Summary
Dans ce protocole, nous allons montrer comment construire des chambres personnalisées qui permettent l'application d'un champ électrique à courant continu pour permettre imagerie time-lapse de cerveau adulte dérivé de neurones translocation cellule précurseur pendant galvanotaxie.
Abstract
La découverte des cellules souches et des cellules progénitrices neurales (collectivement appelées cellules précurseurs neurales) (PNJ) dans le cerveau des mammifères adultes a conduit à un ensemble de recherches visant à utiliser les propriétés multipotentes et de prolifération de ces cellules pour le développement de stratégies neuroregenerative. Une étape cruciale pour le succès de ces stratégies est la mobilisation des PNJ vers un site de lésion consécutive à une transplantation ou exogène pour améliorer la réponse des précurseurs endogènes que l'on trouve dans la région périventriculaire du système nerveux central. Par conséquent, il est essentiel de comprendre les mécanismes qui favorisent, d'orienter et d'améliorer la migration PNJ. Notre travail se concentre sur l'utilisation du courant continu champs électriques (dcEFs) de promouvoir et de migration directe PNJ - un phénomène connu sous le nom galvanotaxie. Endogènes physiologiques des champs électriques fonctionnent comme des repères essentiels pour la migration cellulaire au cours du développement normal et la cicatrisation des plaies. La perturbation pharmacologique dutension du tube neural chez trans-embryons axolotl provoque de graves malformations du développement 1. Dans le contexte de la cicatrisation, le taux de réparation de la cornée blessés est directement corrélée à l'ampleur du potentiel de blessure épithéliale qui se pose après une blessure, comme le montre l'amélioration pharmacologique ou l'interruption de ce dCEF 2-3. Nous avons démontré que les adultes subissent PNJ sous-épendymaires rapide et dirigé la migration cathodique in vitro lorsqu'elles sont exposées à un dCEF appliqué de l'extérieur. Dans ce protocole, nous allons décrire les techniques de notre laboratoire pour la création d'un test galvanotaxie simple et efficace à haute résolution, observation à long terme de la translocation de cellule du corps dirigé (migration) sur un seul niveau de cellules. Ce test serait approprié pour étudier les mécanismes qui régulent la transduction dCEF dans la motilité cellulaire grâce à l'utilisation de souris transgéniques ou knock-out, courts ARN interférents ou des agonistes / antagonistes des récepteurs spécifiques.
Protocol
Toutes les procédures impliquant la manipulation des animaux ont été approuvés par l'Université de Toronto Comité de protection des animaux, conformément aux directives institutionnelles (protocole n °. 20009387). Les méthodes suivantes doivent être effectuées à l'aide des outils et des techniques stériles, dans une hotte à flux laminaire, le cas échéant.
Dans le texte du protocole ci-dessous, l'expression «EFH-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec facteur de croissance épidermique, le facteur de croissance des fibroblastes et l'héparine. EFH-SFM est utilisé lorsqu'il examine la galvanotaxie de PNJ indifférenciées parce que ces mitogènes maintenir PNJ dans leur 4 état indifférencié. Lorsque l'on étudie la galvanotaxie de PNJ induites à se différencier en types de cellules matures, "FBS-SFM» se réfère à un milieu sans sérum supplémenté avec 1% de sérum de veau foetal. FBS favorise la différenciation des PNJ dans les phénotypes neuraux matures 5.
1. Isolement et culture des précurseurs neuronaux (Nonmontré dans la vidéo)
- Anesthésier la souris CD1 (6-8 semaines) avec isofluorane et le sacrifice par dislocation cervicale.
- Arrosez la tête dans l'éthanol à 70% et décapiter l'animal avec des ciseaux pointus dissection.
- Tout en maintenant la tête avec une pince chirurgicale, enlever la peau sur la surface dorsale pour exposer le crâne.
- L'aide d'un scalpel et non. 11 lames, marquer le crâne au niveau du sinus frontal dans l'axe médio-latéral, et aussi le long de la suture sagittale dans le sens rostro-caudal.
