Summary
Несмотря на выдающиеся механические и биохимические свойства шелка пауков, эти материалы не могут быть собраны в большом количестве с помощью обычных средств. Здесь мы опишем эффективную стратегию вращаться искусственного шелка паука волокна, которое является важным процессом для изучения следователями паук производство шелка и их использование в качестве следующего поколения биоматериалов.
Abstract
Как общество прогрессирует и ресурсов становится все меньше, она становится все более важным развивать новые технологии, инженер следующего поколения биоматериалов с высокими эксплуатационными свойствами. Развитие этих новых конструкционных материалов должно быть быстрым, экономичным и включают обработку методик и продуктов, которые являются экологически чистыми и устойчивыми. Пауки крутиться множество различных типов волокон с различными механическими свойствами, предлагая богатый источник следующего поколения конструкционных материалов для биомимикрия что соперник лучших искусственных и натуральных материалов. Так как набор большого количества натурального шелка пауков нецелесообразно, производство синтетического шелка имеет возможность предоставить ученым доступ к неограниченным запасом темы. Поэтому, если вращающийся процесс может быть упрощен и усовершенствован, искусственных волокон паука есть возможность использования для широкого спектра применений, начиная от бронежилета, хирургические шовныес, канаты и тросы, шины, струны для музыкальных инструментов, а также композиционных материалов для авиационной и космической техники. В целях ускорения процесса производства синтетического шелка и для получения волокна, которые отображают низкой дисперсией по своим свойствам материал из спин спина, мы разработали мокрого прядения протокол, который объединяет экспрессия рекомбинантных белков шелка пауков в бактерии, очистки и концентрации белков , а затем методом экструзии волокна и механического после лечения спина. Это первое визуальное представление, что показывает, шаг за шагом процесс спина и анализ искусственных волокон шелка в лабораторном масштабе. Он также содержит подробную информацию, чтобы свести к минимуму введением вариабельность волокна нити из одного вращающегося допинг. В совокупности эти методы будут стимулировать процесс искусственного шелка, что приводит к более высоким качеством волокна, которые превосходят натуральный шелк паука.
Introduction
Паук шелк обладает экстраординарными механические свойства, что из выполняет несколько искусственных материалов, в том числе из высокопрочной стали, кевлара и нейлона. 1 Пауки крутиться как минимум 6-7 различных типов волокон, которые отображают разнообразные механические свойства, каждый из которых предназначен с разным количеством прочность и растяжимость для выполнения определенных биологических задач. 2 исследования ученые быстро стремится к использованию шелка паука в качестве следующего поколения биоматериалов, потому что их выдающиеся механические свойства, их биосовместимости, и их нетоксичными и зелено-материальной природы. 3,4 Из-за людоедских и ядовитых паукообразных природы, сбор пауков шелка через сельское хозяйство не является практической стратегии для удовлетворения потребностей необходимых для промышленного производства масштабе. Таким образом, ученые обратились к производству рекомбинантных белков шелка в трансгенных организмов в сочетании с в пробирке прядение синтетических волокон изсебе очищенного белка. 5-8 Выражение полнометражный рекомбинантных белков паутины было технически сложно, учитывая внутренние свойства их последовательностей генов, в том числе их очень повторяющийся характер и физическую длину (> 15 кб), GC-богатым содержанием и предвзятым аланин и глицин кодонов. 9-11 На сегодняшний день большинство лабораторий были направлены на выражение усеченной формы основных ampullate протеины шелка MaSp1 или частичном использовании MaSp2 кДНК или синтетических генов. 12-15 прядильно синтетического шелка пауков является сложным процессом, требующим мастерство и знания в различных научных дисциплин, и в тонкостях процесса прядения, не были полностью открыты широкой общественности с помощью видео-представление. На самом деле, лишь немногие из лабораторий по всему миру есть опыт, чтобы выразить кДНК шелка паука, очистить протеины шелка, спина синтетических волокон и выполнять после спин-дро, и, наконец, проверить свои свойства биоматериалов. 8,16,17 различные подходы для прядения синтетических волокон охватили влажные и сухие прядильных а также методы электропрядения 16,18,19 Все процедуры имеют одну цель общего -. Разработке протокола, который производит синтетический шелк пауков с механическими свойствами, которые могут соперничать нити из натуральных для крупных коммерческих производственных процессов.
