Summary
Örümcek ipek ve üstün mekanik özellikleri ve biyokimyasal rağmen, bu malzeme geleneksel yollarla, büyük miktarlarda hasat edilemez. Burada nesil Biyomalzeme olarak örümcek ipeği üretimi ve kullanımı eğitimi araştırmacılar için önemli bir süreç olan yapay örümcek ipeği lifleri, spin etkili bir strateji tanımlamak.
Abstract
Toplumun ilerlemesi ve kaynakları kıt hale geldikçe, yeni teknolojiler geliştirmek için giderek önem kazanmaktadır yüksek performans özellikleri ile mühendis nesil biyomalzemeler söyledi. Bu yeni yapı malzemeleri geliştirme maliyet-etkin, hızlı olması ve işleme yöntemleri ve çevre dostu ve sürdürülebilir ürünler içermesi gerekmektedir. Örümcekler biyomimikri rakip iyi suni ve doğal malzemeler için yeni nesil mühendislik malzemelerinin zengin bir kaynak sunan, çeşitli mekanik özellikleri ile farklı elyaf türleri çok sayıda dönerler. Doğal örümcek ipeği büyük miktarlarda toplanması pratik olduğundan, sentetik ipek üretimi konuları sınırsız kaynağı erişimi olan bilim adamları sağlamak yeteneğine sahiptir. Eğirme süreci akıcı ve mükemmel olabilir, bu nedenle, yapay örümcek lifler vücut zırhı uzanan geniş bir uygulama yelpazesi, cerrahi dikiş için kullanılabilme potansiyeline sahiptirs, halat ve kablolar, lastikler, müzik aletleri için dizeleri ve havacılık ve uzay teknolojisi için kompozitler. Sentetik ipek üretim süreci ilerletmek için ve döndürmek için Spin kendi malzeme özelliklerini, düşük varyans gösterilecek fiberler elde etmek amacıyla, bakteriler, saflaştırma ve protein konsantrasyonu rekombinant örümcek ipek proteinlerinin ifadesini entegre bir ıslak eğirme-protokolü geliştirilen , fiber ekstrüzyon ve mekanik bir post-sıkma işlemi takip. Bu bir laboratuar ölçekte suni ipek lifleri spin ve analiz etmek için bir adım adım süreci ortaya çıkarmaktadır ilk görsel sunumudur. Ayrıca aynı iplik uyuşturucu bükülmüş lifler arasında değişkenlik giriş aza indirmek için ayrıntılı bilgi sağlar. Topluca, bu yöntemler, doğal örümcek ipek aşan yüksek kalitede elyaf yol açan, suni ipek, üretim işlemi itmek olacaktır.
Introduction
Örümcek ipek yüksek gerilimli çelik, Kevlar ve naylon gibi çeşitli sentetik malzemelerin dışarı gerçekleştirir olağanüstü mekanik özelliklere sahiptir. 1 Örümcekler çeşitli mekanik özellikleri gösterilecek en az 6-7 farklı fiber türleri, çekme mukavemeti ve genişletilebilirlik değişen miktarlarda tasarlanmış her dönmeye özgül biyolojik görevleri gerçekleştirmek için. 2 Araştırma bilim adamları hızla Çünkü yamyamlık 3,4. nedeniyle üstün mekanik özellikleri, biyouyumlu ve bunların toksik olmayan ve yeşil-maddi doğanın nesil Biyomalzeme olarak örümcek ipekleri kullanımı ve takip edilir arachnids ve zehirli doğa, tarım yoluyla örümcek ipekleri hasat endüstriyel ölçekte üretim için gerekli talepleri karşılamak için pratik bir strateji değildir. Bu nedenle, bilim gelen sentetik liflerin iplik in vitro ile birleştiğinde transjenik organizmalarda rekombinant ipek protein üretimi yönelmiştirse saflaştırılmış protein. tam uzunlukta rekombinant örümcek ipek proteinleri 5-8 İfade onların oldukça tekrarlayıcı doğası ve fiziksel uzunluğu (> 15 kb) dahil kendi gen dizilerinin iç özellikleri, GC-zengin içerik verilen teknik olarak zor ve yanlı oldu alanin ve glisin kodon kullanımı. Bugüne kadar 9-11, en laboratuarları kısmi cDNA dizileri veya sentetik genleri kullanarak büyük ampullate ipek proteinleri MaSp1 veya MaSp2 ile kesilmiş formlar ifade üzerine odaklanmıştır. 12-15 İplik sentetik örümcek ipekleri gerektiren zorlu bir süreçtir çeşitli bilimsel disiplinler ve eğirme sürecinin inceliklerini ustalığı ve bilgisi tamamen Video gösterimi tarafından kamuoyuna ortaya konamamıştır. Aslında, dünya genelinde laboratuarları sadece bir avuç örümcek ipeği cDNAlarının ifade ipek proteinleri arındırmak, sentetik lifler dönmeye ve post-spin beraberlik gerçekleştirmek için uzmanlığa sahip ve daha sonra nihayet kendi biyomateryal özelliklerini incelemektedir. 8,Iplik, sentetik lifler için 16,17 Farklı yaklaşımlar, ıslak ve kuru eğirme gibi elektro yöntemleri kapsayan var 16,18,19 Tüm işlemler tek bir ortak amacı var -. Mekanik özelliklere sahip sentetik örümcek ipliği üreten bir protokolünün geliştirilmesi rakip doğal konuları Büyük ölçekli ticari üretim işlemleri için.