- Peler les os pariétaux loin de la tête sans. 7 pinces courbes, en prenant soin de ne pas percer le tissu cérébral.
- Insérez une spatule mince en dessous du cerveau à partir de sous le cervelet et avancer vers les bulbes olfactifs. Tout en tenant le crâne en place avec une pince, tirez doucement sur le cerveau du crâne et placez-la immédiatement dans de la glace-froid liquide céphalo-rachidien artificiel (voir les recettes ci-dessous).
- Sous un microscope de dissection, en utilisant stériledes ciseaux et des pinces à dissection couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane. Tournez chaque hémisphère de sorte que la médiane (couper) la surface orientée vers le haut.
- Sélectionnez un hémisphère, et avec la surface interne tournée vers le haut, localisez le bourrelet du corps calleux (région postérieure du corps calleux).
- Faire une incision de la surface du cortex pour le bourrelet du corps calleux long de l'axe dorso-ventral.
- Peler le cortex incisée vers le bulbe olfactif pour exposer les parois médiale et latérale du ventricule latéral.
- Tournez l'hémisphère sorte que la surface dorsale orientée vers le haut, et l'utilisation microciseaux courbes à découper et à recueillir les murs exposés médial et latéral, qui contiennent la région périventriculaire où résident les PNJ 6.
- Répétez les étapes 1.8 à 1.11 pour l'autre hémisphère.
- Pipeter le tissu isolé dans 7 ml de solution de trypsine (voir recette ci-dessous) dans un tube de 15 ml, et placer le tube sur une bascule dans un 37 ° Cincubateur pendant 25 min.
- Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension le tissu dans 2 ml de solution d'inhibiteur de trypsine (voir recette ci-dessous).
- Doucement triturer le tissu avec un petit trou de forage pipette Pasteur 30-50 fois avec soin pour éviter les bulles d'air.
- Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 5 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1-2 ml de GDF (voir recette ci-dessous) en triturant le culot 3-5 fois.
- Centrifuger le tube à 1500 tours par minute pendant 3 minutes, aspirer le surnageant et remettre en suspension dans 1 ml de GDF + EFH.
- Comptez vivre densité cellulaire avec un hémocytomètre et la plaque des cellules dans un flacon T25 culture à une densité de 10 cellules par ml dans GDF + EFH.
- Permettre à la culture de se développer pendant 7 jours non perturbées pour produire flottants neurosphères primaires composées de PNJ.
2. Galvanotaxie Chambre Préparation
- Placez verre 3 carrés non. 1 lamelles (22 x 22 x 0,17 mm) ina bouteille d'acide chlorhydrique 6N pendant la nuit.
- Le lendemain, utilisez un diamant à pointe de verre cutter pour couper 6 bandes rectangulaires (22 x 5 x 0,17 mm) de verre à partir de carré. 1 lamelles.
- Transférez les bordereaux lavés à l'acide carrés et rectangulaires glisse dans une hotte à flux laminaire. Laver les barrettes rectangulaires et carrées d'abord avec l'éthanol à 70%, puis avec la culture de tissus de qualité de l'eau en autoclave, et laisser sécher sur une Kim Wipe (pour la stérilité ajouté, le verre peut être autorisé à air sec).
- Appliquer de la graisse à vide à la périphérie d'une surface des lames de verre carrés, et les sceller à la base de boîtes de 60 mm de Pétri en plastique.
- Appliquer de la graisse à vide le long de l'axe long d'une surface de la bande de verre rectangulaires, et les sceller aux bords opposés de la lame de verre carrés (de telle sorte qu'ils soient parallèles les unes aux autres), afin de créer un creux central.
- UV-stériliser les chambres pendant au moins 15 min dans la hotte à flux laminaire.
- Pipette 250-300 ul de poly-L-Lysine sur la cuvette centrale des chambres et incuber à température ambiante pendant 2 heures.
- Environ 15 min avant la fin de la période d'incubation, préparer la solution de Matrigel (voir recette ci-dessous).