Здесь мы опишем процедуру создания искусственного шелк паука в лабораторном масштабе с использованием мокрого прядения методологии. По сравнению с другими методами прядильных, мокрого прядения произвел наиболее последовательные результаты для волоконно-анализа. Опишем эту процедуру, начиная с выражением рекомбинантных белков шелка в бактерии, а затем их очистки, а затем описать белкового препарата шаги для прядения, в том числе после ничьей спина методологии применительно к "как нити" волокна, что дает нити свойства материалов, которые подходят к качеству природных шелк паука. Наши методичесу предназначен для точного моделирования естественного процесса прядения шелка и волокон в значительной степени опирается на наш опыт в архитектуре и функциях шелковых желез с шаром и початков плетение пауков. 20-22 Кроме того, мы заключаем с необходимыми шаги для определения физических свойств синтетических волокон с использованием тензометр построить напряженно-деформированного кривые, которые позволяют исследователям рассчитать предел прочности, предельной деформации и прочность волокна. Наконец, но существенное значение, спиннинг, подкачку и рисование аппаратов может быть домашний построены с использованием коммерчески доступных частей, вместо того чтобы покупать сложную и дорогостоящую нестандартного оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Графический обзор: Biomimicry процесса прядения
Biomimicry природных паук производства шелка путь. Маршрут по производству синтетического шелка Это изображение показывает основные железы ampullate с золотой шар ткача, Nephila clavipes и компонентов, используемых для добычи природного шелк (белый текст). Хвост области синтезирует большое количество протеины шелка, которые транспортируются в ампуле, хранение регионе вращающегося допинг. Этот концентрированный наркотик выдавливается через вращающийся канал, где решение испытывает ионного обмена и обезвоживание до волоконно экструзии. Биомиметических процессы, используемые в нашей лаборатории, обозначены красным цветом. Рекомбинантный производства шелка создан с помощью трансгенных бактерий, а затем очистки белков с использованием хроматографии. Затем очищенный белок является субJect для лиофилизации сосредоточиться материала. Наконец, белок повторно растворяется в HFIP и выдавливают из шприца в изопропанол ванну.
1. Плазмиды Строительство и бактериального препарата клеточных культур
- Выполните ПЦР с использованием желаемого шелка паука кДНК и конкретным набором праймеров. Гель-извлечь и перевязывать усиленный кДНК в вектор экспрессии прокариотических например pBAD / TOPO ThioFusion (рис. 1А). Этот вектор имеет N-терминал тиоредоксин теги для облегчения растворения белков шелка и С-концевой 6x свой тег для очистки белков. Преобразование перевязки продуктов в компетентный E. кишечной клетки.
- Выберите колоний, которые содержат рекомбинантный вектор клонирования и использовать одну колонию привить 200 мл стерильного LB дополнить ампициллин (рис. 1б). Рост этой культуры в ночь на насыщение при встряхивании на 200 оборотов в минуту в орбитальном инкубаторе при температуре 37 ° C.
- Смешайте 200 мл saturatред культуры с 800 мл свежего культуры LB. Вызвать шелка паука экспрессии белка в течение 4 часов, добавив 0,2% арабинозы (вес / объем). Убедитесь в том, чтобы сохранить культуру под антибиотик выбора.
- Гранул клеток при 16000 х г в течение 10 минут при температуре 4 ° С (рис. 1в). Для простоты гранул весь объем в одном контейнере. Несколько шагов центрифугирования могут быть необходимы в зависимости от объема емкости центрифугирования труб. При необходимости переливать жидкости объемом после центрифугирования и повторно гранул дополнительный материал для обеспечения всего осадок клеток в одном контейнере. Сотовые гранулы могут храниться при -80 ° C до необходимости.
- Перед утилизацией отработанных питательных сред, добавьте отбеливатель или автоклав для стерилизации.
2. Лизиса клеток
- Добавить 20 мл 1x лизис буфера в 1 л осадок клеток (рис. 2). Убедитесь в том, ресуспендируют осадок клеток полностью.