Burada bir ıslak eğirme yöntemi kullanarak bir laboratuar ölçekte yapay örümcek ipek üretmek için bir prosedür tanımlamaktır. Diğer eğirme yöntemleri ile karşılaştırıldığında, ıslak eğirme lif analizi için en tutarlı sonuçlar ortaya koymuştur. Onların saflaştırma takiben bakterilerde rekombinant ipek proteinleri, bir ifade ile, bu işlemi başlangıcından ana hatlarını ve sonra ile konuları verimleri "olarak-bükülmüş" lifler uygulanan bir post-sıkma çekme yöntemi de dahil olmak üzere, iplik için protein hazırlanması adımları tarif Doğal örümcek ipekleri kalitesi yaklaşmak malzeme özellikleri. Bizim methodology yakından ipek lifleri doğal eğirme süreci taklit etmek için tasarlanmıştır ve bu mimari ve Dahası küre ve koçanı-dokuma örümcekler. 20-22 gelen ipek üreten bezlerin fonksiyonu uzmanlığımız üzerine ağır çekiyor, biz gerekli ile sonuçlandırmak Araştırmacılar nihai gücü, nihai gerilme ve liflerin tokluk hesaplamak için izin gerilme-uzama eğrileri, çizmek için bir tensometre kullanarak sentetik malzeme özellikleri belirlemek için adımlar. Son olarak, ancak önemli değeri, iplik, biriktirme ve çizim aparatları oldukça karmaşık ve pahalı özel ekipman satın alma daha ticari parçalar kullanılarak ev inşa olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Grafik Bakış: İplik Sürecinin Biyomimikri
Doğal örümcek ipeği üretimi yolunun Biyomimikri:. Sentetik ipek üretimi için bir rota Bu görüntü altın küre dokumacı, Nephila clavipes ve doğal ipek üretimi (beyaz metin) için kullanılan bileşenlerinden büyük ampullate bezi gösterir. Kuyruk bölgesi ampulla, iplik uyuşturucu için bir depolama bölgeye taşınan ipek proteinleri büyük miktarlarda sentezler. Bu konsantre dope çözüm öncesinde lif ekstrüzyon için iyon değişimi ve dehidrasyon deneyimleri dönen kanal vasıtasıyla çekilmektedir. Laboratuarda kullanılan biomimetic süreçler kırmızı metin ile gösterilir. Rekombinant ipek üretim kromatografisi kullanılarak proteinin saflaştırılması ile takip transjenik bakteriler, kullanarak üretilir. Sonra, saflaştırılmış proteini alt konumundadırmateryal konsantre liyofilizasyon tabidir. Son olarak, protein HFIP içerisinde yeniden çözündürüldü ve bir izopropanol banyosu içinde, bir şırınga iğneden ekstrüde edilir.
1. Plazmid İnşaat ve Bakteriyel Hücre Kültürü Hazırlama
- İstediğiniz örümcek ipeği cDNA ve özel primer setleri kullanılarak PCR gerçekleştirin. Gel-özü ve bir prokaryotik açıklama vektörü örneğin pBAD / TOPO ThioFusion (Şekil 1A) içine amplifiye cDNA ligate. Bu vektör, ipek proteini çözünürleşme ve proteinin saflaştırılması için onun-etiketi, bir C-terminali 6x kolaylaştırmak için bir N-terminal tiyoredoksin etiketi sahiptir. Yetkili E. içine ligasyon ürünleri Transform coli hücreleri.