- Aspirer le poly-L-lysine, se laver les bacs centrales avec 1 ml d'eau autoclave, et la pipette 250-300 ul de solution de Matrigel sur les creux central.
- Incuber les chambres à 37 ° C pendant 1 heure.
- Aspirer la solution de Matrigel et laver délicatement les creux central avec 1-2 ml de GDF.
- Pipette 100 ul d'EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central et transférer les chambres galvanotaxie sur la scène d'un comptage au microscope.
- Pipette 3-4 ml de la culture contenant de neurosphères dans une boîte de Petri de 60 mm et transférer la boîte de Pétri à l'étape de comptage au microscope.
- Un objectif de vision de 5x, utiliser une pipette P10 pour transférer 5-8 neurosphères entiers (jusqu'à quatre à la fois) sur la cuvette centrale de chaque galvanotaxiechambre sans les dissocier, et soigneusement répartis les neurosphères autour de la cuvette centrale, sans perturber le substrat Matrigel.
- Ajouter un supplément de 150 à 200 pi d'EFH-GDF ou FBS-GDF sur les creux central.
- Transférez les chambres galvanotaxie dans un 37 ° C, 5% de CO 2, 100% incubateur humidifié pour 17-20 heures (si l'analyse PNJ indifférenciées) pour permettre à l'neurosphères à adhérer au substrat Matrigel et se dissocier en cellules individuelles comme le montre la figure 1 . Si l'analyse de PNJ différenciés, la période d'incubation devrait être étendu aux 69-72 h pour permettre la différenciation des cellules.
3. Vivez cellulaire imagerie time-lapse
- Permettre au système d'imagerie de cellules vivantes s'équilibrer à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant au moins 30 minutes avant le début de l'enregistrement time-lapse.
- Coupez deux 12 pièces de 1 cm de diamètre mm Argent fil, bobine eux d'un bout, et les placer dans Clorox blixiviation pendant 20 min pour former électrodes Ag / AgCl.
- Transférez les chambres galvanotaxie sur la scène d'un comptage au microscope et sélectionnez cette chambre sera utilisé pour des cellules vivantes analyse de la migration d'imagerie basée sur les critères suivants: i) les neurosphères devrait être presque complètement dissocié dans des cellules individuelles et ii) les cellules doivent posséder morphologies rondes avec petits-à-pas de processus qui s'étend des corps cellulaires.
- Transférer la chambre galvanotaxie sélectionné dans une hotte à flux laminaire, avec un pas de carré séparé. 1 lamelle de verre et de graisse à vide.
- Laver le capot coulissant première à l'éthanol 70%, puis avec de l'eau en autoclave, et à appliquer une bande de graisse à vide sur deux bords parallèles de la lamelle.
- Aspirer les milieux de culture à partir de la goulotte centrale de la chambre, puis de placer rapidement la lamelle (graisse du côté orienté vers le bas) sur la chambre de telle sorte que le reste des bandes de graisse sur les deux bandes parallèles de verre rectangulaires, créant ainsi un toità la chambre.
- Pipeter 100 pi de frais EFH-GDF ou FBS-SFM dans le creux central par capillarité.
- Utiliser la graisse à vide pour créer des bordures pour les piscines de milieux de culture sur chaque extrémité de la goulotte centrale, comme représenté sur la figure 2.
- Coupez deux 15 pièces cm de tuyau en PVC, et d'utiliser une seringue de 10 cc avec une aiguille de calibre 18 pour injecter la solution d'agarose soigneusement dans le tube, veiller à ce qu'aucune des bulles se forment dans les tubes, et laisser solidifier le gel pendant 5 min.
- Transférer la chambre galvanotaxie pour le système d'imagerie de cellules vivantes, ainsi que le gel d'agarose à tubes, Ag / AgCl, et une paire de boîtes de Petri vides 60 mm qui sera utilisé comme milieu de culture et des réservoirs contient de l'Ag / AgCl. Permettre à la chambre galvanotaxie à reposer à l'intérieur de la 37 ° C, 5% CO 2 environnement de 20-30 min.