- Добавить лизоцим до концентрации 1 мг / мл и далее содействоватьлизиса клеток. ДНКазы также могут быть добавлены на этот шаг, чтобы переварить хромосомной ДНК, чтобы снизить вязкость раствора. Поместите образец на орбитальном шейкере и осторожно встряхнуть в течение 20 мин.
- Разрушать ультразвуком решение максимально в течение 1 минуты.
- Для уточнения решения, центрифуги при 16000 х г в течение 10 минут при температуре 4 ° С (рис. 2В).
3. Очистки белков: Ni-NTA Affinity колоночной хроматографии
- Удалить супернатант и перенести его в чистое 25 колоночной хроматографии мл. Убедитесь, что супернатант невязкой и ясно. Если решение вязкой и облачно, добавить ДНКазы или разрушать ультразвуком и / или повторного гранул супернатант (повторите шаги 2.3-2.4).
- Добавить 1 мл Ni-NTA раствора (0,5 мл гранулы) в столбце. Плотно закрыть крышкой и краном, а затем установить на качалку, чтобы уравновесить в течение 1 часа, чтобы связывание 6x свой тег на Ni-NTA бисера (рис. 3А).
- Установка колонки в вертикальном положении настоять и позволять Ni-NTA бисером решить в течение 2 минут. Голубой слой можно увидеть внизу, когда шарики полностью урегулирован.
- Снимите крышку и дайте решение поступать через кран. Соберите это решение для дальнейшего анализа (рис. 3В).
- Добавить 20 мл 1x промывочного буфера и позволяет бисером, чтобы обосноваться. Откройте кран и, чтобы раствор проходит через. Соберите это решение в четыре 5 мл аликвоты для дальнейшего анализа Примечание: дополнительные объемы стирки может быть использован для снижения загрязняющих белков, однако, есть возможность снижения конечный выход белка..
- Добавить 20 мл 1x элюирующего буфера и позволяет смоле отстояться. Откройте кран и, чтобы раствор проходит через. Соберите это решение в четырех 5 мл аликвоты для дальнейшего анализа. Примечание: дополнительные объемы элюирования может быть собрана из Ni-NTA смолы если элюирования не завершена.
- Образцы могут храниться в 4° С или -80 ° С в течение короткого или длительного хранения, соответственно.
- Размер-фракционирования образцов с помощью SDS-PAGE анализа. Визуализируйте белков с серебром или Кумасси Brilliant Blue R-250 (рис. 3в). Только чистые фракции должны быть использованы для следующих шагов. Примечание: Вестерн-блот анализе могут быть использованы для подтверждения личности очищенного белка.
4. Диализа и лиофилизации
- Диализировать образцов с по крайней мере 100 раз объем образца (использование дистиллированной воды) в течение 2 дней. Изменение водного раствора через каждые 6 часов, чтобы удалить все соли. Примечание: размер молекулы вес отсечения на диализе труб зависит от размера рекомбинантного белка шелка.
- Взвесьте шесть 1,5 мл пустой трубы микроцентрифужную и записывать их массы. Это может быть полезно для прокола небольшие отверстия или щели на шапки труб перед взвешиванием для сублимационной сушки для облегчения лиофилизации (рис. 4).
- Мтер диализа, передача 1 мл диализовали образца в каждом из 6 предварительно взвешенные микроцентрифужную труб (рис. 4В). Вспышка заморозить с помощью жидкого азота и высушить образцы до использования замораживания сушки (рис. 4в).
- После высыхания, передача еще 1 мл диализа образец в каждой из шести трубок. Повторяйте, пока весь образец диализ был сушат в микроцентрифужную труб.
- Сублимированные образцы могут храниться при -80 ° C для длительного хранения.
5. Прядильные Dope подготовка
- Взвешивание каждого из микроцентрифужную пробирки, содержащие сухой порошок белка. Вычтите начальной массы пустой трубы для получения общей сухой массы белка. Примечание: В зависимости от выход белка, возможно, потребуется, чтобы очистить дополнительный материал для прядения.