- Rekombinant klonlama vektörü içerebilir ve ampisilin (Şekil 1B) ile desteklenmiş LB steril 200 mL aşılamak için bir koloni kullanımı koloniler seçmek. 37 orbital inkübatörde 200 rpm sallayarak doygunluk gecede bu kültürü büyümeye ° C
- Saturat ve 200 mL Kombinetaze LB kültürünün 800 mL ed kültürü. % 0.2 arabinoz (w / v) eklenerek 4 saat süreyle örümcek ipek proteini ifade indüklemek. Antibiyotik seçimi altında kültür tutmak emin olun.
- 4 ° C (Şekil 1C) 10 dakika boyunca 16.000 g'de pelet hücreleri. Bir kap içinde Basitlik için, pelet bütün hacim. Çoklu santrifüjleme adımları santrifüj tüpü hacmi kapasitesine bağlı olarak gerekli olabilir. Gerekirse, eğirme ve tekrar topak ek malzeme pelet bir konteyner olup tüm hücre sağlamak için sonra boşaltmak sıvı hacmi. Gerekli ° C ye kadar Hücre pelletleri -80 saklanabilir.
- Harcanan kültür ortamları atmadan önce, çamaşır suyu ekleyin veya sterilize otoklavlama.
2. Hücre Lizis
- 1 L hücre peleti için 1x lizis tamponu (Şek. 2A) ve 20 ml ilave edilir. Tamamen hücre pelletini emin olun.
- Daha da geliştirmek için 1 mg / mL bir konsantrasyona lizozim eklemehücre parçalanması. DNase da eriyiğinin viskozitesinin azaltmak için kromozomal DNA sindirimi Bu basamakta ilave edilebilir. Bir çalkalamalı örnek yerleştirin ve yavaşça 20 dakika sallayın.
- 1 dakika boyunca en az bir çözüm sonikasyon.
- 4 azından 10 dakika süreyle 16,000 x g'de çözeltisi, santrifüj netleştirmek için ° C (Şek. 2B).
3. Protein Saflaştırılması: Ni-NTA Affinity Kolon Kromatografisi
- Süpernatantı ve temiz bir 25 ml kromatografi kolonu içine aktarın. Süpernatant olmayan viskoz ve temiz olduğundan emin olun. Çözüm viskoz ve bulutlu değilse, daha fazla DNaz veya sonikasyon ve / veya yeniden pelet supernatant (adımları tekrar 2,3-2,4) ekleyin.
- Sütuna Ni-NTA bulamaç (0.5 mL boncuklar) ve 1 ml ilave edilir. Kapağını sıkıca ve stopcock güvenli ve daha sonra Ni-NTA boncuklar (Şekil 3A) onun etiketi 6x bağlayıcı izin 1 saat dengelemek için bir rocker ayarlanır.
- Bir dik sütun ayarlayındurmak ve Ni-NTA boncuklar yaklaşık 2 dakika boyunca yerleşmek için izin verir. Boncuklar tamamen yerleşmiş zaman bir açık mavi katmanı altındaki görülebilir.
- Kapağı çıkarın ve çözüm vananızı dolaşmasını sağlar. Daha fazla analiz (Şekil 3B) için bu çözelti Collect.
- Yıkama tamponu 1x 20 ml ilave edilir ve boncuklar getirilmesi için olanak sağlar. Stopcock açın ve çözüm dolaşmasını sağlar. Daha fazla analiz için dört adet 5 mL alikots içinde bu çözüm Collect Not: Ek yıkama hacimleri kirletici proteinleri azaltmak için kullanılabilir, ancak, nihai protein verimi bir azalma ihtimali vardır..
- 1x işlem tampon maddesi 20 ml ilave edilir ve reçine getirilmesi için olanak sağlar. Stopcock açın ve çözüm dolaşmasını sağlar. Daha fazla analiz için dört 5 ml bu çözümün toplayın. Not: elüsyon tamamlanmaması halinde Ek elüsyon hacimleri Ni-NTA reçine elde edilebilir.
- Örnekleri 4 saklanabilir° C veya -80 ° C, kısa veya uzun süreli depolama için sırasıyla.
- SDS-PAGE analizi kullanılarak Boyut-damıtmak örnekleri. Gümüş veya Coomassie Brillant Blue R-250 (Şekil 3C) ile proteinler gözünüzde canlandırın. Sadece Saf fraksiyonlar aşağıdaki adımları için kullanılmalıdır. Not: Western blot analizi saflaştırılmış protein kimliğini teyit etmek için kullanılabilir.
4. Diyaliz ve Liyofilizasyon
- 2 gün için en az 100 kat örnek hacmi (deiyonize su kullanan) karşı örnekleri Dialyze. Tüm tuzları uzaklaştırmak için su çözeltisi 6 saatte değiştirme Not:. Diyaliz boru moleküler ağırlığı boyutu cut-off rekombinant ipek protein büyüklüğüne bağlıdır.