- Pendant ce temps, préparez les couvercles des boîtes de Pétri vides 2 et le couvercle de la boîte de Petri de la chambre galvanotaxie par des trous de forageen y dermiques ou un outil similaire à celui représenté sur la figure 3.
- Pipette 1-1,5 ml d'EFH-GDF ou FBS-SFM sur chaque côté de la cuvette centrale, et 7-8 ml de la GDF dans chaque boîte de Pétri vide. Placez une boîte de Pétri de chaque côté de la cuvette centrale de la chambre galvanotaxie et placez un Ag / AgCl dans chaque boîte. Combler l'écart entre la chambre galvanotaxie et les boîtes de Pétri à établir une continuité électrique avec les ponts gel d'agarose, comme le montre la figure 4.
- Connecter les électrodes Ag / AgCl à une alimentation externe, avec un ampèremètre en série pour mesurer le courant électrique, et allumez l'alimentation. Utiliser un voltmètre pour mesurer la force du champ électrique directement à travers la cuvette centrale, et ajuster le débit de l'alimentation en énergie jusqu'à ce que l'intensité du champ électrique souhaité est atteint (les dosages effectués dans ce laboratoire utiliser une résistance DCEF de 250 mV / mm courant électrique entre 1 et 1,5 mA).
- Initiativete du module time-lapse sur le système d'imagerie de cellules vivantes, et de permettre l'expérience de courir pour la durée souhaitée. Après l'achèvement de l'essai, fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pour une analyse immunohistochimique standard.
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Representative Results
L'analyse cinématique révèle que, en présence d'une mesure de 250 mV / mm dCEF, les PNJ indifférenciées présentent galvanotaxie très rapide et dirigés vers la cathode (figure 5A, Film 1). En l'absence d'un dCEF, le mouvement aléatoire des cellules est observée (figure 5B, Film 2). A ce champ,> 98% des PNJ indifférenciées migrer pour la de 6-8 heures pour lesquelles ils sont imagés, et depuis les cellules mortes ne migrent pas ce qui suggère qu'ils restent viables pendant cette période en l'absence ou la présence d'un dCEF.
Phénotypes différenciés subir une migration négligeable à la fois en présence et en l'absence d'un DCEF (Films 3, 4). Sous-ensembles de cellules différenciées étendre les processus qui tendent à aligner perpendiculairement à la direction de la DCEF, mais pas de translocation cellule sensible corps est observée.
Immunomarquage vérifie que les PNJ maintenir une bonne expression de la nestine marqueur précurseur neuronal après 6 heures d'exposition dCEF (figure 6A). Dans les essais impliquant des PNJ induites à se différencier en phénotypes matures, la majorité des cellules expriment le marqueur des astrocytes matures protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) après 6 heures d'exposition dCEF (figure 6B).
Les anticorps primaires utilisés dans ces analyses sont les suivants: monoclonal de souris anti-nestine (1:400, Millipore, Canada), et polyclonal de lapin anti-GFAP (1:500, Sigma, Canada). Les anticorps secondaires utilisés dans ces analyses sont les suivants: chèvre anti-souris conjugué avec AlexaFluor 568 (1:400, Invitrogen-Gibco, Canada) et de chèvre anti-lapin conjugué à la AlexaFluor 488 (1:400, Invitrogen Gibco- , Canada).
Figure 1. Neurosphères adhérer au substrat Matrigel et dissomangé dans des cellules individuelles après 17 heures d'incubation à 37 ° C / 5% de CO 2, une humidité de 100% en EFH-GDF.
Figure 2. Illustration de la chambre galvanotaxie. Des bandes de graisse à vide sont utilisées pour créer une réserve de milieu de culture de chaque côté de la cuvette centrale.