- Рассчитайте объем гексафторизопропанол (HFIP), чтобы добавить в каждую пробирку для получения 200 мг / мл до 500 мг / мл, или 20% до 50% веса на единицу объема. Добавить соотели количество HFIP в каждую пробирку (рис. 4). Примечание: HFIP обладает высокой летучестью и токсичны, пипеткой тщательно и ограничить трубку как можно скорее. HFIP должны быть обработаны под защитный колпак.
- Парафильмом труб и место на качалку для растворения белков. Vortex и центрифуги иногда для облегчения растворения. Это может занять до 2 дней.
6. Подготовка шприца и аппараты установки
- Загрузка по крайней мере 25 мкл растворенного вращающегося допинг в шприц. Убедитесь, что нет агрегатов представить, как она может засорить шприц. Примечание: Этот пример невероятно вязкий, поэтому соблюдайте осторожность при пипетки.
- Нажмите на допинг перед шприц вертикально, удалить все пузырьки воздуха (рис. 5а). Примечание: пузырьки воздуха создают противоречия в волокно.
- Блокировка шприц с насосом. Поднимите 400 мл стакан заполнен на 95% изопропанола так, наконечник шприцапросто разрушение поверхности спиртом (рис. 5б).
- Установить шприцевой насос до 15 мкл / мин и запуска программы. Позвольте в качестве прядения волокна сидеть в изопропанол в течение 20 минут, чтобы полностью уравновешивать. Примечание: Эти волокна могут еще быть использованы MS / MS анализа подтверждают подлинность белков в волокна.
7. Пост-спин Draw и сбора проб
- Применение двусторонней клейкой ленты, чтобы обе стороны гребня на устройство для намотки каната. Устройство для намотки каната был создан из склеивания металла гребни для цифровых суппорта (рис. 6а). Прикрепите устройство для намотки каната на двигатель (рис. 6Б). Мы рекомендуем буферизации темы на 2 мин. Примечание: быстрее буферизации результатов ставок в больших количествах изменение качества волокна и воспроизводимость.
- Используя щипцы нежно схватить одного конца волокна и медленно вытащите его из изопропанола, прикрепив ее к краю одного из гребня руки на катушку (Рис. 6C). Следующие несколько шагов должно быть сделано без остановки, чтобы предотвратить волокна от высыхания.
- Включите двигатель и мягко направлять волокна на устройство для намотки каната. Примечание: Во время буферизации, не позволяют волокна удвоится и складывать друг на друга.
- После всего волокно наматывается, отсоединить катушку от двигателя и нанесите клей на край каждого шелковые волокна на двусторонний скотч (рис. 6). Это ускоряет шелка паука на аппарат. Примечание: Применяя клей на двухсторонний скотч до пост-спин рисунок, он предотвращает все волокна от скольжения и обеспечивает селективное растяжение внутренних слоев волокон в суппорт оружия.
- Установите катушку с линейным приводом (рис. 7а). Запись начальной длины волокон с использованием суппорта Отметим, что это внутренняя длина волокна;. Она не включает длину клееных и завернутый арound катушки.
- Опустите катушку в 75% изопропанола ванну. Позвольте волокон, чтобы уравновесить в течение 10 минут. Примечание: Другие обезвоживания решения могут быть использованы для прядения, такие как сульфат метанола, ацетона и аммиака.
- Установить скорость линейного привода до 1,5 мм / сек. На основе исходной длины, расчет конечной длины для желаемой после спина вытяжки. Сумма растягивается можно контролировать в зависимости от скорости и длины, в зависимости от настройки. Например, с начальной длиной 15 мм и желанный пост-спин вытяжки 3x, окончательная длина должна быть 45 мм. Это также может быть рассчитана как питание линейного привода в течение 20 секунд со скоростью 1,5 мм / сек.
- Как только нужное сообщение ничья спина завершена, медленно поднимите катушку из изопропанола. Дайте капли изопропилового спирта высохнуть в течение 1 минуты, а затем собирать образцы (рис. 7б). Образцы должны быть установлены на картон или фольгу кадров для тестирования PURпозах.
- Если дальнейшие отношения спина после розыгрыша желании снизить катушку обратно в 75% изопропанола ванну. Позвольте волокон, чтобы уравновесить в течение 10 минут, а затем переходите к следующему отношению спина ничья сообщение.
