rammen. Dette er den første lengden din testet fiber. A 1 tomme (25,4 mm) åpningen ramme vises her (Fig. 8A).
3. Ved hjelp av et lysmikroskop med en 100x eller større forstørrelse, ta diametermålinger langs den langsgående fiber aksen.Minst 3 målinger bør registreres. Jo høyere forstørrelse brukes og jo flere målinger tatt, jo bedre blir nøyaktigheten.
4. Fest rammen til en tensometer mekanisk belastning ramme (Fig. 8B). Kutt ramme på begge sider slik at spenningen blir bare kjører gjennom fiber. Tare på tensometer og samle data. En standard stamme på 2% per sekund.
5. Bruke de innsamlede dataene og gjennomsnittlig diameter, kan en stress belastning kurve bli plottet.
6. Den brukne fiber kan nå monteres på en scanning elektronmikroskop (SEM) spire for morfologiske analyser og Brytningspunkt diametermålinger. Den fiber segmentet bort fra bruddet punktet kan brukes til å beregne og kontrollere den første diameteren målt ved lysmikroskop.

9. Representative Resultater

Fra trinn 3, bør de ulike fraksjonene bli analysert av SDS-PAGE analyse og proteiner visualisert med sølveller Coomassie Brilliant Blue R-250. Fra en standard Ni-NTA kolonnen forhold, kan eluering fraksjoner med> 90% renhet oppnås (Fig. 9). Små forurensende proteiner kan bli ytterligere fjernes ved omfattende dialyse. Bruke 25 mL av spinning dope ved 20% (w / v), kan minst 30 separate fiber prøver bli samlet inn fra kontinuerlig såret fiber på spolen (forutsetter en innledende lengde på 13 mm brukes). De mekaniske egenskapene kan analyseres ved tensometer tester (Fig. 10). Avhengig av rekombinant silke protein brukes for spinning prosessen, vil maksimal innlegget spin uavgjort forholdstall må empirisk bestemt. Generelt poste spin tegne forholdstall på 4.0x kan oppnås uten fiber svikt (Fig. 10). Spunnet fiber, før eller etter innlegg spin trekning, kan analyseres med en scanning elektronmikroskop for å visualisere ultrastructure (Fig. 11A, B). Spunnet fiber kan også brukes til mekanisk testing, vise resultaterat med lav variasjon innenfor et innlegg spin uavgjort ratio prøve gruppe (Fig. 10).

Figur 1. Uttrykk for den edderkopp silke cDNA i bakterier. A) Den pBAD TOPO / Thio vektor som inneholder edderkopp silke cDNA av interesse er forvandlet til kompetent E. coli-celler. B) En enkelt koloni inokuleres inn 200 ml LB og vokst til metning over natten. Etter inokulasjon, er 800 ml av frisk LB lagt til og kulturen er indusert for uttrykket ved hjelp Arabinose. C) Ved avslutningen av induksjon, er kulturen pelletert ved sentrifugering. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Lysis av bakterielle celler etter edderkopp silke protein induksjon. A) Twenty millilikapitlene av 1x lysis buffer og DNase legges til cellepelleten og plassert på en orbital shaker og sonicated å lysere cellene. B) Cellen lysate er spunnet i en sentrifuge for å fjerne bunnfallet av mobilnettet rusk, og supernatanten hentes. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Rensing av edderkopp silke rekombinante proteiner med affinitet kromatografi. A) Cellen lysate supernatanten og Ni-NTA perler blir lagt til en kromatografi kolonne og inkuberes i 1 time. B) Etter at flowthrough blir samlet inn, er 20 ml vaskebuffer og 20 ml eluering buffer brukes i rekkefølge og samlet i 5 ml fraksjoner. C) De ulike fraksjoner analyseres ved SDS-PAGE, de rene prøver som inneholder målet protein blir overført til en dialyse bag og dialyzed mot DI vann tilferdigstillelse. Klikk her for å se større figur .

Figur 4. Forberedelse av renset edderkopp silke protein for våt-spinning. A) Den dialyzed produktet er overført til pre-veide sentrifugerør i 1 ml alikvoter. B) 1 ml alikvoter er Flash frosset med flytende nitrogen. C) De frosne prøvene lyofilisert og mer dialyse prøven er lagt til. D) Tørket masse beregnes og HFIP legges til tørt pulver til å produsere en 20% (w / v) spinne dope. Klikk her for å se større figur .

Figur 5. Lasting av spinne dope ned i glasset sprøyten for våt-spinning. A) Mens du holder syringe vertikalt, blir spinner dope skjøvet til toppen av sprøyten kolonnen, fjerner luftbobler. B) Den lastet sprøyte er festet til sprøyten pumpen og senkes ned i 95% isopropanol bad slik at spissen er bare å bryte overflaten av badekaret.