Figure 3. Schéma des trous qui doivent être percés dans le couvercle de la chambre galvanotaxie et les réservoirs de milieu de culture. Les trous 7 mm de diamètre dans les deux couvercles sont utilisés pour insérer les tubes de gel d'agarose. Les trous 4 mm de diamètre dans le couvercle de la chambre de galvanotaxie est utilisé pour mesurer le potentiel électrique directement à travers la cuvette centrale en utilisant un voltmètre. Le trou 4 mm de diamètre dans le couvercle de la re un milieu de cultureservoir est de permettre l'électrode Ag / AgCl à faire saillie à partir du couvercle de la boîte de raccordement à l'alimentation électrique.
Figure 4. Illustration d'ensemble de chambre de galvanotaxie pour imagerie time-lapse. La chambre est galvanotaxie la cuvette centrale de Pétri, dans lequel les cellules sont étalées. Les médias à l'intérieur du boîtier de Petri cuvette centrale de la chambre galvanotaxie est soit GDF + EFH ou GDF + 1% de FBS. Les boîtes de Pétri de chaque côté de la chambre de galvanotaxie sont remplis de gestion durable des forêts, et contiennent également des électrodes Ag / AgCl. Ces électrodes sont reliées à une alimentation électrique externe, et de combler les trois boîtes de Petri avec gel d'agarose ponts formant un circuit fermé.
Figure 5. Dans la présentationCE d'un PNJ DCEF indifférenciées subissent une migration rapide galvanotactic vers la cathode (A), alors qu'en l'absence d'un DCEF les cellules subissent aléatoire migration radiale (B).
Figure 6. Immunocoloration vérifie que les PNJ restent nestine-positives précurseurs indifférenciés après 6 heures d'exposition dCEF (A), et que les PNJ induites à différencier la plupart expriment le marqueur GFAP maturité astrocytes après 6 heures d'exposition dCEF (B).
Film 1. Time-lapse vidéo de PNJ indifférenciées exposés à un dCEF. PNJ étalées sur des chambres galvanotaxie pendant 17 heures dans du SFM + EFH, puis exposé à une mesure de 250 mV / mm migration exposition dCEF rapide et orienté vers la cathode. 1 seconde de vidéo = 15 minutes de temps réel. Cliquez ici pour voir movie.
Movie 2. Time-lapse vidéo de PNJ indifférenciées en l'absence d'un dCEF. PNJ étalées sur galvanotaxie chambres pendant 17 heures dans du SFM + EFH, puis imagées en l'absence d'un dCEF appliquée subissent une migration aléatoire. 1 seconde de vidéo = 15 minutes de temps réel. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 3. Time-lapse vidéo de PNJ différenciées exposées à un dCEF. PNJ étalées sur des chambres galvanotaxie de 69-72 heures dans la GDF + FBS, puis exposé à une mesure de 250 mV / mm migration exposition dCEF très peu dans toutes les directions. 1 seconde de vidéo = 15 minutes de temps réel. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 4. Time-lapse vidéo de PNJ différenciés en l'absence d'un dCEF. PNJ étalées sur galvanotaxie chambers de 69-72 heures dans la GDF + FBS, puis imagées en l'absence d'un dCEF appliquée présentent très peu de migration dans n'importe quelle direction, même à des PNJ différenciées qui sont exposés à un dCEF. 1 seconde de vidéo = 15 minutes de temps réel. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
Ce protocole a été adapté à partir des méthodes bien établies d'études antérieures 7-9. Galvanotactic chambres peuvent être construits en utilisant une variété de techniques différentes, y compris la construction d'un verre séparé bien pour le confinement de l'ensemencement des cellules, ou par ablation laser CO 2 pour la microfabrication de la cuvette centrale 10,11. Certaines techniques peuvent être plus laborieux ou coûteux que d'autres. Nous avons décrit un dosage simple et rentable pour la construction d'une chambre de PNJ galvanotaxie en utilisant des matériaux rencontrés dans la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Notre protocole comprend une chauffée, humidifié, CO 2 incubateur régulé qui entoure le système d'imagerie de cellules vivantes pour maintenir les cellules dans des conditions optimales pour continu à long terme d'image. L'absence d'un tel appareil est une limitation de certaines techniques déjà publiées 9,12.