8. Испытание на растяжение
- Позвольте проб, чтобы уравновесить стандартных лабораторных условиях, по крайней мере за 1 час до механических испытаний. Влажности и температуры должны быть зарегистрированы как они могут повлиять на механические свойства волокна. Стандартный влажности и температуры должны быть примерно на 40% и 25 ° C, соответственно.
- Клей края картон или фольгу, чтобы обеспечить волокна на раме. Обратите внимание на размер открытия кадра. Это начальная длина вашего испытания волокна. 1 дюйм (25,4 мм) Открытие кадра показано на рисунке (рис. 8).
- С помощью светового микроскопа с 100x или больше увеличение, принять диаметр измерения вдоль продольной оси волокна.По крайней мере 3 измерения должны быть зарегистрированы. Чем больше увеличение используются и более измерений, тем лучше точность.
- Закрепите рамку кадра тензометр механические нагрузки (рис. 8, б). Сокращение кадров с обеих сторон, так что напряжение только проходит через волокна. Тара тензометр и сбора данных. Стандартный скорости деформации 2% в секунду рекомендуется.
- Используя данные, собранные и среднего диаметра, кривой напряжение-деформация могут быть построены.
- Сломанные волокно может теперь быть установлен на сканирующего электронного микроскопа (SEM) заглушки для морфологического анализа и измерения точки разрыва диаметре. Волокна сегменте от точки останова могут быть использованы для оценки и проверки начальный диаметр измеряется световой микроскоп.
9. Представитель Результаты
В шаге 3, различных фракций должны быть проанализированы SDS-PAGE анализ и визуализация белков с серебромили Кумасси Brilliant Blue R-250. Из стандартных Ni-NTA условиях колонке, элюированием фракций с> 90% чистоты может быть получен (рис. 9). Малый загрязняющих белков могут быть в дальнейшем удалена обширный диализа. Использование 25 мкл спиннинг допинг на 20% (вес / объем), по крайней мере 30 различных образцов волокна могут быть собраны из непрерывного волокна раны на катушку (предполагается, начальная длина 13 мм используется). Механические свойства могут быть проанализированы тензометр испытаний (рис. 10). В зависимости от рекомбинантного белка шелка используется для прядения, максимальное соотношение спина после ничьей должны быть определены эмпирически. В общем, после спина сделать отношения 4.0x может быть достигнуто без разрушения волокон (рис. 10). Spun волокон, до или после того, как сообщение ничья спина, могут быть проанализированы с помощью сканирующего электронного микроскопа для визуализации ультраструктуры (рис. 11а, б). Spun волокна также могут быть использованы для механических испытаний, показывая результатычто при низких изменения в ничью после спин группы образцов отношение (рис. 10).
Рисунок 1. Выражение паучьего шелка кДНК у бактерий. А) pBAD TOPO / Thio вектор, содержащий шелка паука кДНК интерес превращается в компетентный E. кишечной клетки. Б) один колонии засевают в 200 мл LB и выросли до насыщения в одночасье. После прививки, 800 мл свежего LB добавляется и культуры индуцированный для выражения с помощью арабинозы. C) В заключение индукции, культуры центрифугированием. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Лизиса бактериальных клеток после индукции белков паука шелка. А) Двадцать milliliTERS от 1x лизис буфера и ДНКазы добавляется в осадок клеток и помещены на орбитальном шейкере и ультразвуком лизировать клетки. B) Клеточный лизат вращается в центрифуге, чтобы очистить супернатант клеточной мусора, и супернатант собирается. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Очистка шелка паука рекомбинантных белков методом аффинной хроматографии. А) Клеточный лизат супернатант и Ni-NTA шарики добавляют в хроматографии и выдерживают в течение 1 часа. Б) После flowthrough собираются, 20 мл промывочного буфера и 20 мл элюирующего буфера используются в последовательности и собраны в 5 мл фракции. C) различных фракций анализируются SDS-PAGE, чистые образцы, содержащие белка-мишени передается диализа сумку и диализовали против DI водызавершения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Подготовка шелка пауков очищенного белка для мокрого прядения. А) Диализованный продукт передается предварительно взвешенные пробирки в 1 порции мл. Б) 1 порции мл, заморозки жидким азотом. С) замороженные образцы лиофилизированной и более диализа образец добавляется. D) Сушеные масса рассчитывается и HFIP добавляется в сухую смесь для производства 20% (вес / объем) вращается допинг. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 5. Загрузка спиннинг допинга в стеклянный шприц для мокрого прядения. А) Удерживая СиринGE по вертикали, вращающиеся допинг прижимается к верхней части шприца колонки, удаления пузырьков воздуха. B) загружены шприц прилагается к шприцевой насос и опустить в 95% изопропанола ванну, и наконечник просто разрушение поверхности ванны.