- Altı 1.5 mL boş mikrofuge'de tüpler tartılır ve onların kitleler kaydedin. Öncesinde (Şekil 4A) liyofilizasyon kolaylaştırmak için kurutma dondurma için tartım için tüplerin kapakları üzerinde ponksiyon küçük delik veya yarıklar yararlı olabilir.
- After diyaliz, 6, ön-tartımlı mikrofüj tüpler (Şekil 4B) her birine diyalizlenmiş numunenin transferi 1 mL. Flaş sıvı azot kullanılarak dondurma ve dondurarak kurutma (Şekil 4C) kullanarak aşağı örnekleri kurulayın.
- Kuruduktan sonra, altı tüplerin her biri içine diyaliz numunenin başka bir 1 ml transfer. Tüm diyaliz örnek mikrofuge'de tüpler aşağı kuruduktan kadar tekrarlayın.
- Dondurarak kurutulmuş örnekleri -80 ° C'de uzun süreli depolama için saklanabilir.
5.. Dope Hazırlık İplik
- Kurutulmuş protein tozu içeren mikrofüj tüpler her tartılır. Toplam kuru protein kitlesi elde etmek için boş tüplerin başlangıç kütlesi çıkarın Not:. Protein verimi bağlı olarak, eğirme işlemi için ek malzeme arındırmak için gerekebilir.
- 200 mg / mL ila 500 mg / ml,% 20 veya% 50 hacim başına ağırlık elde etmek için, her tüpe eklemek heksafloroizopropanol (HFIP) hacmini. Appropri ekleHer bir tüp (Şekil 4D) içine HFIP miktarı yedik. Not: HFIP dikkatle, pipet çok uçucu ve zehirli olduğu ve en kısa zamanda tüp kap. HFIP bir güvenlik başlık altında ele alınmalıdır.
- Protein çözünür bir rocker tüpler ve yer parafilm. Vortex ve santrifüj bazen çözünürleştirme kolaylaştırmak için. Bu 2 gün kadar sürebilir.
6. Şırınga Hazırlık ve Cihazlar Kurulum
- Şırıngaya çözülmüş iplik dope en az 25 uL yerleştirin. . O şırınga tıkayabilir diye agrega sunmak Not olmadığından emin olun: pipetleme Bu örnek inanılmaz viskoz, bu konuda dikkatli.
- Tüm hava kabarcıkları (Şekil 5A) çıkarırken, dikey şırınga önüne uyuşturucu itin. Not: Hava kabarcıkları lif tutarsızlıkları oluşturun.
- Pompaya şırınga kilitleyin. % 95 izopropanol kadar ile doldurulmuş bir 400 mL beher yükseltmek şekilde şırınganın ucuSadece alkol yüzeyi (Şekil 5B) kırılıncaya.
- 15 uL / dk şırınga pompası ayarlayın ve programı başlatın. . 20 dakika boyunca, izopropanol içinde oturmak olarak bükülmüş-fiber tamamen Not dengelenmesi için izin: Bu fiberler, lifler proteinlerin kimliğini teyit etmek için MS / MS analizi ile kullanılabilir.
7. Post-Spin Draw ve Örnek Toplama
- Biriktirme cihazda tarak her iki tarafına çift taraflı bant uygulayın. Biriktirme aygıtı yapıştırma metal taraklar bir dijital kumpas (Şekil 6A) oluşturuldu. (Şekil 6B) bir motor için biriktirme aygıt takın. Biz 2 devirde konuları biriktirme öneririz. Not: lif kalite ve verimliliğine varyasyon büyük miktarlarda hızlı biriktirme oranları sonucu.
- Forseps kullanılarak yavaşça fiberin bir ucu al ve yavaş makara üzerine tarak kolundan birine kenarına takılarak, izopropanol çıkarın (Şek. 6C). Bir sonraki adım birkaç kurumasını önlemek için bir elyaf Kesintisiz yapılmalıdır.
- Motor açın ve hafifçe biriktirme aygıtı Not üzerine fiber yol:. Biriktirme sırasında, lif bölüşmek ve birbirlerinin üstüne yığılmasına izin vermeyin.
- Bir kez tüm fiber biriktirilir edilir, motor kuyruk ayırmak ve çift taraflı bant üzerindeki her bir ipek lif kenar (Şekil 6D) yapıştırıcı uygulanır. Bu cihaz üzerine örümcek ipek hızlandırır. Not: önceden post-sıkma çekme üzere çift taraflı yapışkan bant uygulama olarak, bu kaymasını engeller ve tüm fiber kompas içindeki liflerin iç bölümleri arasında uzanan seçici sağlar kollar.