Des travaux récents ont démontré par un autre groupe similaire galvanotactic comportement des cellules d'une lignée cellulaire hippocampique 13, en utilisant un protocole différent et plus d'une main-d'œuvre conception de la chambre galvanotaxie. Notre analyse est particulièrement élégant en ce qu'elle permet une analyse de la population de départ identique de cellules - cultures primaires de cellules indifférenciées des PNJ neurosphères dérivées - qui ont été exposés à des conditions distinctes permettant ainsi une comparaison des propriétés migratoires des deux cellules indifférenciées et différenciées, simplement en modifiant les facteurs utilisés pour compléter les milieux de culture au sein de la chambre de galvanotaxie.
Le test présenté dans ce protocole est un outil puissant pour suivi à long terme et l'analyse des galvanotaxie NPC, et éventuellement d'autres types de cellules qui subissent une migration galvanotactic 14,15. Comme pour tout protocole, des nuances dans la préparation et l'exécution de certaines étapes de ce protocole peut conduire à des résultats infructueux. Les lignes directrices et les suggestions suivantes devraient,SIST à la bonne exécution de ce protocole:
- Pour empêcher les cellules de subir électrique mort thermique de courant associé, les dimensions de la chambre galvanotaxie ont été calculés pour minimiser les effets de chauffage par effet Joule 16. La chaleur générée dans la chambre est proportionnelle au carré du courant circulant à travers elle, qui est elle-même proportionnelle à la surface de section transversale de la chambre de galvanotaxie. Il est conseillé de maintenir la surface de section transversale de la chambre en tant que 2,04 mm 2 (12 mm x 0,17 mm).
- Après 7 jours de culture neurosphères peuvent être recueillis, dissociée en cellules individuelles et réétalées en facteurs de croissance conditions (un processus appelé «passages») pour donner neurosphères secondaires. Nous obtenons nos meilleurs résultats en utilisant neurosphères qui ont subi moins de trois passages (maximum 21 jours de culture), avec un déclin visible dans les capacités migratoires lors de l'utilisation neurosphères qui ont été exposées plus number de fois. Ceci est cohérent avec nos travaux antérieurs démontrant que les cultures à long terme de modifier la cinétique cellulaire 17.
- Lors de la sélection d'une chambre contenant galvanotaxie PNJ pour l'observation, il est important de choisir une chambre dans laquelle les cellules de neurosphères dérivées sont dissociés et afin de permettre des analyses précises cinématiques. Si les neurosphères dissociées n'ont pas bien (les PNJ sont collées les unes aux autres et ne peuvent être délimitées), l'analyse du comportement des cellules individuelles migratoire deviendra quasi impossible. Les cultures doivent être accorder plus de temps à se dissocier avant l'observation. En outre, les cellules qui se trouvent à proximité les uns aux autres peuvent empêcher physiquement la migration des cellules voisines. Nos analyses ont montré que les cellules placées au moins un corps cellulaire en dehors de leur cellule voisine la plus proche migrent à des vitesses bien supérieures à celles des cellules qui sont regroupés près du centre de la neurosphère dissocié, avec toutefois dire l'égalitéctedness.
- Si il ya une abondance de processus s'étendant des PNJ, c'est un indicateur que les cellules ont commencé à se différencier et donc ils ne sont pas une représentation fidèle d'une population indifférenciée. Un avantage de la préparation des chambres galvanotaxie en trois exemplaires, c'est que les deux autres chambres qui ne sont pas sélectionnés pour l'imagerie en accéléré peut être fixé immédiatement après leur période de placage incubé (Etape 2,16), et pour vérifier l'immunocoloration maintenant la différenciation des cellules.
- Pour des résultats optimaux les milieux de culture doivent être fraîchement préparée et complétée chaque jour où il est requis.