Рисунок 6. Спулинг синтетических волокон шелка пауков на пользовательские устройства шатается. А) устройство для намотки каната изготовлена из цифровых суппорта с прикрепленными металла гребни. Двусторонняя лента наносится на обе стороны гребня приложить концов волокон. Б) катушка крепится к медленной скорости двигателя использовании крокодил. С) волокна медленно вытащили из ванны и алкоголь намотан на катушку. D) клей наносится на край каждого сегмента волокна, чтобы держать их на месте. Показаны два различных волокна нити из различных белков.
Рисунок 7. Сообщение спина привлечь синтетических волокон с использованием самодельного аппарата. А) устройство для намотки каната крепится к линейной установке привода использованием крокодил. Б) После ничьей шаг спина сообщение, катушка поднимается из ванны. Изопропанол капли могут испариться, прежде чем волокно коллекции.
Рисунок 8. Монтаж синтетических волокон шелка на картон для механических исследований. А) Собрание волокна расположены на картон кадры с 1 "х 1" вырез. Волокна изначально удерживается на месте с помощью двухсторонней ленты, а затем фиксируется клеем. B) картон кадров крепится тензометр. Стороны затем разрезать так напряженности только работает, хотя волокна.
Рисунок 9. Размер фракционирования очищенный рекомбинантный MaSp1 Протейн фракций с помощью SDS-PAGE анализа следует визуализации с окрашиванием серебром. Белки лестница изображен на кДа. Два образца мытья показать неспецифическое связывание с бисером, а элюирования образца указывают на необходимость в течение 6 коллекций для обеспечения полного восстановления белков.
Рисунок 10. Стресс деформации кривых волокна нити из рекомбинантных белков TuSp1 8. Цвета показывают волокон, которые подвергались различным спином сообщение ничья отношений, начиная от 2,5 до 6х. Волокна показывают низкий изменения в их отношении группы, как пост спина увеличение ничья отношений, прочность волокна увеличивается в то время как расширения уменьшается.
Рисунок 11. Сканирующей электронной микроскопии изображения волокон кружилась от рекомбинантных белков TuSp1. А) На 500x увеличение, гладкий внешнийповерхности можно увидеть. B) На 5000x, плотное ядро интерьера можно наблюдать из натурального разрыва волокон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Синтетические волокна кружилась от этой методики механически того же порядка величины по сравнению с натуральными волокнами. Уменьшая количество человеческих ошибок по механизации буферизации и после процессов спин ничья, разница между экспериментальными образцами более контролируемой и значительно снижается.
Наша методика открывает новые возможности для исследования механических свойств других волокон, которые прядут из рекомбинантных белков, кодируемых с кДНК других членов семьи ген паука. Потенциально, это может определить механическую роль различных модулей белка в фиброина, или между различными типами фиброина 23. Он также позволяет проводить тестирование шелковых волокон, композиционных материалов, так как больше одного белка шелка или других молекул могут быть объединены или добавлены и вращается как белка смеси.
Это вращающийся методология представляет собой платформу для других лабораторий легко расширить при, так как сами этиratuses может быть построена в поверхностных образом. Это также позволяет регулировать параметры по каждому шагу, чтобы оптимизировать и настроить дизайн конкретных волокон с уникальными механическими свойствами. По мере необходимости для зеленых биоматериалов для будущего роста, эта методика может быть адаптирована для производства волокон, которые обслуживают множество приложений нового поколения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана NSF RUI Гранты MCB-0950372 и DMR-1105310 озаглавленной «Молекулярная характеристика паука Черная вдова шелка и механического поведения паука шелка клея", соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