- Doğrusal harekete geçirici (Şekil 7A) biriktirme takın. Kompas kullanılarak liflerin başlangıç uzunluğu kaydetmek Bu fiber uzunluğu, iç olduğunu not edin;. Bu yapıştırılmış uzunluğu vardır ve ar sarılmış gelmezmakara ound.
- % 75 izopropanol banyoya biriktirme indirin. . Fiberler 10 dakika için Not dengelenmesi için izin: Diğer dehidrasyon çözümler, örneğin metanol, aseton ve amonyum sülfat gibi, bükme süreci için de kullanılabilir.
- 1.5 mm / sn lineer aktüatör hız ayarlayın. İlk uzunluğuna bağlı olarak, arzu edilen post-sıkma çekme oranına için nihai uzunluğu hesaplamak. Gerilmiş miktarda set bağlı olarak, hız veya uzunluğuna bağlı olarak kontrol edilebilir. Örneğin, 15 mm'lik ve 3x istenen bir post-sıkma çekme oranı, bir başlangıç uzaklığı ile, nihai uzunluğu 45 mm olmalıdır. Bu, aynı zamanda 1,5 mm / saniye arasında bir oranda 20 saniye boyunca doğrusal harekete geçirici güç olarak hesaplanabilir.
- İstediğiniz sonradan dönüş berabere tamamlandıktan sonra, yavaş yavaş izopropanol kuyruk dışarı kaldırın. Izopropanol damlacıkları 1 dakika kurumasını bekleyin ve sonra numuneler (Şekil 7B) toplamak. Örnekler pur test için kartlar veya folyo kasalarına monte edilmelidiroluşturmaktadır.
- Daha sonrası dönüş çekme oranları istenirse,% 75 izopropanol banyoya biriktirme geri indirin. Lifleri 10 dakika dengeye ve ardından sonraki sonrası sıkma çekme oranına geçmek için izin verin.
8. Çekme Test
- Toplanan örneklerin mekanik test önce en az 1 saat, standart laboratuar ortamında denge sağlaması için bekletin. Onlar fiber mekanik özellikleri etkileyebilir gibi nem ve sıcaklık kaydedilmelidir. Standart sıcaklık ve nem koşulları, sırasıyla, yaklaşık% 40 ile 25 ° C olmalıdır.
- Tutkal kartlar veya folyo kenarlarına çerçeve üzerinde fiber sabitlemek için. Frame of açıklığını de not edin. Bu test fiber ilk uzunluğudur. A 1 inç (25.4 mm) açılış kare (Şekil 8A) burada gösterilir.
- Bir 100x veya daha fazla büyütme ile ışık mikroskobu kullanarak, uzunlamasına lif ekseni boyunca çapı ölçüm yapmaktadır.En az 3 ölçümleri kaydedilmelidir. Yüksek büyütmede kullanılan ve daha ölçümler, daha doğru çekilen.
- Bir tensometre mekanik yükleme çerçevesi (Şekil 8B) için çerçeve sabitleyin. Gerginliği sadece lif aracılığıyla çalışan bu nedenle her iki tarafında çerçeve kesilir. Dara tensometre ve veri toplamak. Saniyede% 2 standart bir gerginlik oranı tavsiye edilir.
- Toplanan veriler ve ortalama çapı kullanılarak, bir stres gerilme eğrisi çizilebilir.
- Kırık lif şimdi morfolojik analizler ve kırılma noktası çap ölçümleri için taramalı elektron mikroskobu (SEM) saplama monte edilebilir. Uzağa kırılma noktası gelen fiber segmenti ışık mikroskobu ile ölçülen başlangıç çapı hesaplamak ve kontrol etmek için kullanılabilir.