- Les images à intervalles de temps et d'analyses ultérieures cinématiques sont très sensibles à la perturbation de l'échantillon. Le microscope d'imagerie des cellules vivantes doit être placé sur une table d'air pour minimiser les vibrations, et le système ne doit pas être perturbé au cours de l'expérimentation.
Notre laboratoire de routine images PNJ galvanotaxe pendant 6-8 heures, mais jusqu'à 15 h-analyses ont été effectuées. Au cours des périodes de 15 h, le dCEF travers de la chambre est passé de 250 mV / mm à 227 mV / mm (9,2% de baisse). Périodes plus longues d'imagerie inévitablement modifier le pH du milieu de la chambre, plus la modification du champ électrique. Ainsi, il est recommandé de remplacer les médias environ toutes les heures 6. Cependant, nous avons effectué 8-hr NPC tests galvanotaxie sans remplacement médias et n'ont pas observé de mort cellulaire sensible (les cellules mortes ne migrent pas) ou une baisse de la motilité cellulaire, les cellules conservent leur vitesse de migration à travers l'expérience. L'enquêteur peut également réduire la profondeur de la chambre pour augmenter la stabilité de la dCEF 10.
À la suite d'imagerie, une seule cellule d'analyse cinématique de suivi est effectué sur un sous-ensemble des cellules imagées à l'aide du module de suivi Zeiss AxioVision logiciel. Les cellules sont sélectionnées pour l'analyse si elles sont localisées près du bord dela neurosphères dissociées et au moins une cellule du corps en dehors de sa cellule la plus proche. La raison derrière cela est de minimiser la probabilité de cellules qui se chevauchent les uns les autres pendant le suivi, ce qui rendrait le suivi des cellules individuelles quasiment impossible. Nous analysons les quatre paramètres suivants de la migration:
- X-axe de déplacement - la distance d'une cellule migre dans la direction de l'axe, qui est parallèle à la direction de la DCEF.
- Velocity - la distance en ligne droite entre les positions initiales et finales de cellules divisé par le temps écoulé.
- Directedness - x-axe de déplacement divisée par la distance en ligne droite entre les positions initiale et finale de cellules.
- Tortuosité - la distance totale du trajet parcouru par la cellule divisée par la distance en ligne droite entre les positions initiale et finale de cellules.
Les deux derniers paramètres sont des indicateurs de façon rectiligne de la voie de migration est dans une direction particulière.
18. Des médias appropriés substrat et de la culture devrait être sélectionné pour d'autres types cellulaires, et la durée de l'ensemencement des cellules avant l'imagerie doit être ajustée si nécessaire. Notamment, les dimensions de la chambre peut être nécessaire de modifier en fonction de l'épaisseur du tissu en cours d'examen (par exemple, si une tranche de tissu est placée dans la chambre). L'enquêteur doit garder à l'esprit that pour un champ électrique série, le flux de courant à travers la chambre est directement proportionnelle à la surface de section transversale de la chambre, et donc d'importants élargissements aux dimensions de la chambre est susceptible d'entraîner la mort des cellules a augmenté de chauffage par effet Joule lié.