Figur 6. Ruller av de syntetiske edderkopp silke fiber inn på en egendefinert reeling enhet. A) spoleapparatet er konstruert fra en digital caliper med vedlagte metall kammer. Dobbeltsidig tape brukes på begge sider av kammen for å feste fiber endene. B) Den spolen er festet til sakte fart motoren med en alligator klipp. C) fiber er langsomt trukket fra alkohol bad og vikles rundt spolen. D) Lim brukes til kanten av hver fiber segment å holde dem på plass. Vist er to forskjellige fibre spunnet av forskjellige proteiner.

Figur 7. Post-spin trekke av de syntetiske fibrene ved hjelp av en hjemmelaget apparat. A) spoleapparatet er festet til lineær aktuator oppsettet bruker krokodilleklemmer. B) Etter et innlegg spin uavgjort trinnet, spolen løftet fra badet. Isopropanol dråper er lov til å fordampe før fiber samling.

Figur 8. Montering av de syntetiske silke fiber inn på en kartong for mekaniske studier. A) samlet fibre er montert på kartong rammer med en 1 "x 1" cutout. Fibrene er i utgangspunktet holdes på plass med dobbeltsidig tape, og deretter festes med lim. B) Den kartong rammen er festet til en tensometer. Sidene blir deretter kuttet så spenningen er bare kjører om fiber.

Figur 9. Størrelse fraksjonering av renset rekombinant MaSp1 protein fraksjoner med SDS-PAGE-analyse etterfulgt av visualisering med sølv flekker. Protein stigen er avbildet i kDa. De to vask prøvene viser ikke-spesifikk binding til perlene, mens eluering prøvene avdekke behovet for 6 samlinger for å sikre total protein utvinning.

Figur 10. Stress tøyningskurver av fibre spunnet av rekombinante TuSp1 proteiner. ⁸ farger viser fibre som var underlagt ulike innlegg spin draw forholdstall, fra 2.5x til 6x. Fibers viser lav variasjon innenfor deres ratio gruppen; som post spin uavgjort forholdstall øker, blir styrken på fiber økte mens utvidelsesmuligheter er redusert.

Figur 11. Scanning elektronmikroskopi bilder av fiber spunnet av rekombinante TuSp1 proteiner. A) Ved 500x forstørrelse, den glatte ytreOverflaten kan sees. B) På 5000x, kan den tette indre kjernen observeres fra en naturlig pause på fiber.

Discussion

Syntetiske fibre spunnet av denne metodikken er mekanisk på samme størrelsesorden i forhold til de naturlige fibre. Ved å redusere mengden av menneskelig feil ved mechanizing spolingskatalogen og post spin draw prosesser, eksperimentell variasjon mellom prøvene er mer kontrollert og sterkt redusert.

Vår metodikk har potensial til å undersøke de mekaniske egenskapene til andre fibre som er spunnet av rekombinante proteiner kodet fra de cDNAs andre medlemmer av edderkopp genet familie. Potensielt kan det bestemme mekaniske rollen ulike protein moduler innenfor en fibroin, eller mellom de ulike fibroin typene. ²³ Det gir også mulighet for testing av silke fiber som kompositter, som mer enn en silke protein eller andre molekyler kan kombineres eller legges og spant som en protein blanding.

Dette spinnende metodikken er en plattform for andre laboratorier for enkelt å utvide på, som apparatuses kan konstrueres på en lettvinte måte. Dette gir også mulighet for å justere parametere langs hvert trinn for å optimalisere eller tilpasse utformingen av spesifikke fibre med unike mekaniske egenskaper. Som behovet for grønne biomaterialer for fremtidige økninger, kan denne metodikken tilpasses produsere fibre som tjener en rekke neste generasjons applikasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit	Invitrogen	K370-01
FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x	Promega	V857C
Ni-NTA Agarose	Qiagen	30210	Includes instructions for buffers
ProteoSilver Silver Stain Kit	Sigma-Aldrich	PROTSIL1-1KT
FreeZone Lyophilizer	Labconco	7960041	FreeZone 12Plus
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	52512
Syringe	Hamilton	7657-01	250 μL
Needle	Hamilton	7780-01	26s Gauge, Blunt end removable needle
Syringe Pump	Harvard Apparatus	702208	11Plus
Digital Caliper	Carrera	CP5906	0-150 mm range
Stainless steel forceps	World Precision Instruments	501764	Mini Dumont #M5S
Motor	Nature Mill	7090529	12VDC, 2 rpm speed
Linear Actuator	Warner Electric	01-D024-0050-A06-LP-IP65	24VDC, 6 inch range
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software: Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments	500260
Microtensometer	Aurora Scientific	310C	5N Dual-Mode System