9. Temsilcisi Sonuçlar
3. adımdan itibaren, farklı fraksiyonları SDS-PAGE analizi ile analiz edilmelidir ve proteinler gümüş ile görüntülendiveya Coomassie Brillant Blue R-250. Standart bir Ni-NTA kolon koşullarından,>% 90 saflıkta elüsyon fraksiyonlar (Şekil 9) elde edilebilir. Küçük tehlike proteinler daha kapsamlı diyaliz ile uzaklaştırılabilir. % 20 (w / v) azından dope iplik 25 uL kullanılarak, en az 30 ayrı bir fiber örnekleri kuyruk (başlangıç 13 mm uzunluk kullanılır varsayılmaktadır) üzerine sürekli yara fiber elde edilebilir. Mekanik özellikleri tensometre testler (Şekil 10) ile analiz edilebilir. Bükme süreci için kullanılan rekombinant ipek proteini bağlı olarak, maksimum sonrası sıkma çekme oranları ampirik olarak tespit edilmesi gerekir. Genel olarak, dönme 4.0x oranları çizmek göndermek fiber yetmezliği (Şekil 10) olarak elde edilebilir. Spun lifler, Spin berabere önce veya sonra, ince görselleştirmek için taramalı elektron mikroskobu (Şekil 11A, B) ile analiz edilebilir. Spun lifler de sonuçları görüntüleniyor, mekanik test için kullanılabilirbir mesaj sıkma çekme oranına örnek grubu içinde düşük varyasyon (Şekil 10).
Şekil 1. Bakterilerde cDNA örümcek ipeği anlatımı. A) ilgi cDNA örümcek ipeği içeren pBAD TOPO / Thio vektör yetkili E. dönüşür coli hücreleri. B) Tek bir koloni LB 200 ml inoküle ve geceleme doygunluk yetişir. Aşılanmasını takiben, taze LB 800 ml ilave edilir ve kültür arabinoz kullanılarak ifadesi için indüklenir. C) indüksiyon sonunda, kültür santrifüj pelet olduğunu. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2. Örümcek ipek proteini indüksiyon sonrası bakteri hücrelerinin Lizis. A) Yirmi millili1x lizis tamponu ve DNaz ile ters hücre pelletini eklenir ve bir çalkalamalı yerleştirilir ve akyuvarlar için sonicated edilir. B) hücre lizatı hücresel enkaz supernatant temizlemek için bir santrifüj eğirilir ve supernatant toplanır. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3. Afinite kromatografisi örümcek ipeği rekombinant proteinlerin saflaştırılması. A) hücre lizatı süpernatan ve Ni-NTA boncuklar bir kromatografi kolonuna eklenmiş ve 1 saat için inkübe edilmiştir. Flowthrough toplandıktan sonra B), yıkama tamponu ile elüsyon tamponuyla 20 mL, 20 mL dizisi kullanılabilir ve 5 mL fraksiyon toplandı. C) farklı fraksiyonlar SDS-PAGE ile analiz edilmiştir; hedef protein ihtiva eden saf örnekleri, diyaliz torbası aktarılır ve DI suya karşı diyaliz edilmiştirtamamlanması. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Islak eğirtilmesi için saflaştırılmış örümcek ipek proteini hazırlanması. A) diyalizlenmiş ürün 1 mL alikots içinde ön-tartımlı santrifüj tüpü transfer edilir. B) 1 mL alikotlar sıvı nitrojen ile dondurularak flaş edilir. C) dondurulmuş örnekleri liyofilize edilir ve daha diyaliz örnek eklenir. D) Kurutulmuş kütlesi hesaplanır ve HFIP% 20 (w / v) iplik dope üretmek için kuru toz eklenir. daha büyük Şekil görüntülemek için .
Şekil 5. Islak sıvama cam şırınga içine iplik Uyuşturucunun yükleniyor. A) syrin tutarkenge dikey, iplik uyuşturucu hava kabarcıkları çıkarırken, şırınga sütunun üstüne itilir. B) yüklendi şırınga şırınga pompası eklenmiş ve ucu sadece banyosunun yüzeyi kırılıncaya kadar% 95 izopropanol banyosu içine indirilir.
Şekil 6. Özel bir çile aygıtına sentetik örümcek ipeği lifleri Sargı. A) biriktirme cihazı takılı metal taraklar ile dijital kumpas inşa edilmiştir. Çift taraflı bant fiber uçları takmak için tarak her iki tarafa da uygulanır. B), bir makara Krokodilli kullanarak düşük hızda motora bağlanmıştır. C) yavaşça fiber alkol banyosundan çekilen ve makara etrafına sarılır. D) Tutkal bunların yerine tutmak için her bir fiber parçasının kenarına uygulanır. Gösterilen farklı proteinler bükülmüş iki farklı elyaflar bulunmaktadır.
Şekil 7. Mesaj-spin ev yapımı bir aparat kullanarak sentetik çizin. A) biriktirme aygıtı timsah klipler kullanarak lineer aktüatör kurulum eklenir. B) Bir mesaja dönüş beraberlik adım sonra, makara banyosundan kaldırılır. İzopropanol damlacıkları elyaf toplama önce buharlaşmasına izin verilir.