Les techniques décrites dans le présent rapport constituent un outil puissant pour étudier le rôle important, mais n'est pas largement étudié, le phénomène de galvanotaxie. La capacité des cellules à répondre à dcEFs a des implications directes thérapeutiques. La stimulation électrique (stimulation cérébrale profonde) a déjà révélé utile dans le traitement de la maladie de Parkinson, et a été montré pour promouvoir la neurogenèse hippocampique dans un modèle de souris 19,20. Une compréhension complète des mécanismes cellulaires responsables de la transduction dCEF dans la motilité cellulaire peut éventuellement conduire à l'utilisation de la stimulation électrique comme un moyen clinique pour améliorer et diriger la migration des précurseurs endogènes aux sites de lésion ou diseasoi pour faciliter le processus de réparation. Les méthodes décrites ci-dessus constituent un moyen simple et robuste d'enquêter sur ces processus.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est financé en sciences naturelles et en génie du Canada (subvention no 249669, 482986 et #) et la Fondation des maladies du Canada (subvention no 485508). Les auteurs tiennent à remercier Youssef El-Hayek et le Dr Qi Wan pour leur aide dans l'élaboration des protocoles expérimentaux.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Neural Precursor Cell Isolation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 2M NaCl | Sigma | S5886 | 11.688 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M KCl | Sigma | P5405 | 7.456 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M MgCl2 | Sigma | M2393 | 20.33 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 155 mM NaHCO3 | Sigma | S5761 | 1.302 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 0.5M Glucose | Sigma | G6152 | 9.01 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 108 mM CaCl2 | Sigma | C7902 | 1.59 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bovine pancreas trypsin | Sigma | T1005 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Sheep testes hyaluronidase | Sigma | H6254 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Worthington | LS003086 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| DMEM | Invitrogen | 12100046 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| F12 | Invitrogen | 21700075 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 30% Glucose | Sigma | G6152 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 7.5% NaHCO3 | Sigma | S5761 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 1M HEPES | Sigma | H3375 | 23.83 g dissolved in 100 ml dH2O | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| EGF | Invitrogen | PMG8041 | Reconstitute in 1 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FGF | Invitrogen | PHG0226 | Reconstitute in 0.5 ml of hormone mix and aliquot into 20 μl units. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heparin | Sigma | H3149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Apo-transferrin | R&D Systems | 3188-AT | 0.1 g dissolved into 4 ml dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Putrescine | Sigma | P7505 | Dissolve 9.61 mg into Apo-transferrin solution | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Insulin | Sigma | I5500 | Dissolve 25 mg into 0.5 ml of 0.1N HCl and add to 3.5 ml of dH20 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Selenium | Sigma | S9133 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Progesterone | Sigma | P6149 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Standard Dissection Tools | Fine Science Tools | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dissection microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Galvanotaxis Chamber Preparation | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Square glass cover slides | VWR | 16004 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 6N Hydrochloric Acid | VWR | BDH3204-1 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 60 mm Petri dishes | Fisher Scientific | 0875713A | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Poly-L-lysine | Sigma | P4707 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | Thaw and aliquot into 150 μl units | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| FBS | Invitrogen | 10082139 | Only use if inducing NPC differentiation, otherwise use SFM + EFH culture media as indicated above | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Counting microscope | Olympus | CKX41 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Live Cell Time-Lapse Imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Silver wire | Alfa Aesar | 11434 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Heat Inactivated FBS | Sigma | 16140071 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| PVC tubing | Fisher Scientific | 80000006 | 3/32"ID x 5/32"OD | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Bleach | Clorox | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 10 cc syringe | BD | 309604 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 18 gauge needle | BD | 305195 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Dremel drill | Dremel | Model 750 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Inverted microscope equipped with humidified, incubated chamber | Zeiss | Axiovert-200M | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Recipes
Artificial cerebrospinal fluid
Trypsin Solution
Trypsin Inhibitor Solution
Hormone Mix (100 ml total, store at -20 °C)
Serum Free Media EFH-SFM: add 10 μl of EGF, 10 μl of FGF, and 3.66 μl of Heparin FBS-SFM: add 0.5 ml FBS
Matrigel Solution Matrigel aliquot should be placed in a box of ice and allowed to thaw slowly over 4-5 hours to form a viscous liquid before mixing with SFM. This will ensure the formation of a smooth layer of Matrigel substrate. If not thawed slowly, the resulting substrate will contain clumps of Matrigel, possibly hindering cell migration.
Matrigel Solution Mix 8 ml of SFM with 2 ml heat inactivated FBS in a 15 cc falcon tube. Mix agarose with 10 ml ddH20 in an Erlenmeyer flask, and heat in a microwave for 30 sec in 10-sec intervals, ensuring to remove the solution from the microwave after each 10-sec interval and thoroughly mix. Following the final 10-sec microwave period, mix the agarose solution with the SFM/FBS solution and store in a 57 °C water bath. |
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References
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