Şekil 8. Mekanik çalışmalar için bir kart üzerine sentetik ipek lifleri Montajı. A) Toplanan lifler 1 "x 1" sigortası ile kartlar kasalarına monte edilir. Lifleri başlangıçta çift taraflı bant ile yerinde tutulur ve sonra yapıştırıcı ile sabitlenir. B) kartlar çerçeve tensometre sabitlenir. Gerginliği tek lifli olsa çalıştıran böylece iki sonra kesilir.
Şekil 9. Boyut fraksiyon rekombinant MaSp1 protei saflaştırılmışn SDS-PAGE analizi kullanarak kesirler gümüş boyama ile görselleştirme izledi. Protein merdiven kDa tasvir edilir. Elüsyon örnekleri toplam protein kurtarma sağlamak için 6 koleksiyon ihtiyacı ortaya ise iki yıkama örnekleri, boncuklar üzere spesifik olmayan bağlanma göstermektedir.
Liflerin Şekil 10. Stres uzama eğrileri rekombinant TuSp1 proteinlerden döndü. 8 Renk 2.5x den 6x kadar farklı sonrası dönüş çekme oranları, tabi tutulmuştur lifleri göstermektedir. Lifler, bunların oranının grup içindeki düşük varyasyonu göstermektedir; genişletilebilirliği azalmış iken sonrası sıkma çekme oranı arttıkça, lif mukavemeti artmaktadır.
Şekil 11. TuSp1 rekombinant proteinleri bükülmüş liflerin elektron mikroskobu görüntü tarama. A) 500x büyütmede, pürüzsüz dışYüzey görülebilir. B) 5000X anda, yoğun bir iç elyaf doğal bir mola gelen görülebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu metodoloji bükülmüş Sentetik elyaflar doğal liflerle karşılaştırıldığında aynı büyüklük sırasına mekanik vardır. Biriktirme ve sonrası dönüş beraberlik süreçleri makineleşme ile insan hatası miktarını azaltarak, numuneler arasındaki deneysel varyasyon daha kontrollü ve büyük ölçüde azaltılmış bulunmaktadır.
Bizim metodoloji örümcek gen ailesinin diğer üyelerinin cDNAlarının gelen kodlanmış rekombinant proteinler bükülmüş olan diğer liflerin mekanik özellikleri araştırmak için potansiyel sunmaktadır. Potansiyel olarak, bir fibroin içinde, ya da farklı türleri arasında farklı fibroin proteini modüllerinin mekanik bir rol belirleyebilir. 23 birden fazla ipek proteini ya da diğer moleküllerin kombine ya da eklenebilir olarak aynı zamanda, kompozit ipek liflerin test edilmesine olanak ve bir protein karışımı olarak bükülmüş.
Bu iplik metodoloji aparat gibi, kolayca üzerine genişletmek için diğer laboratuvarlar için bir platformratuses, basit bir şekilde inşa edilebilir. Bu, aynı zamanda tek mekanik özelliklere sahip belirli bir lif tasarım optimize ya özelleştirmek için her adım boyunca parametrelerini ayarlayarak sağlar. Gelecekte artar yeşil biyomalzemeler ihtiyacı gibi, bu yöntem uygulamaları nesil bir dizi servis elyafları üretmek için adapte edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, sırasıyla NSF RUI Hibeler MCB-0950372 ve DMR-1105310 başlıklı "Black Widow Spider ipek ve Spider Tutkal Silks Mekanik Davranışı Moleküler Karakterizasyonu" tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pBAD/TOPO ThioFusion Expression Kit | Invitrogen | K370-01 | |
| FastBreak Cell Lysis Reagent, 10x | Promega | V857C | |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30210 | Includes instructions for buffers |
| ProteoSilver Silver Stain Kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1-1KT | |
| FreeZone Lyophilizer | Labconco | 7960041 | FreeZone 12Plus |
| Hexafluoroisopropanol (HFIP) | Sigma-Aldrich | 52512 | |
| Syringe | Hamilton | 7657-01 | 250 μL |
| Needle | Hamilton | 7780-01 | 26s Gauge, Blunt end removable needle |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | 11Plus |
| Digital Caliper | Carrera | CP5906 | 0-150 mm range |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Motor | Nature Mill | 7090529 | 12VDC, 2 rpm speed |
| Linear Actuator | Warner Electric | 01-D024-0050-A06-LP-IP65 | 24VDC, 6 inch range |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software: Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | |
| Microtensometer | Aurora Scientific | 310C | 5N Dual-Mode System |
References
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J. Exp. Biol. 202, 3295-3303 (1999).
- Foelix, R. Biology of spiders. , Oxford University Press. New York. (1996).
- Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid crystalline spinning of spider silk. Nature. 410, 541-548 (2001).
- Spiess, K., Lammel, A., Scheibel, T. Recombinant spider silk proteins for applications in biomaterials. Macromol. Biosci. 10, 998-1007 (2010).
- Stark, M., Grip, S., Rising, A., Hedhammar, M., Engstrom, W., Hjalm, G., Johansson, J. Macroscopic fibers self-assembled from recombinant miniature spider silk proteins. Biomacromolecules. 8, 1695-1701 (2007).
- Lazaris, A., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider Silk Fibers Spun from Soluble Recombinant Silk Produced in Mammalian Cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Teule, F., Cooper, A. R., Furin, W. A., Bittencourt, D., Rech, E. L., Brooks, A., Lewis, R. V. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat. Protoc. 4, 341-355 (2009).
- Gnesa, E., Hsia, Y., Yarger, J. L., Weber, W., Lin-Cereghino, J., Lin-Cereghino, G., Tang, S., Agari, K., Vierra, C. Conserved C-Terminal Domain of Spider Tubuliform Spidroin 1 Contributes to Extensibility in Synthetic Fibers. Biomacromolecules. , (2011).
- Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int. J. Biol. Macromol. 24, 271-275 (1999).
- Xu, M., Lewis, R. V. Structure of a protein superfiber: Spider Dragline Silk. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7124 (1990).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. Molecular and mechanical characterization of aciniform silk: uniformity of iterated sequence modules in a novel member of the spider silk fibroin gene family. Mol. Biol. Evol. 21, 1950-1959 (2004).
- Lazaris, A., Arcidiacono, S., Huang, Y., Zhou, J. F., Duguay, F., Chretien, N., Welsh, E. A., Soares, J. W., Karatzas, C. N. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295, 472-476 (2002).
- Arcidiacono, S., Mello, C., Kaplan, D., Cheley, S., Bayley, H. Purification and characterization of recombinant spider silk expressed in Escherichia coli. Appl. Microbiol. Biotechnol. 49, 31-38 (1998).
- Menassa, R., Zhu, H., Karatzas, C. N., Lazaris, A., Richman, A., Brandle, J. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: accumulation and field production. Plant Biotechnology Journal. 2, 431-438 (2004).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nat. Biotechnol. 19, 573-577 (2001).
- An, B., Hinman, M. B., Holland, G. P., Yarger, J. L., Lewis, R. V. Inducing beta-sheets formation in synthetic spider silk fibers by aqueous post-spin stretching. Biomacromolecules. 12, 2375-2381 (2011).
- Elices, M., Guinea, G. V., Plaza, G. R., Karatzas, C., Riekel, C., Agullo-Rueda, F., Daza, R., Perez-Rigueiro, J. Bioinspired Fibers Follow the Track of Natural Spider Silk. Macromolecules. 44, 1166-1176 (2011).
- Scheller, J., Guhrs, K. H., Grosse, F., Conrad, U. Production of spider silk proteins in tobacco and potato. Nature Biotechnology. 19, (2001).
- Kojic, N., Kojic, M., Gudlavalleti, S., McKinley, G. Solvent removal during synthetic and Nephila fiber spinning. Biomacromolecules. 5, 1698-1707 (2004).
- Jeffery, F., La Mattina, C., Tuton-Blasingame, T., Hsia, Y., Gnesa, E., Zhao, L. Microdissection of Black Widow Spider Silk-producing Glands. J. Vis. Exp. (47), e2382 (2011).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L., Falick, A. M., Zhao, L., Fong, J., Vaidyanathan, V., Visperas, A., Geurts, P., Hu, X., La Mattina, C., Vierra, C. Pyriform spidroin 1, a novel member of the silk gene family that anchors dragline silk fibers in attachment discs of the black widow spider, Latrodectus hesperus. J. Biol. Chem. 284, 29097-29108 (2009).
- La Mattina, C., Reza, R., Hu, X., Falick, A. M., Vasanthavada, K., McNary, S., Yee, R., Vierra, C. A. Spider minor ampullate silk proteins are constituents of prey wrapping silk in the cob weaver Latrodectus hesperus. Biochemistry. 47, 4692-4700 (2008).
- Hsia, Y., Gnesa, E., Jeffery, F., Tang, S., Vierra, C. Spider Silk Composites and Applications. Metal, Ceramic and Polymeric Composites for Various Uses. Cuppoletti, J. 2, InTech. 303-324 (2011).
